用于位点特异性uPAR靶向的177-Lu标记肽

摘要

提供了177-Lu标记肽，用于位点特异性靶向尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)，从而使得能够治疗与高uPAR表达相关的癌症疾病，例如治疗结肠直肠癌，通过向患者施用有效量的177-Lu标记的肽。

说明书

发明领域

本发明涉及用于位点特异性靶向尿激酶纤溶酶原激活物受体 (uPAR)的177-Lu标记肽。更具体而言本发明涉及对与高uPAR表 达相关的任何癌症疾病的治疗。特别是本发明针对但不限于通过向患 者施用有效量的177-Lu标记肽对前列腺、乳腺和结肠直肠癌的治疗。

发明背景

多种放射性标记肽组合物已被开发或正处于开发之中用于治疗性 放射性核素的位点特异性靶向。总原则涉及将所选放射性核素附着到 对特定器官或组织具有高特异性的肽从而使得所述器官或组织能被治 疗性放射性同位素治疗。这一研究领域已显示出特别适用于肿瘤显像 和治疗。特别理想的生物学位点包括但不限于神经内分泌肿瘤如腹部 肿瘤和小细胞肺癌、脑肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤和卵 巢肿瘤。

DOTA(1,4,7,10-四(羧甲基)-1,4,7,10四氮杂环十二烷)及其衍生 物构成用于生物医学应用的重要螯合剂类别，因为其非常稳定地容纳 多种二价和三价金属离子。一个新兴领域是在诊断和治疗性核肿瘤学 的不同领域中使用螯合剂缀合的生物活性肽用放射性金属进行标记。 NODAGA及其衍生物构成用于生物医学应用的另一类重要螯合剂。

¹⁷⁷Lu-标记肽用于核素靶向疗法被成功引入对神经内分泌肿瘤的 治疗，且目前正在临床前癌症模型中评价若干新靶，包括整联蛋白、 Her-2、胃泌素释放肽(GRP)和血管内皮生长因子(VEGF)。

uPAR PET显像已在几种人类癌症异种移植物模型中开发，使用 小的线性DOTA-缀合肽，DOTA-AE105，用⁶⁴Cu(Persson et al,2011) 和⁶⁸Ga(Persson等人,2012)作放射性标记。

恶性肿瘤能够降解周围的胞外基质，导致局部侵袭或转移。尿激 酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其细胞表面受体(uPAR)在体外和体 内都是细胞表面关联的纤溶酶原激活的中枢分子。在许多类型的人类 癌症中uPA和uPAR的高表达与恶性肿瘤生长相关且伴有差预后，可 能表明uPA/uPAR系统在癌症进展和转移中的因果作用。免疫组化和 原位杂交研究表明，来自uPA系统组分的表达水平通常在正常组织和 良性病变中非常低。还已报道uPA/uPAR系统通过充当玻连蛋白的粘 附受体和通过调节整联蛋白功能而涉及调节细胞-胞外基质相互作用。 基于这些特性，因此认为uPA/uPAR系统是引人注目的癌症治疗靶。

WO 01/25410描述了诊断或治疗性标记的uPAR靶向蛋白质和 肽。所述肽或蛋白质包含至少38个氨基酸残基，包括uPA的uPAR 结合位点的残基13-30。

US 6,277,818描述了可与诊断标记缀合的uPAR靶向环肽化合物。 所述肽基于uPA的氨基酸残基20-30。

US 6,514,710也涉及对uPAR具有亲和性的环肽。所述肽可携带 可检测标记。所述肽包含由连接单元相连的11个氨基酸。

Ploug等人在Biochemistry 2001,40,12457-12168描述了uPAR 靶向肽，但不是在显像情境中，其包括本文件中描述的氨基酸序列。 类似公开内容提供在US 7,026,282中。

DADACHOVA,E.("Cancer Therapy with Alpha-Emitters  Labeled Peptides",Seminars In Nuclear Medicine(2010),Vol.40, Issue 3,Pages 204-208)公开了213-Bi标记的uPAR结合肽缀合物， 其中肽通过DOTA与213-Bi偶联。所述肽用于治疗癌症。

GUHA,A.C.等人("Tumor Biology-Guided Radiotherapy  Treatment Planning:Gross Tumor Volume Versus Functional Tumor  Volume",Seminars In Nuclear Medicine(2008),Vol.38,Issue 2, Pages 105-113)公开了放射性金属如177-Lu用于标记抗体来用于放 射免疫疗法。该文件还描述了放射性金属可通过金属螯合剂与功能性 结合剂如uPAR结合肽缀合。

JIANG L.等人("Preliminary evaluation of(177)Lu-labeled  knottin peptides for integrin receptor-targeted radionuclide therapy", Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging(2011),Vol.38,Issue 4,pages 13-22) 公开了经改造以结合整联蛋白受体的半胱氨酸结肽，其经由放射性金 属螯合剂DOTA而用177-Lu作放射性标记，和使用这种肽对整联蛋 白阳性肿瘤进行放射疗法。

WO2007134274A2公开了通过使用与177-Lu缀合的结合uPAR 的配体来杀伤癌症干细胞的方法。

由于化学和生理学不确定性，在特定缀合系统中选择特定放射性 核素并非无关重要。例如用177-Lu替换213-Bi并非显而易见，因为 213-Bi是α粒子发射体并因此在临床上与β粒子发射体177-Lu关系疏 远。

对uPAR的有效靶向需要在化学上牢固和稳定的选择性高亲和载 体。

发明概述

本发明提供具有对uPAR的高亲和性、在细胞结合系统中的高效 力和经证实的生物学稳定性的177-Lu标记肽。更具体而言本发明涉及 对与高uPAR表达相关的癌症疾病的治疗。特别是本发明针对但不限 于通过向患者施用有效量的177-Lu标记肽对前列腺、乳腺和结肠直肠 癌的治疗。

在第一方面本发明涉及177-Lu标记的uPAR结合肽缀合物，其 中所述肽通过螯合剂与177-Lu偶联。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及177-Lu标记的肽缀合物， 其中所述肽通过螯合剂与177-Lu偶联，所述肽选自下组：

(D-Asp)-([β]-环己基-L-丙氨 酸)-(Phe)-(D-Ser)-(D-Arg)-(Tyr)-(Leu)-(Trp)-(Ser),

(Ser)-(Leu)-([β]-环己基-L-丙氨 酸)-(Phe)-(D-Ser)-(Gln)-(Tyr)(Leu)-(Trp)-(Ser),

(D-Glu)-([β]-环己基-L-丙氨 酸)-(Phe)-(D-Ser)-(D-Tyr)-(Tyr)-(Leu)-(Trp)-(Ser),

(Asp)-([β]-环己基-L-丙氨 酸)-(Phe)-(D-Ser)-(D-Arg)-(Tyr)-(Leu)-(Trp)-(Ser),

(Asp)-([β]-环己基-L-丙氨 酸)-(Phe)-(Ser)-(D-Arg)-(Tyr)-Leu)-(Trp)-(Ser),

(D-Asp)-([β]-环己基-L-丙氨 酸)-(Phe)-(Ser)-(D-Arg)-(Tyr)-Leu)-(Trp)-(Ser),

(D-Thr)-([β]-环己基-L-丙氨 酸)-(Phe)-(D-Ser)-(D-Arg)-(Tyr)-(Leu)-(Trp)-(Ser),

(D-Asp)-([β]-环己基-L-丙氨 酸)-(Phe)-(D-Ser)-(D-Arg)-(Tyr)-(Leu)-([β]-2-萘基-L-丙氨酸)-(Ser),

(Asp)-([β]-环己基-L-丙氨 酸)-(Phe)-(D-Ser)-(Arg)-(Tyr)-(Leu)-(Trp)-(Ser),

(Asp)-([β]-环己基-L-丙氨 酸)-(Phe)-(D-Ser)-(D-Arg)-(Tyr)-(Leu)([β]-1-萘基-L-丙氨酸)-(Ser),

(D-Glu)-([β]-环己基-L-丙氨 酸)-(Phe)-(D-Ser)-(Tyr)-(Tyr)-(Leu)-(Trp)-(Ser),

(Asp)-([β]-环己基-L-丙氨 酸)-(Phe)-(D-Ser)-(D-Arg)-(Leu)-(Leu)-(Trp)-(D-His),

(Asp)-([β]-环己基-L-丙氨酸)-(Phe)-(D-Ser)-(D-Arg)-([β]-环己基 -L-丙氨酸)-(Leu)-(Trp)-(lle),

(Asp)-([β]-环己基-L-丙氨 酸)-(Phe)-(D-Ser)-(D-Arg)-(Tyr)-(Leu)([β]-1-萘基-L-丙氨酸)-(D-His),

(Asp)-([β]-环己基-L-丙氨酸)-(Phe)-(D-Ser)-(D-Arg)-(N-(2,3-二甲 氧苄基)甘氨酸)-(D-Phe)-(N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸)-(N-(2-甲氧基乙基) 甘氨酸),

(Asp)-([β]-环己基-L-丙氨酸)-(Phe)-(D-Ser)-(D-Arg)-(N-(2,3-二甲 氧苄基)甘氨酸)-(D-Phe)-(N-苄基甘氨酸)-(N-(2[β]乙氧乙基)甘氨酸),

(Asp)-([β]-环己基-L-丙氨酸)-(Phe)-(D-Ser)-(D-Arg)-(N-(2,3-二甲 氧苄基)甘氨酸)-(D-Phe)-(N-(甲基萘亚甲基)甘氨酸)-(N-(2-甲氧基乙基) 甘氨酸),和

(Asp)-([β]-环己基-L-丙氨酸)-(Phe)-(D-Ser)-(D-Arg)-(N-(2,3-二甲 氧苄基)甘氨酸)-(D-Phe)-(N-(2,3-二甲氧苄基)甘氨酸)-(Ile)。

优选地所述螯合剂是DOTA、NOTA、NODAGA或CB-TE2A， 且优选地所述肽是(D-Asp)-([β]-环己基-L-丙氨 酸)-(Phe)-(D-Ser)-(D-Arg)-(Tyr)-(Leu)-(Trp)-(Ser)。

特别优选的是下式的177-Lu标记的肽缀合物：

在其它方面本发明涉及以上定义的177-Lu标记肽用作药物，上述 177-Lu标记肽用于制备治疗癌症特别是但不限于前列腺、乳腺和结肠 直肠癌的药物的用途，和包含本发明的177-Lu标记肽的药物组合物。 类似的治疗方法包括在本发明内。

本发明人惊奇地发现，本发明的177-Lu标记肽在体内稳定且能够 在肿瘤而非周围组织中诱导细胞毒性作用。因此，本发明的177-Lu 标记肽构成治疗小肿瘤病损和/或播散转移性疾病的最佳放射性核素。 在人结肠直肠癌模型中，本发明的177-Lu标记肽特异性靶向uPAR 阳性癌细胞，特别是最为侵袭性(转移性)的细胞。

而且，本发明的肽可用于用PET显像无创检测和定量uPAR的表 达水平。使用177-Lu标记肽，SPECT显像也是可能的。相应地，用 本发明的177-Lu标记肽进行系统性放射疗法可用作为对使用uPAR PET显像识别证实了高水平uPAR表达的癌症患者的新治疗。

附图简要说明

图1显示¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的化学结构和在HT-29移植瘤荷瘤 裸鼠的所选器官和原发肿瘤病损中的生物分布。

图2显示裸鼠中HT-29移植瘤的PET/CT和伽马平面显像，定量 肿瘤摄取数据用于比较。

图3显示在给予2x20MBq的¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105、对照肽 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut或载体对照的动物中的平均肿瘤体积和 uPAR表达水平。

图4显示使用¹⁸F-FLT PET作为对¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105治疗效力 的预测。

图5显示给予¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105、对照肽 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut或载体对照的动物中的毒性，通过在研究期间 追踪每只小鼠的重量和对肾脏使用H&E染色来评价。

图6显示来自¹⁸FLT-PET/CT研究的原始数据。

图7显示在切除的HT-29肿瘤中的uPAR免疫组化染色。

图8显示“uPAR治疗诊断(theranostic)对”的化学结构并例示 播散-转移性前列腺癌研究中的试验设置。

图9显示在播散-转移性前列腺癌研究中从研究第2-30天发生的 转移病损的代表性生物发光图像和总数的定量分析。

图10显示在播散-转移性前列腺癌研究中的无远处转移生存。

图11显示用于识别小转移病损的uPAR PET显像。

图12显示在播散-转移性前列腺癌研究期间监测每只小鼠的重 量。

发明详述

令人惊奇的是，本发明的具有未经修饰的羧基末端氨基酸的放射 性标记肽，当与经特异性修饰以除去在羧基末端氨基酸的羧酸的相应 放射性标记肽相比时，表现出改善的体内特性。特别是，本发明的放 射性标记肽表现出改善的血液和肝脏清除以及改善的生物学位点摄取 和保留时间。

选择用于本发明的放射性药物的肽通过将螯合剂与所述肽偶联而 作放射性标记。所述螯合剂能够使选择的放射性核素与其结合。使螯 合剂和放射性核素以不干扰或不利地影响所述肽的结合特性或特异性 的方式与所述肽偶联。使用多种螯合剂对肽进行放射性标记是本领域 熟知的。适宜的螯合剂通常包括含有四齿配体的那些，其具有至少一 个硫基团可供结合金属放射性核素，如已知的N₃S和N₂S₂配体。更特 别是，可与本发明的肽联合使用的螯合基团包括2,3-双(巯基乙酰氨 基)丙酸酯(美国专利No.4,444,690)、S-苄氧基巯基乙酰基甘氨酰 基甘氨酰基甘氨酸(美国专利No.4,861,869)、二环二酐类如DTPA 和EDTA及其衍生物(美国专利No.4,479,930)、含有氨基基团以增 强螯合动力学的NS螯合物(美国专利No.5,310,536)、如美国专利 No.4,965,392中所述的N₂S₂螯合物、如美国专利No.5,120,526中所述 的N₃S螯合物以及如美国专利No.5,175,257中所述含有可切割接头 的N₂S₂螯合物。螯合剂通过本发明领域已知的标准方法偶联到肽上 并可加到肽上的任何位置，条件是该肽的生物学活性不受到不利影响。 优选地，螯合基团与肽的氨基末端氨基酸共价偶联。螯合基团可有利 地在固相肽合成期间附着到肽或在已获得肽之后通过溶液相化学添 加。优选的螯合基团包括DOTA、NOTA、NODAGA或CB-TE2A。

有关本发明中所用肽的合成，参考US7,026,282。

本发明的肽/螯合物缀合物通过使缀合物与177-Lu放射性核素 (例如作为金属盐，优选水溶性)反应来标记。所述反应通过本领域 已知的方法来进行。

优选本发明的放射性药物组合物以试剂盒提供，其中放射性核素 提供一个小瓶中，而肽/螯合基团缀合物提供在第二个小瓶中，内容物 在施用前即刻混合。如果需要可加热所述混合物以实现完全标记。以 试剂盒形式提供这样的放射性标记复合物和制备最终的放射性标记产 物在核医学领域是标准且常规的。最终的放射性药物产物应为高放射 化学纯度，优选大于95％，且至少大于90％，如用本领域已知的标准 方案所测定的。

制备放射性标记的复合物以提供如下的放射性剂量：在动物中大 约1-100MBq，优选大约20MBq，和在人类中2-20GBq，优选大约 7.4GBq，根据标准放射性药物剂量测定给予个体。如本文所用，“诊 断有效量”意指放射性药物的量足以允许其被闪烁法检测到，“治疗有 效量”意指足以在所靶向的生物学位点实现治疗性治疗的量。放射性标 记的肽可在用于静脉内注射的任何常规介质内静脉内施用。对生物学 位点的显像可在注射后大约2-5分钟内进行，但也可在注射后数小时 发生。可采用任何用于诊断目的的常规显像方法。

以下实施例描述了本发明的优选实施方案。在本文权利要求书范 围之内的其它实施方案对于本领域技术人员来说根据考虑说明书或实 施如本文公开的发明将是显而易见的。

实施例

图1显示¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的化学结构和在HT-29移植瘤荷瘤 裸鼠的所选器官和原发肿瘤病损中的生物分布。将小鼠在注射后0.5、 1.0、2.0、4.0和24.0小时处死，采集一组器官，包括从心脏取的血液， 称重，并分析放射性含量。呈现在每一点来自3只小鼠的平均百分比 注射剂量/克(％ID/g)±SEM。A.¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的化学结构。B(上 图)¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105在0.5到24.0小时之间在所选器官/组织中的 生物分布。B(下图)显示对于¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105在0.5到4.0小时 之间在所选器官/组织中的生物分布，较早时间点增加的时间分辨率。

图2显示裸鼠中HT-29移植瘤的PET/CT和伽马平面显像，定量 肿瘤摄取数据用于比较。对于PET/CT显像，对一只小鼠注射 ⁶⁴Cu-DOTA-AE105并在注射后1小时扫描。伽马平面显像对另一只小 鼠在注射¹⁷⁷Lu-DOTA-AE1051小时后进行。定量数据基于对PET/CT 数据作感兴趣区域分析的手工描绘并且从分析的整个肿瘤组织使用伽 马计数器用于平面数据。A.对HT-29移植瘤的PET/CT(左)和伽 马平面(右)显像后的代表性图像。白色箭头指示移植瘤。B.对 ⁶⁴Cu-DOTA-AE105(PET)和¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105(伽马)发现 0.86±0.03％ID/g和0.61±0.15％ID/g的肿瘤值摄取。定量肿瘤摄取 数据呈现为基于3只动物的％ID/g±SEM。

图3显示在给予2x20MBq的¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105、对照肽 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut或载体对照的动物中的平均肿瘤体积和 uPAR表达水平。A.与对照组相比，在第6天(p<0.05)和第8天(p<0.01) 发现¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105对肿瘤体积的显著作用。在研究第14天结 束时没有发现肿瘤体积的显著差异。平均肿瘤体积通过在CT图像上 手工描绘肿瘤病损来计算。结果呈现为均值±SEM,n＝12肿瘤/组。B. 在研究第14天结束时对全肿瘤提取物使用ELISA测定uPAR表达水 平。与对照组相比，在给与¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的动物组中发现显著 降低的uPAR水平(p<0.05)。在载体和对照肽¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut 组之间没有见到差异。

图4显示使用¹⁸F-FLT PET作为对¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105治疗效力 的预测。给予¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105动物组中的所有小鼠在研究第0天 和第6天用¹⁸F-FLT进行PET/CT扫描。A.在第6天相对于第0天 平均肿瘤摄取¹⁸F-FLT之间的差异与第0天到第14天肿瘤体积的差异 之间的显著关联，例示¹⁸F-FLT PET基于第6天与第0天之间肿瘤摄 取的差异预测第14天最终肿瘤体积的潜力。每一点代表单一肿瘤。 B.HT-29移植瘤荷瘤裸鼠第0天(左)和第6天(右)注射¹⁸F-FLT 后1小时的代表性PET/CT图像(轴向，上图)，(矢向，下图)。 白色箭头指示肿瘤病损。

图5显示给予¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105、对照肽 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut或载体对照的动物中的毒性，通过在研究期间 追踪每只小鼠的重量和对肾脏使用H&E染色来评价。A.在每个处理 组间没有观察到平均体重的显著差异。结果呈现为均值±SEM,n＝6只 动物/组。B.来自每个处理组的肾脏切片的H&E染色，代表肾上皮(上 图)和小球(下图)。对肾脏的组织病理学检查揭示在任何处理组没 有大体形态学变化。对来自1只动物/组的一对肾脏进行染色。比例尺 ＝25μm,40X放大。

图6显示来自¹⁸FLT-PET/CT研究的原始数据。A/B.分别为给予 非结合对照肽¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105Mut(A)和载体(B)的小鼠组中第0-6 天肿瘤¹⁸F-FLT摄取的差异与第14天肿瘤大小的关联。C.第0、1、 3和6天肿瘤¹⁸F-FLT摄取的平均组值。没有发现任何组之间的显著 差异。结果呈现为均值±SEM。

图7显示在切除的HT-29肿瘤中的uPAR免疫组化染色。来自每 个处理组的两个肿瘤(1只小鼠)被切除并对uPAR染色。在组间没 有发现染色强度的显著差异。所有切除的肿瘤在肿瘤周边都有主要为 uPAR阳性染色，从而证实早先公开的观察结果[25]。比例尺＝50μm, 20X放大。

图8显示A)“uPAR治疗诊断对”的化学结构：⁶⁴Cu-DOTA-AE105 (PET诊断学)和¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105(治疗)。AE105是具有如下氨基 酸序列的九聚体肽：Asp¹-Cha²-Phe³-ser⁴-arg⁵-Tyr⁶-Leu⁷-Trp⁸-Ser⁹,其 中残基是与uPAR相互作用的热点。Cha是非天然氨基酸环己基-(L)- 丙氨酸。ser和arg均以D-构型存在。B)例示研究中的试验设置。在 第一剂前14和1天通过心内注射总共对36只小鼠接种uPAR阳性和 萤光素酶转染的人前列腺癌细胞系PC-3M.Luc.。三组12只小鼠，6 只在给第一剂之前14天和之前1天接种。每组间隔一周接受3剂大约 18MBq/剂或载体。通过在扫描前10分钟注射萤光素使用生物发光显 像(光学显像)监测肿瘤负荷/转移病损数。在研究第31天，对来自 每个处理组的一只小鼠使用⁶⁴Cu-DOTA-AE105进行uPAR PET扫描， 以例示uPAR PET识别转移病损的潜力。

图9显示A)研究中每个处理组的代表性生物发光图像。与给予 uPAR靶向放射性核素疗法(¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105)的小鼠组相比，在两 个对照组中观察到增加数目的转移病损。B)从研究第2-30天发生的转 移病损的总数的定量分析，证实这一观察结果。使用单向ANOVA， 与两个对照组相比，在177Lu-DOTA-AE105组中发现转移病损数目 显著减少(p＝0.0193,N＝12/组)。

图10显示无远处转移生存。通过分析直至第一个转移病损(除外 心脏)的时间，对uPAR靶向处理组(¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105)发现延长 的无远处转移生存的明显趋势。在65％给予¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的小 鼠中，在第一剂后64天没有远处转移存在。相同的观察结果在 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut(对照)和载体对照组中仅仅分别对24％和 33％见到。黑色箭头指示给药天。

图11显示用于识别小转移病损的uPAR PET显像。使用 ⁶⁴Cu-DOTA-AE105的uPAR PET能够以高对比度识别每只小鼠中的 每个肿瘤病损，且观察到uPAR PET与相应的生物发光显像之前的清 楚关联。这例示了这一新的‘uPAR治疗诊断对’用于诊断和治疗的能 力。uPAR PET通过在尾静脉中i.v.注射大约5MBq 64Cu-DOTA-AE105然后在注射后22小时扫描来进行。

图12显示在整个研究期间监测每只小鼠的重量以调查任何处理 诱导的毒性。在第一次注射后持续37天，每一处理组中所有小鼠的平 均重量没有观察到显著差异，从而表明间隔一周三剂大约18MBq ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105得到良好耐受。黑色箭头指示给药天。

所有化学药品均购自Sigma-Aldrich Denmark A/S，除非另有说 明。¹⁷⁷Lu购自PerkinElmer(Boston(MA),USA)。所有溶液用超纯水 (<0.07μSimens/cm)制备。在配备有Waters 2489UV/可见检测器 (Waters Cooperation,Milford(MA),USA)和Caroll Ramsey  Associates 105S-1放射性检测器(Berkeley,CA,USA)的Waters  Alliance 2795分离模块上进行反相高压液相色谱(RP-HPLC)。 RP-HPLC柱是Luna C18,HST,50x 2mm,2.5μm(Phenomenex, Torrance,CA,USA)。流动相是含0.1％(v/v)TFA的5％(v/v)乙腈 /95％(v/v)水和含0.1％(v/v)TFA的95％(v/v)乙腈/5％(v/v)水。TLC 在配备有β检测器的Raytest MiniGita Star(Straubenhardt, Germany)TLC-扫描仪上进行。TLC洗脱剂是在50％(v/v)甲醇水溶液 中的乙酸铵(0.65M)，且TLC板是在铝箔上的Silica60(Sigma-Aldrich  Denmark A/S)。

重组人uPAR如所述产生和纯化[29,30]。使用在中国仓鼠卵巢细 胞中表达的纯化重组uPAR作为抗原，内部制备多克隆兔抗uPAR抗 体[31]。2-(4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二 烷-1-基)-乙酸(DOTA-三(叔丁)酯购自CheMatech(Dijon,France)。 ¹⁸F-FLT获自哥本哈根大学医院核医学和PET部的制备，其有资质生 产和在患者中使用这种示踪剂。

肽合成和放射性标记

使用如先前所述的两种九聚体DOTA-缀合肽[25]即DOTA-AE105 (DOTA-Asp-Cha-Phe-(D)Ser-(D)Arg-Tyr-Leu-Trp-Ser-CONH₂)(图1A) 和DOTA-AE105mut(DOTA-Asp-Cha-Glu-(D)Ser-(D)Arg-Tyr-Leu- Glu-Ser-CONH₂)(图1A)。用⁶⁴Cu放射性标记DOTA-AE105也如先 前所报道的进行[25]。用¹⁷⁷Lu放射性标记DOTA-AE105和 DOTA-AE105mut如下进行：将¹⁷⁷LuCl₃(在0.05M HCl中的水溶液, 25μl～500MBq)加入在0.05M HCl水溶液(450μl)中含有肽(4.65nmol) 和抗坏血酸钠(56mg,0,28mmol)的溶液。将混合物加热至80℃ 60 分钟，然后使其达到室温。将混合物通过C18SepPak柱，并用水(5ml) 洗脱未标记的Lu³⁺。将放射性标记肽最后用0.5ml乙醇洗脱并在水中 稀释乙醇浓度至低于5％用于注射。放射化学纯度通过RP-HPLC测 定，未标记的¹⁷⁷Lu³⁺的量通过薄层色谱来测定。所述合成通常产生 300MBq的放射性标记肽，放射化学纯度为95-97％。在终产物中未标 记的Lu³⁺的量小于1％。

细胞系和动物模型

皮下结肠直肠癌异种移植物模型

HT-29结肠直肠癌细胞获自美国典型培养物保藏中心 (Manassas,VA,USA)，培养基获自Invitrogen Co.(Carlsbad,CA,USA)。 于37℃和5％CO₂将细胞系培养在补充有10％(v/v)胎牛血清和 1％(v/v)青霉素/链霉素的McCoy标准培养基中。人HT-29结肠直肠癌 细胞的异种移植物如下建立：在Hypnorm/doricum麻醉下，将悬浮于 100μl Matrigel(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)的200μl细胞(1x10⁸细胞/ml)皮下注射到获自Taconic的雌性NMRI裸鼠的左和右侧腹(研 究第-3天)。所有动物试验均在经丹麦司法部动物研究委员会批准的 规程下进行。

播散性前列腺癌模型

PC-3M.Luc萤光素酶转染的人前列腺癌细胞获自美国典型培养 物保藏中心(Manassas,VA,USA)，培养基获自Invitrogen  Co.(Carlsbad,CA,USA)。于37℃和5％CO₂将细胞系培养在补充有 10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素/链霉素的MEMS标准培养基中。

心内播散模型如下建立：在Hypnorm/doricum麻醉下，将20μl 细胞(10⁵细胞/ml)注射到获自Taconic的雄性NMRI裸鼠的左心 室中(研究第-14天和-1天)。所有动物试验均在经丹麦司法部动物 研究委员会批准的规程下进行。

放射性核素治疗研究

皮下结肠直肠癌异种移植物模型

在肿瘤细胞接种后三天(研究第0天)，将18只每侧腹荷有人结 肠直肠癌异种移植物HT-29的裸鼠随机分成由每组6只动物组成的三 组。每组中的所有动物首先用¹⁸F-FLT进行基线PET/CT扫描(第0 天)，然后给予20MBq的¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105、¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut 或载体。随后在研究第1、3和6天用¹⁸F-FLT重复对每组中所有小鼠 的PET/CT扫描。第二个处理剂量(20MBq)在第7天施用，然后在 第8、10和14天进行CT扫描，在重建图像上使用手工ROI描绘测 量肿瘤体积。在第14天，对所有动物实施安乐死，采集肿瘤和肾脏， 保存于-80℃用于进一步分析。

播散性前列腺癌模型

所有小鼠分成三组，在第0、7和14天在七氟烷麻醉期间通过尾 静脉注射给予¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105(18.3+1.1MBq)、 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut(17.9±3.1MBq)或载体。在研究期间，所有 小鼠一周称重两次，并任意获取食物/水。一周一次，使用生物发光显 像(BLI)估计肿瘤病损数目。对于BLI，对小鼠腹膜内注射D-萤光素 (150mg/kg体重)。使用IVIS 100(Caliper/Xenogen)采集图像。在注 射D-萤光素后10分钟获取图像，并计算病损总数。病损定义为背景2 倍之高的流动(p s^-1)。心脏(注射部位)中的任何病损不包括在本研究 中，因为这不是真实转移病损的反映。

微型PET/CT显像

在七氟烷麻醉期间在i.v.注射大约10MBq的⁶⁴Cu-DOTA-AE105 或¹⁸F-FLT后1小时用microPET Focus 120扫描仪(Siemens Medical  Solutions,Malvern,PA)获取10分钟静态PET扫描。使用如先前详细 描述的所有PET/CT设置[25]。所有结果用Inveon软件(Siemens  Medical Solutions)分析，PET数据表示为每克组织注射剂量百分比 (％ID/g)，CT数据表示为立方毫米(mm³)。

伽马平面显像

对一只小鼠(未纳入处理研究规程)i.v.注射¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105 (20MBq,200μl PBS)并在注射后1小时处死。用Millenium VG用 5/8in.Nal(TI)晶体(General Electric,Haifa,Israel)制备伽马相机的 静态图像。在24小时期间以256×256矩阵获取图像，放大系数为 4.0，能量窗设为113±10％和208±10％keV。

生物分布研究

生物分布研究如前所述进行[25]。简而言之，对荷有HT-29异种 移植物的裸鼠在尾静脉中注射2-3MBq的¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105或 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut。所有小鼠在示踪剂注射后0.5、1、2、4和 24小时安乐死。采集血液、肿瘤和主要器官(湿重)并使用Perkin  Elmer,MA,USA的γ-计数器测量放射性(N＝4只小鼠/组)。

放射剂量测定

对器官摄取值进行时间积分以获得每克组织停留时间用于放射剂 量测定计算。时间0-24小时之间的积分通过梯形法来进行。所有时间 点用于拟合双指数函数(2室模型)，其用于估计从24小时到无限的 停留时间。外推面积在所有器官/组织中<17％总计算面积，除外肾脏 (36.1％)和脾脏(30.0％)。¹⁷⁷Lu的放射性衰变主要产生低能量β 粒子。1g球(0.0233mGy/MBq s)的S值用于计算器官剂量，通过如前 所述将其乘以器官停留值[20]。

在切除的HT-29肿瘤中uPAR表达的定量和显现

如前详述进行对切除的HT-29肿瘤的uPAR ELISA[25]。所有结 果作为一式两份测量进行。在福尔马林固定和石蜡包埋的肿瘤组织中 的uPAR表达通过免疫组化染色(图7)来评价，如前所述[25]。对 H&E染色的肾脏组织(来自每个处理组一只动物的一对肾脏)进行总 体组织病理学检查，由受过训练的病理学家(ODL)进行。

统计学分析

所有定量数据表示为均值±SEM(均值的标准误)，且均值使用 单向ANOVA来比较。使用线性回归分析进行关联统计学。P值≤0.05 被认为是统计学显著的。

¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的生物分布和特异性

在荷有结肠直肠HT-29肿瘤的动物中研究¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的 体内药代动力学揭示从血液和所有器官(在切除后研究的)的快速清 除率(图1B)。最高水平的放射性见于肾脏、肿瘤和血液。肿瘤中的 放射性水平在0.5小时后达到峰值1.78±0.21％ID/g，然后迅速下降至 4小时时的0.17±0.02％ID/g和24小时后的0.057±0.02％ID/g(表1)。 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的最高肿瘤/肌肉比(T/M)为注射后1小时的12， 进行性降低至在施用后24小时的3.3。与¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105相比， 在施用非结合对照肽(¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut)后在0.5小时后观察到 显著降低的肿瘤摄取(p<0.001)，从而证实uPAR靶向肽的特异性(表 1)。

表1.在HT-29移植瘤荷瘤小鼠中¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105和 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut的生物分布和放射剂量测定

注：每个数据点代表来自三只动物的均值，表示为每克组织或器 官的注射剂量百分比

*p<0.05

ξ：uPAR阳性肿瘤级分

uPAR PET和伽马平面显像

用发射正电子的放射性核素标记DOTA-AE105使得能够使用 PET显像来定位uPAR阳性肿瘤，如先前所展现的[25,26,28]。这在图 2A(左)中例示，其中使用⁶⁴Cu-DOTA-AE105对荷有结肠直肠HT-29 肿瘤的小鼠进行PET/CT扫描。使用该PET示踪剂的最高摄取见于肝 脏和肿瘤组织，从而证实先前公开的数据[25,26]。图2A(右)是注射 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105后HT-29荷瘤小鼠的代表性平面图像。采用基于 融合PET/CT图像的手工ROI分析，对⁶⁴Cu-DOTA-AE105发现注射 后1小时0.86±0.03％ID/g的肿瘤摄取；基于伽马计数器分析， ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的相应肿瘤摄取为0.61±0.15％ID/g。使用PET 显像，肿瘤(白色箭头)清晰可见，而平面显像具有较差的图像质量。

对HT-29移植瘤的试验性放射性核素疗法

与接受非结合版本的放射性标记肽(¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut)或载 体(对照)的对照组相比，在第0天和第7天接受单剂 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105后，在第6天(p＝0.04)和第8天(p＝0.002)对肿瘤 (n＝12)观察到基于连续CT扫描肿瘤大小的显著差异(图3A)。在第 10和14天没有观察到显著差异。当研究终止于第14天时，对于载体 对照、¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut和¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105，平均肿瘤大小 分别为287±44mm³、286±32mm³和218±22mm³(p＝0.09)。

当随后在第14天终止研究时切除肿瘤并分析uPAR表达时，与 非靶向¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut和载体组相比，在给予 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的小鼠中观察到显著减少的uPAR表达 (p＝0.02,n＝10个肿瘤/组)，尽管在第14天肿瘤大小缺乏显著差异(图 3B)。从每个处理组选择一只小鼠(携带2个肿瘤)进行器官切除以 通过免疫组化提供有关uPAR表达的额外信息。在这些组织学切片(图 6)中没有观察到如ELISA数据(图3B)中见到的uPAR表达水平的 差异，这很有可能是由于对2个非靶向组观察到的uPAR表达水平的 生物学变异大和选择从每组仅纳入一只动物。

¹⁸F-FLT PET显像作为早期反应标志

在该疗法研究中还调查了使用¹⁸F-FLT PET显像作为对uPAR靶 向放射性核素疗法的反应的指示的能力。所有小鼠在第0天在给予 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105之前作基线¹⁸F-FLT PET/CT扫描，然后在第1、 3和6天作¹⁸F-FLT PET/CT扫描。发现在接受¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105 的小鼠组中从基线到第6天肿瘤摄取¹⁸F-FLT的差异与研究期间(14 天)总肿瘤生长之间的显著关联(p＝0.001,R²＝0.71)(图4A)。在两 个对照组中发现相同的显著关联(图6A、B)。

预测第14天肿瘤大小的能力可见于早至第3天(p＝0.02,R²＝0.49)， 而在第1天没有观察到这种关联(数据未显示)。在HT-29肿瘤模型 中¹⁸F-FLT的相对肿瘤摄取导致高肿瘤/背景比，对于PET/CT分析肿 瘤病损清晰可见(图4B)。在本研究中没有观察到每个处理组之间 ¹⁸F-FLT肿瘤摄取的显著差异(图6C)。

放射剂量测定

基于¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的生物分布数据，计算对放射剂量测定 的估计(表1)。最高累积活性暴露见于肾脏(52.9mGy/MBq)，随后 为肿瘤组织(5.8mGy/MBq)、脾脏(5.5mGy/MBq)和血液(4.9 mGy/MBq)。然而HT-29肿瘤的uPAR阳性级分先前被发现仅位于肿 瘤周边[25]。在本研究中观察到相同的表达模式(图7A)，uPAR阳 性癌细胞仅占整个肿瘤的大约10％部分。鉴于此且知晓¹⁷⁷Luβ辐射的 小穿透范围(<2mm)，本发明人计算局部uPAR阳性肿瘤级分放射剂 量测定估计为大约58mGy/MBq，从而导致对研究的所有器官/组织的 最高暴露。

毒性

在研究期间任何组中都没有动物提前死亡。在任何组间都没有观 察到动物重量的差异(图5A)，从而表明在两剂(2x25MBq) ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105后不存在任何急性毒性。基于生物分布数据和剂 量估计，在任何正常器官中肾脏具有最高水平的累积活性因此具有遭 受来自该治疗的毒性的最高危险。然而，在H&E染色后在来自每个 处理组检查的一对肾脏中没有观察到大体异常的组织病理学变化(图 5B)。

体外配体：uPAR相互作用和细胞结合

对非缀合肽AE105和DOTA缀合版本(DOTA-AE105)发现配 体IC₅₀值均为6.7nM，如表2所示。通过置换已知对于向uPAR结合 重要的两个氨基酸(即Phe³->Glu和Trp⁸->Glu)，观察到IC₅₀值显著降低(IC₅₀>10³nM)。使用PC-3M的体外细胞结合试验证实了 177Lu-DOTA-AE105以高特异性结合人uPAR的能力。与扰码版本 (177Lu-DOTA-AE105mut)相比发现显著更高的结合(p<0.01)。

uPAR靶向放射疗法对微转移发生的效力

通过心内注射接种PC-3M细胞，这是对播散转移性疾病的充分 描述的模型，并且由于PC-3M细胞系稳定表达萤光素酶，在所有三 个处理组中用BLI追踪微转移的形成。每个组的代表性图像如图3A 所示。对载体和¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut组分别观察到肿瘤病损数目 增加的清楚趋势。这也通过分析每只小鼠从第2天到第30天肿瘤病损 数目的平均变化得到证实(图9B)。在接受¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的组 中观察到肿瘤病损数目/小鼠显著减少(-0.44±0.33)，而在 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut(0.63±0.53)和载体(1.55±0.51)组中均分别观察 到增加(p<0.05)。而且，通过分析直至存在第一个转移病损(除外心脏) 的时间，对uPAR靶向处理组(¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105)发现延长无远处 转移生存的清楚趋势(图10)。在65％给予¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的小 鼠中在第一剂后65天时不存在远处转移。相同的观察结果在 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut(对照)和载体对照组中仅分别对24％和33％ 见到。对于载体、177Lu-DOTA-AE105mut和177Lu-DOTA-AE105， 中值无转移时间分别为12.5、16和>65天。所有主要发现如表3所示。

在体内识别微转移的uPAR PET显像

在研究期间(研究第31天)在多只小鼠中首次探索了uPAR PET 显像使用64Cu-DOTA-AE105作为配体识别微转移病损的能力。对每 只动物首先用BLI扫描，然后进行uPAR PET扫描。对每只动物比较 使用每种模式存在的微转移病损数目。使用BLI存在的所有肿瘤病损 使用uPAR PET扫描也都检测到(4/4)(图11)。

毒理学

在本研究中在任何处理组中都没有观察到处理诱导的毒性，通过 观察到的小鼠重量曲线表明(图12)。

讨论

在本研究中，发明人报道在人结肠直肠癌模型和播散转移性前列 腺癌模型中使用特异性uPAR靶向放射性核素配体 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的放射性核素疗法的体内效力的首次概念验证试 验证据。本发明人发现该放射性核素疗法对肿瘤生长率有显著影响， 导致uPAR阳性癌细胞数目显著减少，并且减少转移病损数目。这些 结果非常令人鼓舞，因为众多研究已鉴别出uPAR在不同癌症的反应 性肿瘤-基质室中强烈上调和在侵袭性癌症的前沿表达并与差预后有 关。此外，所述结果还例示了PET显像定位表达uPAR的肿瘤和转移 的潜力以及使用¹⁸F-FLT-PET预测¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105后的后续治疗 反应。

有一项研究之前已调查了(但仅在体外)α放射性核素uPAR靶 向细胞毒性的应用，其对播散性卵巢癌使用²¹³Bi标记的AE105靶向 肽的二价变体[32]。在那项研究中，如上所述效力仅仅在体外对细胞 培养物作评价，且没有包括对照来评价所观察到的细胞毒性是否实际 上是由uPAR靶向效应所导致。尽管如此，他们确实确立了其先导化 合物²¹³Bi-P-P4D的生物分布，报道了在荷有腹膜内移植的卵巢癌细胞 系OV-MZ-6的小鼠中注射后45分钟肿瘤与肾脏之比为0.2。通过集 落形成测定建立了在体外OV-MZ-6细胞存活率下降与²¹³Bi-P-P4D给 药剂量增加之间的清楚关联。

¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105靶向疗法在CRC中的未来临床应用的潜在 影响主要会是根除在原发肿瘤侵袭前沿的uPAR阳性癌细胞和反应性 基质细胞。联合其它治疗模式，这可减弱病损的转移性播散。然而应 该考虑一条注意事项，即本发明人在本研究中使用的异种移植CRC 动物模型并非在临床上代表重大挑战的复杂人类CRC的理想模型。 尽管显然需要未来的研究来探索这一uPAR靶向放射性核素疗法的全 部潜能，本发明人已在本模型中证实了这样的治疗模式在相对小的肿 瘤病损中的效应。

临床中使用肽-受体放射性核素疗法的剂量限制性毒性通常是由 肾毒性引起的[33]。在本例中，基于放射剂量测定计算，肾脏也暴露 于高水平放射性(表1)。然而，对来自每个处理组的H&E染色切片 的组织病理学检查没有揭露三个组间的大体形态学差异，表明本发明 人使用的放射剂量没有导致严重的肾毒性(图5B)。而且，在临床设 置中，使用不同的肾脏保护方案如在注射放射性标记肽后立即注射佳 乐施和不同的氨基酸溶液，已显示出可保护肾脏免于放射性诱导损害 [34]。作为总体毒性的指示，本发明人测量了每个处理组中所有动物 的重量，且发现两剂(2x25MBq)后组间没有显著性重量差异，表明没 有由放射产生的主要急性毒性。但是¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105给药后的肾 毒性程度在未来人体临床试验中需要小心评价。

在本研究中，本发明人能够发现基线到第6天之间¹⁸F-FLT肿瘤 摄取的变化与第14天最终肿瘤体积之间的清楚关联。与基线第0天相 比在第6天具有最高摄取值的那些肿瘤也是对治疗反应最低的肿瘤。 使用¹⁸F-FLT PET基于增殖状态预测肿瘤反应先前也对在小鼠中的新 试验疗法[35]和在患者中对不同临床批准药物[36,37]例示过，研究提 供其用于肽受体放射性核素疗法的证据。基于本研究中发现的清楚关 联，所述新放射性核素疗法表现出可诱导降低的增殖率，其可归于直 接β电离，以及已知的¹⁷⁷Lu的旁观者效应[24]，其提供邻近的uPAR 阴性癌细胞以显著的放射剂量，因为肿瘤中仅大约10％的所有HT-29 CRC细胞是uPAR阳性的[25]。这也可解释观察到与两个对照组相比 在给予¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的小鼠中在第6天和第8天发现的肿瘤大 小显著减小(图3A)。

使用新确立的uPAR PET显像来选择未来具有高肿瘤uPAR表达 水平的CRC患者且由此也是预后差的患者的能力从临床角度而言也 是很有吸引力的。现今侵入性操作如取血样和肿瘤活检是确定患者 uPAR表达水平的唯一方法。血液中的uPAR水平仅仅是肿瘤组织中 水平的间接衡量指标，而从肿瘤病损取的任何活检常常不代表整个肿 瘤病损，导致如果没有达到最高表达水平的区域时可能错误的低结果。 此外，转移病损的活检常常难以取到，且仅仅会探查已知的病损。采 用非侵入性的uPAR PET显像可潜在替代活检操作的需要，并给出对 uPAR表达水平更具代表性的图像，因为整个身体都被扫描，因而也 可识别任何uPAR阳性的转移病损。尽管¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105能进行 直接伽马显像，缺乏定量选项和由于仅9.7％为伽马辐射所致的降低显 像特性，进一步突出了uPAR PET显像对患者选择和疗法监测的效用。 随着引入uPAR的新“治疗针对”对，这一方案可以成为未来临床上患 者管理的现实选项。

概括起来，展示了完全新的靶向uPAR的放射性核素肽疗法。在 人结肠直肠异种移植癌模型和播散性前列腺癌模型中都发现了高度 uPAR特异性的细胞毒性作用。基于确立uPAR在癌症患者原发肿瘤 侵袭前沿高度表达的众多文献，本发明人相信本发明人开发了一种新 的治疗诊断模式，其具有特异性识别和靶向侵袭性癌症的潜能。

表2.

注：粗体的残基是与uPAR相互作用的热点。Cha是环己基-(L)- 丙氨酸，ser和arg均以D构型存在。

在表2中，显示具有对人uPAR的相应结合亲和力的每种肽缀合 物的氨基酸序列。粗体的残基是对与uPAR的相互作用重要的。用 Glu置换这些重要氨基酸中的两个(Phe³和Trp⁸)导致完全丧失对 uPAR的亲和力，通过与靶向肽缀合物(即DOTA-AE105)的6.7nM 相比高于10³nM的IC₅₀值所例示的。重要的是，在N末端缀合DOTA 螯合物不引起亲和力下降，由未缀合肽AE105与缀合形式 DOTA-AE105之间相同的IC₅₀值所例示。

表3.

在表3中，显示了¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105在播散性人前列腺癌小鼠 模型中的抗转移效应的概括。在给予uPAR靶向¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105 的组中显著更高数目的小鼠具有稳定的疾病或针对进展性疾病的反 应。在对照组(载体)中，11只中7只具有进展性疾病，而这在 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105组中仅在9只中的1只中见到(p＝0.028)。通过比 较¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105和非结合对照肽缀合物 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut，还发现治疗反应的显著差异(p＝0.049)。在两 个对照组间没有观察到治疗效力的显著差异(p＝0.100)。此外，通过分 析每只小鼠直至存在第一个转移病损(除外心脏)的时间，对uPAR 靶向处理组(¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105)发现延长无远处转移生存的清楚趋 势。在65％给予¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105的小鼠中在第一剂后65天时不 存在远处转移。相同的观察结果在¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut(对照)和 载体对照组中仅分别对24％和33％见到。对于载体、 ¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105mut和¹⁷⁷Lu-DOTA-AE105，中值无转移时间分别 为12.5、16和>65天。

参考文献

[1]Jemal A，Siegel R，Xu J，and Ward E.Cancer statistics，2010.CA Cancer J Clin  2010；60:277-300.

[2]Ferlay J，Shin HR，Bray F，Forman D，Mathers C，and Parkin DM.Estimates of  worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008.Int J Cancer  2010；127:2893-917.

[3]Glazer ES，Beaty K，Abdalla EK，Vauthey JN，and Curley SA.Effectiveness of  positron emission tomography for predicting chemotherapy response in colorectal  cancer liver metastases.Arch Surg 2010；145:340-5；discussion 5.

[4]Kriegbaum M PM，Haldager L，Alpizar-Alpizar W，Jacobsen B，H，A，and Ploug M.Rational targeting of the urokinase receptor(uPAR):Development of  inhibitors and non-invasive imaging probes.Current Drug Targets 2010.

[5]Mazar AP.The urokinase plasminogen activator receptor(uPAR)as a target for  the diagnosis and therapy of cancer.Anticancer Drugs 2001；12:387-400.

[6]Jacobsen B and Ploug M.The urokinase receptor and its structural homologue  C4.4A in human cancer:expression，prognosis and pharmacological inhibition.Curr  Med Chem 2008；15:2559-73.

[7]Rasch MG，Lund IK，Almasi CE，and Hoyer-Hansen G.Intact and cleaved uPAR  forms:diagnostic and prognostic value in cancer.Front Biosci 2008；13:6752-62.

[8]Ganesh S，Sier CF，Griffioen G，Vloedgraven H J，de Boer A，Welvaart K，et al. Prognostic relevance of plasminogen activators and their inhibitors in colorectal  cancer.Cancer Res 1994；54:4065-71.

[9]Ganesh S，Sier CF，Heerding MM，Griffioen G，Lamers CB，and Verspaget HW. Urokinase receptor and colorectal cancer survival.Lancet 1994；344:401-2.

[10]Ganesh S，Sier CF，Heerding MM，van Krieken JH，Griffioen G，Welvaart K，et  al.Contribution of plasminogen activators and their inhibitors to the survival  prognosis of patients with Dukes′stage B and C colorectal cancer.Br J Cancer  1997；75:1793-801.

[11]Stephens RW，Nielsen H J，Christensen IJ，Thorlacius-Ussing O，Sorensen S， Dano K，et al.Plasma urokinase receptor levels in patients with colorectal cancer: relationship to prognosis.J Natl Cancer Inst 1999；91:869-74.

[12]Lomholt AF，Christensen I J，Hoyer-Hansen G，and Nielsen HJ.Prognostic value  of intact and cleaved forms of the urokinase plasminogen activator receptor in a  retrospective study of 518colorectal cancer patients.Acta Oncol 2010；49:805-11.

[13]Illemann M，Bird N，Majeed A，Laerum OD，Lund LR，Dano K，et al.Two distinct  expression patterns of urokinase，urokinase receptor and plasminogen activator  inhibitor-1in colon cancer liver metastases.Int J Cancer 2009；124:1860-70.

[14]Wang Y，Liang X，Wu S，Murrell GA，and Doe WF.Inhibition of colon cancer  metastasis by a 3′-end antisense urokinase receptor mRNA in a nude mouse model. Int J Cancer 2001；92:257-62.

[15]Ahmed N，Oliva K，Wang Y，Quinn M，and Rice G.Downregulation of urokinase  plasminogen activator receptor expression inhibits Erk signalling with concomitant  suppression of invasiveness due to loss of uPAR-beta1 integrin complex in colon  cancer cells.Br J Cancer 2003；89:374-84.

[16]Van Buren G，2nd，Gray MJ，Dallas NA，Xia L，Lim S J，Fan F，et al.Targeting  the urokinase plasminogen activator receptor with a monoclonal antibody impairs the  growth of human colorectal cancer in the liver.Cancer 2009；115:3360-8.

[17]Lee DY and Li KC.Molecular theranostics:a primer for the imaging professional. AJR Am J Roentgenol 2011；197:318-24.

[18]Kwekkeboom DJ，de Herder WW，Kam BL，van Eijck CH，van Essen M，Kooij  PP，et al.Treatment with the radiolabeled somatostatin analog[177Lu-DOTA  0，Tyr3]octreotate:toxicity，efficacy，and survival.J Clin Oncol 2008；26:2124-30.

[19]Jiang L，Miao Z，Kimura RH，Liu H，Cochran JR，Culter CS，et al.Preliminary  evaluation of(177)Lu-labeled knottin peptides for integrin receptor-targeted  radionuclide therapy.Eur J Nucl Med Mol Imaging 2011；38:613-22.

[20]Persson M，Gedda L，Lundqvist H，Tolmachev V，Nordgren H，Malmstrom PU，et  al.[177Lu]pertuzumab:experimental therapy of HER-2-expressing xenografts. Cancer Res 2007；67:326-31.

[21]Tolmachev V，Orlova A，Pehrson R，Galli J，Baastrup B，Andersson K，et al. Radionuclide therapy of HER2-positive microxenografts using a 177Lu-labeled  HER2-specific Affibody molecule.Cancer Res 2007；67:2773-82.

[22]Wild D，Frischknecht M，Zhang H，Morgenstern A，Bruchertseifer F，Boisclair J， et al.Alpha-versus beta-particle radiopeptide therapy in a human prostate cancer  model(213Bi-DOTA-PESIN and 213Bi-AMBA versus 177Lu-DOTA-PESIN).Cancer  Res 2011；71:1009-18.

[23]Blankenberg FG，Levashova Z，Goris MG，Hamby CV，Backer MV，and Backer  JM.Targeted Systemic Radiotherapy with scVEGF/177Lu Leads to Sustained  Disruption of the Tumor Vasculature and Intratumoral Apoptosis.J Nucl Med  2011；52:1630-7.

[24]Akinlolu O，Ottolino-Perry K，McCart JA，and Reilly RM.Antiproliferative effects  of 111In-or 177Lu-DOTATOC on cells exposed to low multiplicity-of-infection double- deleted vaccinia virus encoding somatostatin subtype-2receptor.Cancer Biother  Radiopharm 2010；25:325-33.

[25]Persson M，Madsen J，Ostergaard S，Jensen MM，Jorgensen JT，Juhl K，et al. Quantitative PET of human urokinase-type plasminogen activator receptor with  64Cu-DOTA-AE105:implications for visualizing cancer invasion.J Nucl Med  2012；53:138-45.

[26]Li ZB，Niu G，Wang H，He L，Yang L，Ploug M，et al.Imaging of urokinase-type  plasminogen activator receptor expression using a 64Cu-labeled linear peptide  antagonist by microPET.Clin Cancer Res 2008；14:4758-66.

[27]Ploug M，Ostergaard S，Gardsvoll H，Kovalski K，Holst-Hansen C，Holm A，et al. Peptide-derived antagonists of the urokinase receptor.affinity maturation by  combinatorial chemistry，identification of functional epitopes，and inhibitory effect on  cancer cell intravasation.Biochemistry 2001；40:12157-68.

[28]Persson M，Madsen J，Ostergaard S，Ploug M，and Kjaer A.(68)Ga-labeling and  in vivo evaluation of a uPAR binding DOTA-and NODAGA-conjugated peptide for  PET imaging of invasive cancers.Nucl Med Biol 2011.

[29]Jacobsen B，Gardsvoll H，Juhl Funch G，Ostergaard S，Barkholt V，and Ploug M. One-step affinity purification of recombinant urokinase-type plasminogen activator  receptor using a synthetic peptide developed by combinatorial chemistry.Protein  Expr Purif 2007；52:286-96.

[30]Lin L，Gardsvoll H，Huai Q，Huang M，and Ploug M.Structure-based engineering  of species selectivity in the interaction between urokinase and its receptor: implication for preclinical cancer therapy.J Biol Chem 2010；285:10982-92.

[31]Ronne E，Hoyer-Hansen G，Brunner N，Pedersen H，Rank F，Osborne CK，et al. Urokinase receptor in breast cancer tissue extracts.Enzyme-linked immunosorbent  assay with a combination of mono-and polyclonal antibodies.Breast Cancer Res  Treat 1995；33:199-207.

[32]Qu CF，Song EY，Li Y，Rizvi SM，Raja C，Smith R，et al.Pre-clinical study of  213Bi labeled PA12for the control of micrometastatic pancreatic cancer.Clin Exp  Metastasis 2005；22:575-86.

[33]Gotthardt M，van Eerd-Vismale J，Oyen W J，de Jong M，Zhang H，Rolleman E， et al.Indication for different mechanisms of kidney uptake of radiolabeled peptides.J  Nucl Med 2007；48:596-601.

[34]Rolleman E J，Melis M，Valkema R，Boerman OC，Krenning EP，and de Jong M. Kidney protection during peptide receptor radionuclide therapy with somatostatin  analogues.Eur J Nucl Med Mol Imaging 2010；37:1018-31.

[35]Jensen MM，Erichsen KD，Bjorkling F，Madsen J，Jensen PB，Hojgaard L，et al. Early detection of response to experimental chemotherapeutic Top216with[18F]FLT  and[18F]FDG PET in human ovary cancer xenografts in mice.PLoS One  2010；5:e12965.

[36]Herrmann K，Buck AK，Schuster T，Junger A，Wieder HA，Graf N，et al. Predictive value of initial 18F-FLT uptake in patients with aggressive non-Hodgkin  lymphoma receiving R-CHOP treatment.J Nucl Med 2011；52:690-6.

[37]Zander T，Scheffler M，Nogova L，Kobe C，Engel-Riedel W，Hellmich M，et al. Early prediction of nonprogression in advanced non-small-cell lung cancer treated  with erlotinib by using[(18)F]fluorodeoxyglucose and[(18)F]fluorothymidine positron  emission tomography.J Clin Oncol 2011；29:1701-8.