应激诱导的磷酸化蛋白1在制备筛查肝细胞癌产品中的应用

摘要

本发明公开了应激诱导的磷酸化蛋白1在制备筛查肝细胞癌产品中的应用。本发明所提供的应用包括：检测应激诱导的磷酸化蛋白1含量的物质和/或检测甲胎蛋白含量的物质在制备筛查或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用；以应激诱导的磷酸化蛋白1作为肝细胞癌肿瘤标志物的筛查或辅助诊断肝细胞癌方法中所用的物质和/或以甲胎蛋白作为肝细胞癌肿瘤标志物的筛查或辅助诊断肝细胞癌方法中所用的物质在制备筛查或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用。结果表明，血清中STIP1蛋白的含量可用作诊断肝细胞癌患者的潜在标志物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域中应激诱导的磷酸化蛋白1在制备筛查肝细胞癌产品中 的应用。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内的恶性肿瘤之一，有 较高的发病率和死亡率，每年约650000人死于HCC，且其发病率有增高的趋势。该 病多发于东南亚和非洲，其中约有50％以上发生于中国，位居我国癌症死亡率的第二 位。肝细胞癌的发生情况是一个多因素，多阶段，复杂的过程，乙型肝炎病毒(hepatitis  B virus，HBV)慢性感染是重要的高危因素。肿瘤抑制、肝脏切除和移植是现阶段肝 癌的主要治疗方法，但约60％以上的患者会术后复发。因此，在高危人群特别是肝硬 化(liver cirrhosis，LC)患者中筛查早期肝癌患者，及时采取治疗措施，可提高继 发于乙型肝炎病毒感染的肝细胞癌患者的生存率。

但HCC早期诊断较难，病情进展快，预后水平低。目前肝炎、肝硬化等HCC高危 人群的筛查和HCC临床诊断与病情监测等仍主要依赖于B超等影像学检查联合血清标 志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平的检测。而AFP作为目前HCC诊断和 病情监测一个最主要的生物标志物，其灵敏度和特异度仍不理想。Des-gamma  carboxy-prothrombin(DCP)和lectin-bound AFP(AFP-L3)也被认为是很有潜力的 HCC诊断标志物，有研究结果表明，AFP对于HCC早期诊断的效果要优于DCP和AFP-L3 (Marrero,J.A.et al.Alpha-fetoprotein,des-gamma carboxyprothrombin,and  lectin-bound alpha-fetoprotein in early hepatocellular carcinoma. Gastroenterology.2009)。

所以，寻找敏感的肝细胞癌生物标记物，对于早期发现和诊断肝细胞癌非常重要。 针对肝脏细胞癌发生过程中具有标志性变化的血清蛋白建立一种检测方法，有助于肿 瘤的临床诊断。

应激诱导的磷酸化蛋白1(Stress-induced-phosphoprotein1,STIP1)起到辅 陪伴分子的作用，能够可逆地连接分子伴侣Hsp70和Hsp90。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何筛查或辅助诊断肝细胞癌。

为解决上述技术问题，本发明提供了下述用途：

Ⅰ、检测应激诱导的磷酸化蛋白1含量的物质在制备筛查或辅助诊断肝细胞癌产 品中的应用；

Ⅱ、检测应激诱导的磷酸化蛋白1含量的物质和检测甲胎蛋白含量的物质在制备 筛查或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用；

Ⅲ、以应激诱导的磷酸化蛋白1作为肝细胞癌肿瘤标志物的筛查或辅助诊断肝细 胞癌方法中所用的物质在制备筛查或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用；

Ⅳ、C和D在制备筛查或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用；所述C为以应激诱导 的磷酸化蛋白1作为肝细胞癌肿瘤标志物的筛查或辅助诊断肝细胞癌方法中所用的物 质；所述D为以甲胎蛋白作为肝细胞癌肿瘤标志物的筛查或辅助诊断肝细胞癌方法中 所用的物质；

Ⅴ、A1)-A4)中任一种制备应激诱导的磷酸化蛋白1抗体所需的生物材料在制 备筛查或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用：

A1)应激诱导的磷酸化蛋白1单克隆抗体的免疫原；

A2)所述应激诱导的磷酸化蛋白1多克隆抗体的免疫原；

A3)产生所述应激诱导的磷酸化蛋白1单克隆抗体的细胞系；

A4)产生所述应激诱导的磷酸化蛋白1多克隆抗体的细胞系；

Ⅵ、B1)-B16)中任一种制备应激诱导的磷酸化蛋白1所需的生物材料在制备筛 查或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用：

B1)编码应激诱导的磷酸化蛋白1的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述用途中，所述检测应激诱导的磷酸化蛋白1 (Stress-induced-phosphoprotein1，STIP1)含量的物质可包括检测应激诱导的磷 酸化蛋白1含量的试剂和/或仪器，如通过酶联免疫反应检测应激诱导的磷酸化蛋白1 含量所需的试剂和仪器。具体来说，检测应激诱导的磷酸化蛋白1含量的物质可包括 应激诱导的磷酸化蛋白1、应激诱导的磷酸化蛋白1抗体和进行酶联免疫吸附实验 (ELISA)所需要的其它试剂和仪器，当然，上述检测应激诱导的磷酸化蛋白1含量的 物质可只由应激诱导的磷酸化蛋白1和应激诱导的磷酸化蛋白1抗体组成，也可只由 应激诱导的磷酸化蛋白1组成，也可只由应激诱导的磷酸化蛋白1抗体组成。所述应 激诱导的磷酸化蛋白1、所述应激诱导的磷酸化蛋白1抗体和进行酶联免疫吸附实验 (ELISA)所需要的其它试剂均可独立包装。

上述用途中，所述应激诱导的磷酸化蛋白1抗体为应激诱导的磷酸化蛋白1单克 隆抗体和/或应激诱导的磷酸化蛋白1多克隆抗体。

上述用途中，所述应激诱导的磷酸化蛋白1可为标记物标记的应激诱导的磷酸化 蛋白1。

上述用途中，所述应激诱导的磷酸化蛋白1蛋白具体可为人应激诱导的磷酸化蛋 白1。

上述用途中，所述应激诱导的磷酸化蛋白1可为氨基酸序列是序列表中SEQ ID  No.1的蛋白质。

上述用途中，所述应激诱导的磷酸化蛋白1的C末端或N末端可融合有His、Flag、 GST、MBP、His-MBP、HA、eGFP、eCFP、eYFP、Myc、His-Myc、His-AviTag、Sumo、His-Sumo、 SNAP-Tag或Halo Tag标签。

上述用途中，所述应激诱导的磷酸化蛋白1抗体可为用生物素标记的应激诱导的 磷酸化蛋白1抗体。

上述用途中，所述应激诱导的磷酸化蛋白1抗体可识别氨基酸序列是序列表中SEQ  ID No.1的蛋白质。

上述用途中，所述应激诱导的磷酸化蛋白1抗体的C末端或N末端可融合有His、 Flag、GST、MBP、His-MBP、HA、eGFP、eCFP、eYFP、Myc、His-Myc、His-AviTag、Sumo、 His-Sumo、SNAP-Tag或Halo Tag标签。

上述用途中，所述检测应激诱导的磷酸化蛋白1含量的物质为所述应激诱导的磷 酸化蛋白1和/或所述应激诱导的磷酸化蛋白1抗体。

上述用途中，所述检测应激诱导的磷酸化蛋白1含量的物质为通过酶联免疫反应 检测所述应激诱导的磷酸化蛋白1含量所需的试剂和仪器。

上述用途中，所述检测应激诱导的磷酸化蛋白1含量具体可为检测人血清或血浆 中的应激诱导的磷酸化蛋白1浓度。

上述用途中，所述肝细胞癌可为有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢 性感染背景的肝细胞癌。

上述用途中，所述筛查或辅助诊断肝细胞癌产品可为用于筛查或辅助诊断肝细胞 癌的各种试剂或试剂盒。

在本发明中，所述筛查或辅助诊断肝细胞癌产品的筛查或诊断对象是肝硬化(LC) 患者或健康人。在本发明的一个实施例中，所述肝硬化(LC)患者具体为有HBV慢性 感染的肝硬化患者。

上述用途中，当以无HBV慢性感染背景的肝硬化患者为筛查对象时，如果筛查对 象血清中应激诱导的磷酸化蛋白1(STIP1)蛋白的含量大于22.86ng/mL，该筛查对 象为疑似肝细胞癌患者，如果筛查对象血清中应激诱导的磷酸化蛋白1(STIP1)蛋白 的含量小于或等于22.86ng/mL，该筛查对象候选为非肝细胞癌患者；当以有HBV慢 性感染背景的肝硬化患者作为筛查对象时，如果筛查对象血清中应激诱导的磷酸化蛋 白1(STIP1)蛋白的含量大于18.69ng/mL，该筛查对象为肝细胞癌患者，如果筛查 对象血清中应激诱导的磷酸化蛋白1(STIP1)蛋白的含量小于或等于18.69ng/mL， 该筛查对象非肝细胞癌患者。

上述用途中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述 核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述用途中，B1)所述核酸分子具体可为如下b1)或b2)或b3)所示的核酸分 子：

b1)编码应激诱导的磷酸化蛋白1的DNA分子或cDNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述应激诱导 的磷酸化蛋白1的cDNA分子或基因组DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述应激诱导的磷酸化 蛋白1的cDNA分子或基因组DNA分子。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本 发明的编码应激诱导的磷酸化蛋白1的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或 90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行 评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可 以用来评价相关序列之间的同一性。

上述用途中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并 洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2 次，每次15min。

上述用途中，B2)所述的含有编码应激诱导的磷酸化蛋白1的核酸分子的表达盒 (应激诱导的磷酸化蛋白1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达应激诱导的磷酸 化蛋白1的DNA，该DNA不但可包括启动应激诱导的磷酸化蛋白1基因转录的启动子， 还可包括终止应激诱导的磷酸化蛋白1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可 包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述应激诱导的磷酸化蛋白1基因表达盒的重组载 体。

上述用途中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述用途中，B5)-B8)所述的微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如大肠杆菌。

上述用途中，B9)-B12)所述的转基因植物细胞系和转基因动物细胞系不包括繁 殖材料。

上述用途中，所述检测甲胎蛋白含量的物质可包括检测甲胎蛋白(AFP)含量的试 剂和/或仪器，如通过酶联免疫反应检测甲胎蛋白含量所需的试剂和仪器。具体来说， 检测甲胎蛋白含量的物质可包括甲胎蛋白、甲胎蛋白抗体和进行酶联免疫吸附实验 (ELISA)所需要的其它试剂和仪器，当然，上述检测甲胎蛋白含量的物质可只由甲胎 蛋白和甲胎蛋白抗体组成，也可只由甲胎蛋白组成，也可只由甲胎蛋白抗体组成。所 述甲胎蛋白、所述甲胎蛋白抗体和进行酶联免疫吸附实验(ELISA)所需要的其它试剂 均可独立包装。

上述用途中，所述甲胎蛋白可为标记物标记的甲胎蛋白。

上述用途中，所述甲胎蛋白蛋白具体可为人甲胎蛋白。

上述用途中，所述甲胎蛋白可为氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2的蛋白质。

上述用途中，所述甲胎蛋白的C末端或N末端可融合有His、Flag、GST、MBP、 His-MBP、HA、eGFP、eCFP、eYFP、Myc、His-Myc、His-AviTag、Sumo、His-Sumo、SNAP-Tag 或Halo Tag标签。

上述用途中，所述甲胎蛋白抗体可为用生物素标记的甲胎蛋白抗体。

上述用途中，所述甲胎蛋白抗体的C末端或N末端可融合有His、Flag、GST、MBP、 His-MBP、HA、eGFP、eCFP、eYFP、Myc、His-Myc、His-AviTag、Sumo、His-Sumo、SNAP-Tag 或Halo Tag标签。

上述用途中，所述检测甲胎蛋白含量的物质为所述甲胎蛋白和/或所述甲胎蛋白抗 体。

上述用途中，所述检测甲胎蛋白含量的物质为通过酶联免疫反应检测所述甲胎蛋 白含量所需的试剂和仪器。

上述用途中，检测甲胎蛋白含量具体可为检测人血清或血浆中的甲胎蛋白浓度。

为解决上述技术问题，本发明还提供了筛查或辅助诊断肝细胞癌产品。

本发明所提供的筛查或辅助诊断肝细胞癌产品，由检测应激诱导的磷酸化蛋白1 含量的物质和检测甲胎蛋白含量的物质组成。

上述产品中，所述检测应激诱导的磷酸化蛋白1含量的物质和所述检测甲胎蛋白 含量的物质可独立包装。

上述产品中，所述检测应激诱导的磷酸化蛋白1 (Stress-induced-phosphoprotein1，STIP1)含量的物质可包括检测应激诱导的磷 酸化蛋白1含量的试剂和/或仪器，如通过酶联免疫反应检测应激诱导的磷酸化蛋白1 含量所需的试剂和仪器。具体来说，检测应激诱导的磷酸化蛋白1含量的物质可包括 应激诱导的磷酸化蛋白1、应激诱导的磷酸化蛋白1抗体和进行酶联免疫吸附实验 (ELISA)所需要的其它试剂和仪器，当然，上述检测应激诱导的磷酸化蛋白1含量的 物质可只由应激诱导的磷酸化蛋白1和应激诱导的磷酸化蛋白1抗体组成，也可只由 应激诱导的磷酸化蛋白1组成，也可只由应激诱导的磷酸化蛋白1抗体组成。所述应 激诱导的磷酸化蛋白1、所述应激诱导的磷酸化蛋白1抗体和进行酶联免疫吸附实验 (ELISA)所需要的其它试剂均可独立包装。

上述产品中，所述应激诱导的磷酸化蛋白1可为标记物标记的应激诱导的磷酸化 蛋白1。

上述产品中，所述应激诱导的磷酸化蛋白1具体可为人应激诱导的磷酸化蛋白1。

上述产品中，所述应激诱导的磷酸化蛋白1可为氨基酸序列是序列表中SEQ ID  No.1的蛋白质。

上述产品中，所述应激诱导的磷酸化蛋白1的C末端或N末端可融合有His、Flag、 GST、MBP、His-MBP、HA、eGFP、eCFP、eYFP、Myc、His-Myc、His-AviTag、Sumo、His-Sumo、 SNAP-Tag或Halo Tag标签。

上述产品中，所述应激诱导的磷酸化蛋白1抗体可为用生物素标记的应激诱导的 磷酸化蛋白1抗体。

上述产品中，所述应激诱导的磷酸化蛋白1抗体的C末端或N末端可融合有His、 Flag、GST、MBP、His-MBP、HA、eGFP、eCFP、eYFP、Myc、His-Myc、His-AviTag、Sumo、 His-Sumo、SNAP-Tag或Halo Tag标签。

上述产品中，所述检测应激诱导的磷酸化蛋白1含量的物质为所述应激诱导的磷 酸化蛋白1和/或所述应激诱导的磷酸化蛋白1抗体。

上述产品中，所述检测应激诱导的磷酸化蛋白1含量的物质为通过酶联免疫反应 检测所述应激诱导的磷酸化蛋白1含量所需的试剂和仪器。

上述产品中，所述检测应激诱导的磷酸化蛋白1含量具体可为检测人血清或血浆 中的应激诱导的磷酸化蛋白1浓度。

上述产品中，所述肝细胞癌可为有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢 性感染背景的肝细胞癌。

上述产品中，所述筛查或辅助诊断肝细胞癌产品可为用于筛查或辅助诊断肝细胞 癌的各种试剂或试剂盒。

上述产品中，所述筛查或辅助诊断肝细胞癌产品的筛查或诊断对象是肝硬化(LC) 患者或健康人。在本发明的一个实施例中，所述肝硬化(LC)患者具体为有HBV慢性 感染的肝硬化患者。

上述产品中，当以无HBV慢性感染背景的肝硬化患者为筛查对象时，如果筛查对 象血清中应激诱导的磷酸化蛋白1(STIP1)蛋白的含量大于22.86ng/mL，该筛查对 象为疑似肝细胞癌患者，如果筛查对象血清中应激诱导的磷酸化蛋白1(STIP1)蛋白 的含量小于或等于22.86ng/mL，该筛查对象候选为非肝细胞癌患者；当以有HBV慢 性感染背景的肝硬化患者作为筛查对象时，如果筛查对象血清中应激诱导的磷酸化蛋 白1(STIP1)蛋白的含量大于18.69ng/mL，该筛查对象为肝细胞癌患者，如果筛查 对象血清中应激诱导的磷酸化蛋白1(STIP1)蛋白的含量小于或等于18.69ng/mL， 该筛查对象非肝细胞癌患者。

上述产品中，所述检测甲胎蛋白含量的物质可包括检测甲胎蛋白含量的试剂和/ 或仪器，如通过酶联免疫反应检测甲胎蛋白含量所需的试剂和仪器。具体来说，检测 甲胎蛋白含量的物质可包括甲胎蛋白、甲胎蛋白抗体和进行酶联免疫吸附实验(ELISA) 所需要的其它试剂和仪器，当然，上述检测甲胎蛋白含量的物质可只由甲胎蛋白和甲 胎蛋白抗体组成，也可只由甲胎蛋白组成，也可只由甲胎蛋白抗体组成。所述甲胎蛋 白、所述甲胎蛋白抗体和进行酶联免疫吸附实验(ELISA)所需要的其它试剂均可独立 包装。

上述产品中，所述甲胎蛋白可为标记物标记的甲胎蛋白。

上述产品中，所述甲胎蛋白蛋白具体可为人甲胎蛋白。

上述产品中，所述甲胎蛋白可为氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2的蛋白质。

上述产品中，所述甲胎蛋白的C末端或N末端可融合有His、Flag、GST、MBP、 His-MBP、HA、eGFP、eCFP、eYFP、Myc、His-Myc、His-AviTag、Sumo、His-Sumo、SNAP-Tag 或Halo Tag标签。

上述产品中，所述甲胎蛋白抗体可为用生物素标记的甲胎蛋白抗体。

上述产品中，所述甲胎蛋白抗体的C末端或N末端可融合有His、Flag、GST、MBP、 His-MBP、HA、eGFP、eCFP、eYFP、Myc、His-Myc、His-AviTag、Sumo、His-Sumo、SNAP-Tag 或Halo Tag标签。

上述产品中，所述检测甲胎蛋白含量的物质为所述甲胎蛋白和/或所述甲胎蛋白抗 体。

上述产品中，所述检测甲胎蛋白含量的物质为通过酶联免疫反应检测所述甲胎蛋 白含量所需的试剂和仪器。

上述产品中，所述检测甲胎蛋白含量具体可为检测人血清或血浆中的甲胎蛋白浓 度。

为解决上述技术问题，本发明还提供了筛查或辅助诊断肝细胞癌的试剂盒。

本发明所提供的筛查或辅助诊断肝细胞癌的试剂盒，由检测应激诱导的磷酸化蛋 白1含量的物质、检测甲胎蛋白含量的物质和说明书组成；所述说明书记载有以下A 和/或B：

A、当以未发现患有肝细胞癌、且无HBV感染史的人为检测对象时，如果所述检 测对象的血清中应激诱导的磷酸化蛋白1的含量大于22.86ng/mL，该检测对象为疑 似肝细胞癌患者，如果所述检测对象的血清中应激诱导的磷酸化蛋白1的含量小于或 等于22.86ng/mL，该检测对象候选为非肝细胞癌患者；

B、当以有HBV慢性感染背景的肝硬化患者作为检测对象时，如果所述检测对象 的血清中应激诱导的磷酸化蛋白1的含量大于18.69ng/mL，该检测对象疑似为肝细 胞癌患者，如果所述检测对象的血清中应激诱导的磷酸化蛋白1的含量小于或等于 18.69ng/mL，该检测对象候选为非肝细胞癌患者。

实验证明，在制备筛查肝细胞癌产品中的应用中，与用甲胎蛋白作为标志物相比， 用本申请的应激诱导的磷酸化蛋白1作为标志物时，灵敏度增加。

以有HBV慢性感染背景的肝硬化患者为对照，对有HBV慢性感染背景的肝细胞 癌患者血清中AFP蛋白含量和STIP1蛋白含量分别进行ROC曲线分析，STIP1蛋白的 曲线下面积与灵敏度均高于AFP：AFP蛋白含量的曲线下面积AUC＝0.61，灵敏度为 45.5％，STIP1蛋白的曲线下面积AUC＝0.77，灵敏度为81.8％。

以有HBV慢性感染背景的肝硬化患者为对照，对有HBV慢性感染背景的肝细胞 癌患者血清中AFP蛋白含量和STIP1蛋白含量进行ROC曲线的联合分析，得到的曲线 下面积高于AFP蛋白和STIP1蛋白的曲线下面积，灵敏度高于AFP蛋白的灵敏度：联 合分析的曲线下面积AUC＝0.85，灵敏度为76.4％。

实验结果表明，血清中STIP1蛋白的含量可用作诊断肝细胞癌患者的潜在标志物。

附图说明

图1为23例健康的正常人、61例有HBV慢性感染背景的肝硬化患者和59例有 HBV慢性感染背景的肝细胞癌患者血清样本中的STIP1蛋白含量。

图2为以健康的正常人血清中STIP1蛋白含量为对照对有HBV慢性感染背景的肝 细胞癌患者血清中STIP1蛋白含量进行ROC曲线分析结果和以有HBV慢性感染背景的 肝硬化患者血清中STIP1蛋白含量为对照对有HBV慢性感染背景的肝细胞癌患者血 清中STIP1蛋白含量进行ROC曲线分析结果。其中，A为以健康的正常人血清中STIP1 蛋白含量为对照对有HBV慢性感染背景的肝细胞癌患者血清中STIP1蛋白含量进行 ROC曲线分析结果，B为以有HBV慢性感染背景的肝硬化患者血清中STIP1蛋白含量 为对照对有HBV慢性感染背景的肝细胞癌患者血清中STIP1蛋白含量进行ROC曲线分 析结果。

图3为以有HBV慢性感染背景的肝硬化患者血清中AFP蛋白含量为对照对有HBV 慢性感染背景的肝细胞癌患者血清中STIP1蛋白含量和AFP蛋白含量进行ROC曲线分 析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的名词解释：

约登指数(Youden Index)也叫正确诊断指数，其取值范围在(0-1)之间， 越接近于1代表诊断准确性越好，本申请中将诊断标准定在正确诊断指数最大处。

受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)反映了灵敏度 与特异度间的平衡，ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标，ROC曲线下面积越 大，试验的诊断价值越大。

灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵 敏度越大越好，理想灵敏度为100％。

特异度(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特 异度越大越好，理想特异度为100％。

下述实施例中的患者及健康对照的血清均来自于全血，使用前-80℃冷冻保存。

实施例1、酶联免疫吸附检测人血清中应激诱导的磷酸化蛋白1(STIP1)和甲 胎蛋白(AFP)的含量

一、实验材料

23例健康的正常人血清(N)来自健康志愿者；61例有HBV慢性感染背景的肝 硬化患者(未转化为肝细胞癌)血清(LC)和59例有HBV慢性感染背景的肝细胞 癌患者血清(HCC)均为临床确诊病人的血清样本，61例有HBV慢性感染背景的肝 硬化患者血清和59例有HBV慢性感染背景的肝细胞癌患者血清分别由解放军302 医院和北京肿瘤医院提供。其中，23例健康的正常人来自于常规健康体检人群且在 样本收集时未发现有任何肝细胞癌，并且无HBV感染史。

二、酶联免疫吸附检测人血清中应激诱导的磷酸化蛋白1(STIP1)的含量

采用如下检测STIP1含量的试剂筛查或辅助诊断肝细胞癌：由应激诱导的磷酸化 蛋白1标准品和应激诱导的磷酸化蛋白1抗体组成。其中，应激诱导的磷酸化蛋白1 标准品为人全长重组应激诱导的磷酸化蛋白1，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID  No.1，将应激诱导的磷酸化蛋白1编码基因的5’端连接上GST标签的编码基因，在 大肠杆菌中进行表达，得到重组应激诱导的磷酸化蛋白1，将重组应激诱导的磷酸化 蛋白1的GST标签去除，得到氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的应激诱导的磷酸化蛋 白1；应激诱导的磷酸化蛋白1抗体为Abnova公司的应激诱导的磷酸化蛋白1抗体 (STIP1抗体)，货号分别为H00010963-M35和H00010963-M33，将货号为 H00010963-M33的抗体命名为STIP1抗体1，将货号为H00010963-M35的抗体命名 为STIP1抗体2，STIP1抗体2有生物素标记。

实验方法如下：分别对23例健康的正常人血清(N)、61例有HBV慢性感染背 景的肝硬化患者血清(未转化为肝细胞癌，LC)和59例有HBV慢性感染背景的肝 细胞癌患者血清(HCC)样本中的STIP1蛋白含量进行酶联免疫吸附(Enzyme Linked  Immunosorbent Assay，ELISA)检测。具体操作方法如下：

将上述STIP1抗体1用包被液(pH＝9.6，0.05M的碳酸盐缓冲液)溶解，得到 浓度为5μg/mL的STIP1抗体1溶液。

用1％BSA水溶液稀释血清样本(稀释血清样本的体积比为血清样本：1％BSA水 溶液＝1:10)：23例健康的正常人血清、61例有HBV慢性感染背景的肝硬化患者血 清(LC)和59例有HBV慢性感染背景的肝细胞癌患者血清(HCC)，分别得到23个 健康人的稀释血清、61个肝硬化患者的稀释血清和59个肝细胞癌患者的稀释血清， 作为待测血清样本。

用1％BSA水溶液稀释应激诱导的磷酸化蛋白1标准品，得到以下浓度的STIP1 溶液：200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、 3.125ng/mL、0ng/mL。

具体检测步骤如下：

1、向酶标板的每孔中加入100μL浓度为5μg/mL的STIP1抗体1溶液，4℃ 过夜，得到STIP1抗体1包被的酶标板1；

2、用PBST洗3次，每次1min；

3、3％BSA水溶液封闭4个小时(30℃)；

4、用PBST洗3次，每次1min；

5、向封闭的酶标板的每孔中加入100μL上述稀释的待测血清样本或100μL 浓度分别为200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、 3.125ng/mL、0ng/mL的STIP1溶液(每孔一个健康人的稀释血清、或一个肝硬化 患者的稀释血清、或一个肝细胞癌患者的稀释血清、或一种浓度的STIP1溶液)， 于30℃下反应1h，反应期间用摇床轻摇，得到结合有抗原的酶标板1；

6、PBST洗3次；

7、向结合有抗原的酶标板1的每孔中加STIP1抗体2，用1％BSA水溶液进行 1:50稀释，30℃反应1h；

8、PBST洗3次；

9、加辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的链霉素(Thermo  Pierce公司，货号21130)，用1％BSA水溶液进行1:15000稀释，30℃反应1h；

10、PBST洗4次；

11、向链霉素反应后的酶标板的每孔中分别加入100μl TMB底物(Thermo  Pierce公司，货号34028)，室温反应10min，反应结束后，向酶标板的每孔中加 入50μl终止液(2M硫酸水溶液)，得到显色后的酶标板，在450nm下显色后的酶 标板的每孔中溶液的光密度吸收值(OD值)。

通过STIP1标准蛋白浓度和其对应的OD值绘制STIP1的标准曲线。通过各孔 血清样本所测得的OD值，利用GraphPad Prism6软件对STIP1的标准曲线进行拟 合，计算各血清样本中STIP1蛋白的含量，结果如表1所示。结果显示，23例健康 的正常人(N)(正常组)血清中STIP1蛋白的含量为9.84±9.04ng/mL，61例有HBV 慢性感染背景的肝硬化患者(未转化为肝细胞癌，LC)(LC患者组)血清中STIP1 蛋白的含量为为23.85±31.96ng/mL，59例有HBV慢性感染背景的肝细胞癌患者 (HCC)(HCC患者组)血清中STIP1蛋白的含量为为72.29±82.94ng/mL。对各组样 本中STIP1蛋白含量进行统计学分析(Mann-Whitney test)，发现正常组和HCC患者 组、LC患者组和HCC患者组血清STIP1蛋白含量均有显著性差异(如图1所示)。

三、电化学发光法(双抗夹心法)检测人血清中甲胎蛋白(AFP)的含量

甲胎蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2。使用Roche公司的Cobas E601 全自动分析免疫仪检测人血清中AFP蛋白的含量，所用AFP检测配套检验试剂和校 准品为Roche公司产品(货号04481798190)。

使用上述检测系统得到各血清样本(LC患者57例、HCC患者55例)中AFP蛋 白的含量，结果如表1所示。57例有HBV慢性感染背景的肝硬化患者(未转化为肝 细胞癌，LC)(LC患者组)血清中AFP蛋白的含量为78.9±185.9ng/mL；55例有HBV 慢性感染背景的肝细胞癌患者(HCC)(HCC患者组)血清中AFP蛋白的含量为20406.8 ±71942.0ng/mL。用Mann-Whitney test方法对各组样本中AFP蛋白含量进行统计学 分析，结果显示LC患者组和HCC患者组血清中AFP蛋白的含量有显著性差异。

表1、各样本血清中STIP1蛋白及AFP蛋白的含量(ng/mL)

编号 N-STIP1 LC-STIP1 HCC-STIP1 LC-AFP HCC-AFP 1 2.802144 18.65884 84.72412 13 5052 2 37.55229 26.50754 44.3895 22 220300 3 22.16077 16.0106 12.54909 10 2.65 4 20.08217 39.01115 262.2178 12 1.73 5 4.003763 3.409988 29.84177 81 8.84 6 22.86161 11.22064 15.18656 7 28.72 7 6.979999 154.9318 13.96155 4 1072 8 1.71727 7.079429 146.8947 65.6 1.84 9 10.36337 14.19419 24.92542 27.48 2757.3 10 6.414161 6.763714 56.69247 20 5.24 11 2.568231 13.62732 18.97142 — 19.18 12 3.526801 16.41571 97.72167 280.6 10.3 13 13.46956 11.73357 386.0687 5.12 3.13 14 6.50292 8.779568 190.4903 7.51 1.58 15 21.73328 8.576316 138.8295 20 0.993 16 1.921128 184.5145 42.5163 — 1567 17 6.963643 3.550831 25.92981 33.1 448.9 18 5.35559 32.66843 29.77812 30.35 — 19 4.144031 27.48861 9.80139 28.25 7.91 20 6.295749 31.37726 219.4331 30.02 5.71 21 5.935195 9.395046 18.70689 3.17 3890 22 5.870158 3.908103 12.63937 22.5 45.4 23 7.029288 3.230556 7.829891 4.34 17.23

24 — 0.745783 61.48129 2.28 33.82 25 — 5.109091 165.8416 — 92.9 26 — 11.4204 24.02498 78.1 1.01 27 — 0.142518 15.78842 20 11040 28 — 54.95571 119.9211 65.6 3.85 29 — 35.56973 34.00266 651 912.2 30 — 54.67151 59.63691 15 157800 31 — 15.14931 1.446215 387.7 28.77 32 — 23.71565 64.31804 12.5 2463 33 — 37.45913 36.03656 120 — 34 — 5.196878 37.3994 1062 205100 35 — 1.525915 19.03052 33.48 10090 36 — 2.231657 22.58174 2.16 8721 37 — 16.0475 49.59791 10.29 3.1 38 — 2.482223 1.366874 7.51 163.2 39 — 18.89313 147.6659 128 — 40 — 32.07441 24.19306 651 286.1 41 — 13.69134 32.39419 74 5.24 42 — 2.594621 80.37292 45 2.31 43 — 7.92545 26.64528 48 5473 44 — 12.50616 44.8751 52.96 59.64 45 — 34.20793 40.27139 5.31 430922 46 — 13.53033 43.47549 75.47 9.72 47 — 14.14611 25.02985 14.96 21472 48 — 19.10671 61.07771 3.35 14.9 49 — 60.01773 215.9038 18 10318 50 — 8.233671 33.13551 5 478.8 51 — 29.86041 37.29457 60 908.3 52 — 83.64326 3.20796 5 14812 53 — 1.875548 160.0175 21 1769 54 — 5.176461 344.2163 9 24.45 55 — 15.86944 23.41448 14 4.45

56 — 18.6108 150.9707 8 4089 57 — 4.902859 9.9476 5 — 58 — 33.29537 128.0084 — 19.98 59 — 21.19056 30.31871 39 3.24 60 — 35.6807 — 7 — 61 — 48.11627 — 16 —

注：N-STIP1表示健康的正常人血清中STIP1的含量，LC-STIP1表示有HBV慢 性感染背景的肝硬化患者血清中STIP1的含量，HCC-STIP1表示有HBV慢性感染背 景的肝细胞癌患者血清中STIP1的含量，LC-AFP表示有HBV慢性感染背景的肝硬化 患者血清中AFP的含量，HCC-AFP表示有HBV慢性感染背景的肝细胞癌患者血清中 AFP的含量，“—”表示无该样品的该项实验数据。

以健康的正常人血清中STIP1蛋白含量为对照，对有HBV慢性感染背景的肝细 胞癌患者血清中AFP蛋白含量用SPSS16.0软件进行ROC曲线分析，曲线下面积 AUC＝0.89(如图2中A所示)。此时，判定为HCC患者的阈值为STIP1蛋白含量>22.86 ng/mL，灵敏度为74.6％，特异度为95.6％，约登指数为0.7。详见表2(将诊断标准定 在正确诊断指数最大处，表中粗体部分)。具体的，当以未发现患有肝细胞癌、且无 HBV感染史的人为检测对象时，根据上述结果，得到检测结果判定标准如下：如果所 述检测对象的血清中应激诱导的磷酸化蛋白1的含量大于22.86ng/mL，该检测对象 为疑似肝细胞癌患者，如果所述检测对象的血清中应激诱导的磷酸化蛋白1的含量小 于或等于22.86ng/mL，该检测对象候选为非肝细胞癌患者。

表2、以正常组为对照组的阈值(ng/mL)、灵敏度、特异度及约登指数

阈值 灵敏度 1-特异度 特异度 约登指数 1.37 1 1 0 0 1.45 0.9661 1 0 -0.0339 2.8 0.9661 0.8261 0.1739 0.14 3.21 0.9492 0.8261 0.1739 0.1231 7.03 0.9492 0.3043 0.6957 0.6449 9.95 0.8983 0.3043 0.6957 0.594 10.36 0.8983 0.2609 0.7391 0.6374 12.64 0.8644 0.2609 0.7391 0.6035

13.47 0.8644 0.2174 0.7826 0.647 19.03 0.7627 0.2174 0.7826 0.5453 22.16 0.7627 0.087 0.913 0.6757 22.58 0.7458 0.087 0.913 0.6588 22.86 0.7458 0.0435 0.9565 0.7023 37.4 0.4746 0.0435 0.9565 0.4311 37.55 0.4746 0 1 0.4746 386.07 0 0 1 0

用SPSS16.0软件以61例LC患者血清为对照组、59例HCC患者为疾病组，对血 清中STIP1蛋白水平进行ROC曲线分析，曲线下面积AUC＝0.76(如图2中B所示)。 此时，判定为HCC患者的阈值为STIP1蛋白含量>18.69ng/mL，灵敏度为81.4％、特 异度为62.3％，约登指数为0.44。详见表3(将诊断标准定在正确诊断指数最大处， 表中粗体部分)。具体的，当以有HBV慢性感染背景的肝硬化患者作为检测对象时， 根据上述结果，得到检测结果判定标准如下：当以有HBV慢性感染背景的肝硬化患者 作为检测对象时，如果所述检测对象的血清中应激诱导的磷酸化蛋白1的含量大于 18.69ng/mL，该检测对象疑似为肝细胞癌患者，如果所述检测对象的血清中应激诱导 的磷酸化蛋白1的含量小于或等于18.69ng/mL，该检测对象候选为非肝细胞癌患者。

表3、以LC患者组为对照组的阈值(ng/mL)、灵敏度、特异度及约登指数

阈值 灵敏度 1-特异度 特异度 约登指数 -0.86 1 1 0 0 0.445 1 0.983607 0.016393 0.016393 1.06 1 0.967213 0.032787 0.032787 1.41 0.983051 0.967213 0.032787 0.015838 1.49 0.966102 0.967213 0.032787 -0.00111 1.705 0.966102 0.95082 0.04918 0.015282 2.055 0.966102 0.934426 0.065574 0.031675 2.355 0.966102 0.918033 0.081967 0.048069 2.535 0.966102 0.901639 0.098361 0.064462 2.9 0.966102 0.885246 0.114754 0.080856 3.22 0.949153 0.885246 0.114754 0.063907

3.32 0.949153 0.868852 0.131148 0.0803 3.48 0.949153 0.852459 0.147541 0.096694 3.73 0.949153 0.836066 0.163934 0.113087 4.405 0.949153 0.819672 0.180328 0.12948 5.005 0.949153 0.803279 0.196721 0.145874 5.145 0.949153 0.786885 0.213115 0.162267 5.19 0.949153 0.770492 0.229508 0.178661 5.98 0.949153 0.754098 0.245902 0.195054 6.92 0.949153 0.737705 0.262295 0.211448 7.455 0.949153 0.721311 0.278689 0.227841 7.88 0.932203 0.721311 0.278689 0.210892 8.08 0.932203 0.704918 0.295082 0.227285 8.405 0.932203 0.688525 0.311475 0.243679 8.68 0.932203 0.672131 0.327869 0.260072 9.09 0.932203 0.655738 0.344262 0.276466 9.6 0.932203 0.639344 0.360656 0.292859 9.875 0.915254 0.639344 0.360656 0.27591 10.585 0.898305 0.639344 0.360656 0.258961 11.32 0.898305 0.622951 0.377049 0.275354 11.575 0.898305 0.606557 0.393443 0.291748 12.12 0.898305 0.590164 0.409836 0.308141 12.53 0.898305 0.57377 0.42623 0.324535 12.595 0.881356 0.57377 0.42623 0.307585 13.085 0.864407 0.57377 0.42623 0.290636 13.58 0.864407 0.557377 0.442623 0.30703 13.66 0.864407 0.540984 0.459016 0.323423 13.825 0.864407 0.52459 0.47541 0.339817 14.055 0.847458 0.52459 0.47541 0.322867 14.17 0.847458 0.508197 0.491803 0.339261 14.67 0.847458 0.491803 0.508197 0.355654 15.17 0.847458 0.47541 0.52459 0.372048 15.49 0.830508 0.47541 0.52459 0.355099

15.83 0.813559 0.47541 0.52459 0.338149 15.94 0.813559 0.459016 0.540984 0.354543 16.03 0.813559 0.442623 0.557377 0.370936 16.235 0.813559 0.42623 0.57377 0.38733 17.515 0.813559 0.409836 0.590164 0.403723 18.635 0.813559 0.393443 0.606557 0.420117 18.685 0.813559 0.377049 0.62295 0.43651 18.8 0.79661 0.377049 0.622951 0.419561 18.93 0.79661 0.360656 0.639344 0.435954 19 0.779661 0.360656 0.639344 0.419005 19.07 0.762712 0.360656 0.639344 0.402056 20.15 0.762712 0.344262 0.655738 0.41845 21.885 0.762712 0.327869 0.672131 0.434843 22.995 0.745763 0.327869 0.672131 0.417894 23.565 0.728814 0.327869 0.672131 0.400945 23.87 0.728814 0.311475 0.688525 0.417338 24.105 0.711864 0.311475 0.688525 0.400389 24.56 0.694915 0.311475 0.688525 0.38344 24.98 0.677966 0.311475 0.688525 0.366491 25.48 0.661017 0.311475 0.688525 0.349542 26.22 0.644068 0.311475 0.688525 0.332592 26.58 0.644068 0.295082 0.704918 0.348986 27.07 0.627119 0.295082 0.704918 0.332037 28.635 0.627119 0.278689 0.721311 0.34843 29.81 0.610169 0.278689 0.721311 0.331481 29.85 0.59322 0.278689 0.721311 0.314532 30.09 0.59322 0.262295 0.737705 0.330925 30.85 0.576271 0.262295 0.737705 0.313976 31.725 0.576271 0.245902 0.754098 0.33037 32.23 0.576271 0.229508 0.770492 0.346763 32.53 0.559322 0.229508 0.770492 0.329814 32.905 0.559322 0.213115 0.786885 0.346207

33.22 0.542373 0.213115 0.786885 0.329258 33.65 0.542373 0.196721 0.803279 0.345652 34.105 0.525424 0.196721 0.803279 0.328702 34.89 0.525424 0.180328 0.819672 0.345096 35.625 0.525424 0.163934 0.836066 0.361489 35.86 0.525424 0.147541 0.852459 0.377883 36.665 0.508475 0.147541 0.852459 0.360934 37.345 0.491525 0.147541 0.852459 0.343984 37.43 0.474576 0.147541 0.852459 0.327035 38.235 0.474576 0.131148 0.868852 0.343429 39.64 0.474576 0.114754 0.885246 0.359822 41.395 0.457627 0.114754 0.885246 0.342873 43 0.440678 0.114754 0.885246 0.325924 43.935 0.423729 0.114754 0.885246 0.308975 44.635 0.40678 0.114754 0.885246 0.292026 46.5 0.389831 0.114754 0.885246 0.275076 48.86 0.389831 0.098361 0.901639 0.29147 52.135 0.372881 0.098361 0.901639 0.274521 54.815 0.372881 0.081967 0.918033 0.290914 55.825 0.372881 0.065574 0.934426 0.307308 58.165 0.355932 0.065574 0.934426 0.290358 59.83 0.338983 0.065574 0.934426 0.273409 60.55 0.338983 0.04918 0.95082 0.289803 61.28 0.322034 0.04918 0.95082 0.272854 62.9 0.305085 0.04918 0.95082 0.255904 72.345 0.288136 0.04918 0.95082 0.238955 82.005 0.271186 0.04918 0.95082 0.222006 84.18 0.271186 0.032787 0.967213 0.2384 91.22 0.254237 0.032787 0.967213 0.22145 108.82 0.237288 0.032787 0.967213 0.204501 123.965 0.220339 0.032787 0.967213 0.187552 133.42 0.20339 0.032787 0.967213 0.170603

142.86 0.186441 0.032787 0.967213 0.153654 147.28 0.169492 0.032787 0.967213 0.136705 149.32 0.152542 0.032787 0.967213 0.119755 152.95 0.135593 0.032787 0.967213 0.102806 157.475 0.135593 0.016393 0.983607 0.1192 162.93 0.118644 0.016393 0.983607 0.102251 175.175 0.101695 0.016393 0.983607 0.085301 187.5 0.101695 0 1 0.101695 203.195 0.084746 0 1 0.084746 217.665 0.067797 0 1 0.067797 240.825 0.050847 0 1 0.050847 303.22 0.033898 0 1 0.033898 365.145 0.016949 0 1 0.016949 387.07 0 0 1 0

用SPSS16.0软件以同时具有STIP1和AFP蛋白含量的LC患者为对照组、以同 时具有STIP1和AFP蛋白含量的HCC患者为疾病组，对同时具有STIP1和AFP蛋白含 量的血清中AFP蛋白水平进行ROC曲线分析，曲线下面积AUC＝0.61(如图3所示)， 此时，判定为HCC患者的阈值为AFP蛋白含量>145.6ng/mL，灵敏度为45.5％、特异 度为91.2％(表4所示)。用SPSS16.0软件以同时具有STIP1和AFP蛋白含量的LC 患者为对照组、以同时具有STIP1和AFP蛋白含量的HCC患者为疾病组，对同时具有 STIP1和AFP蛋白含量的血清中STIP1蛋白水平分别进行ROC曲线分析，曲线下面积 AUC＝0.77(如图3所示)，灵敏度为81.8％、特异度为63.2％(表4所示)。结果表明， 以同时具有STIP1和AFP蛋白含量的LC患者为对照组、以同时具有STIP1和AFP蛋白 含量的HCC患者为疾病组，对同时具有STIP1和AFP蛋白含量的血清中AFP蛋白水平 STIP1蛋白水平分别进行ROC曲线分析，STIP1蛋白的曲线下面积与灵敏度均增加。

用SPSS16.0软件，以同时具有STIP1和AFP蛋白含量的LC患者为对照组、以 同时具有STIP1和AFP蛋白含量的HCC患者为疾病组，对同时具有STIP1和AFP蛋白 含量的血清中AFP蛋白水平STIP1蛋白水平进行ROC曲线的联合分析时(结果如图3 所示)，曲线下面积AUC＝0.85，灵敏度为76.4％、特异度为82.5％(表4所示)。结果 表明，联合分析得到的曲线下面积均高于AFP蛋白和STIP1蛋白的曲线下面积，灵敏 度高于AFP蛋白的灵敏度。

表4、STIP1蛋白和AFP蛋白判别诊断肝硬化和肝细胞癌效果比较

本申请的实验结果表明，血清中STIP1蛋白的含量可用作诊断肝细胞癌患者的 潜在标志物。