一种中兽药复方制剂在制备治疗鸡大肠杆菌病的药物中的应用

摘要

本发明公开了一种中兽药复方制剂在制备治疗鸡大肠杆菌病的药物中的应用，尤其是在制备治疗我国华南等亚热带气候地区鸡大肠杆菌病的药物中的应用。所述中兽药复方制剂由如下百分含量的组分组成：5～55%穿心莲、10～65%苍术、5～55%木香、5～55%厚朴、10～65%干姜；所述中兽药复方制剂为散剂，制备工艺是将五种中药材分别碎成粗颗粒后，按处方比例混合，进一步细粉碎，过30目筛，置V型混合机中混合30min，分装。该处方中药尤其对高温、多雨、湿热地区的鸡大肠杆菌病有非常好的疗效，能够有效控制该病的蔓延和扩散，且安全、副作用小，对我国华南等亚热带气候地区的养禽业意义重大，具有较好的经济意义和社会意义。

说明书

技术领域

本发明属于中兽药技术领域。更具体地，涉及一种中兽药复方制剂在制备治疗鸡大肠杆菌病的药物中的应用。

背景技术

近年来，随着养禽业的不断发展，鸡大肠杆菌病广泛发生于全国各地养禽场，并已然成为兽医临床疾病防治中的一项重点研究对象。鸡大肠杆菌病是临床常见病、多发病，可通过多种途径感染鸡，造成鸡多器官炎症并可导致死亡，该病发病快、传染性强，给养殖业带来巨大的经济损失，是危害养殖业的传染性疾病之一。

目前大部分养殖户防治大肠杆菌的思路仍是药物控制，临床治疗该病主要以抗菌药为主，但由于大肠杆菌具有耐药质粒，易产生耐药性，降低药物疗效，故临床治疗效果差；同时由于抗菌药的大量、超量使用，造成了鸡肉和鸡蛋中大量的药物残留，给食品安全带来极大的隐患。另外，由于气候等综合外界因素的影响，针对不同地区养禽场对鸡大肠杆菌病的防治也存在着明显的差异性。

我国南方，尤其是华南地区，以亚热带季风性气候为主，年降水量为1400～2000毫米，高温多雨，湿热，养殖业尤其是养鸡场，鸡大肠杆菌病一年四季均可发生，每年在多雨、闷热、潮湿季节多发，防治效果差，易复发。

在此背景下，尤其是针对我国华南等亚热带气候地区的养禽业，开发安全有效、副作用小的治疗鸡大肠杆菌病的中兽药新药，具有较好的经济意义和社会意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有鸡大肠杆菌病治疗药物的缺陷和不足，提供一种治疗鸡大肠杆菌病的中兽药复方制剂在制备防治鸡大肠杆菌病药物中的应用，尤其是针对我国华南等亚热带气候地区的应用，控制该病的蔓延和扩散。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种治疗鸡大肠杆菌病的中兽药复方制剂在制备治疗鸡大肠杆菌病的药物中的应用，尤其是在制备治疗亚热带气候地区鸡大肠杆菌病的药物中的应用。

优选地，所述亚热带气候地区是指我国华南地区。

上述中兽药复方制剂由如下百分含量的组分组成：5～55%穿心莲、10～65%苍术、5～55%木香、5～55%厚朴、10～65 %干姜。

所述治疗鸡大肠杆菌病的中兽药复方制剂的剂型为散剂，制备工艺如下：将五种中药材分别碎成粗颗粒后，按处方比例混合，进一步细粉碎，过30目筛，置V型混合机中混合30分钟，分装，即可。

优选地，上述治疗鸡大肠杆菌病的中兽药复方制剂由如下百分含量的组分组成：10～40%穿心莲、15～55%苍术、10～40%木香、10～40%厚朴、15～55%干姜。

更优选地，上述治疗鸡大肠杆菌病的中兽药复方制剂由如下百分含量的组分组成：10～25%穿心莲、20～35%苍术、10～25%木香、1～25%厚朴、20～35%干姜。

最优选地，上述治疗鸡大肠杆菌病的中兽药复方制剂由如下百分含量的组分组成：穿心莲16.7%、苍术25%、木香16.7%、厚朴16.6%、干姜25%。

上述治疗鸡大肠杆菌病的中兽药复方制剂在制备治疗鸡腹泻的药物中的应用也在本发明的保护范围之内，所述鸡腹泻是由蓖麻油或番泻叶引起的腹泻。

上述治疗鸡大肠杆菌病的中兽药复方制剂在制备抑制鸡或小鼠肠推进功能药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明所采用的各活性成分的药用性能如下所示：

穿心莲：清热解毒、凉血消肿。主治急性菌痢、胃肠炎、上呼吸道感染、感冒发热及高血压等心血管疾病。现代医学研究表明，穿心莲对禽巴氏杆菌、鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等有明显的抑制作用，同时还有抗炎、抗病毒作用。现代临床上亦常用穿心莲注射液治疗腹泻性疾病。

苍术：祛风散寒、健脾燥湿。主治脘腹胀满，泄泻等湿阻中焦证。现代药理研究表明，苍术对金黄色葡萄球菌、结核菌、枯叶杆菌和绿脓杆菌均有明显的抑制作用，并对蓖麻油引起的小鼠小肠性腹泻和番泻叶引起的小鼠太肠性腹泻都有明显止泻作用。此外，苍术还对红色毛癣菌、石膏样毛癣菌等多种真菌有不同程度的抑制作用。

木香：行气止痛、健脾消食。主治溃疡病、胆绞痛、腹泻等消化道疾病的治疗，是治疗胃肠疾病的常用药。现代药理研究表明，木香可减少小鼠小肠性腹泻和大肠性腹泻次数，对小鼠墨汁胃肠推进运动也有弱的抑制作用。

厚朴：燥湿消痰、下气除满。主治湿滞伤中、脘痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘、痰饮喘咳，有抗溃疡和调节消化系统的作用。

干姜：温中散寒，回阳通脉，燥湿消痰。主治肠炎、腹泻、呕吐等。现代药理研究表明，干姜具有镇痛抗炎作用﹑抗菌作用﹑改善局部血液循环等作用。

但是，对于实际生活中鸡大肠杆菌病的治疗，并不单纯是应用能够抑制大肠杆菌的药物就能够取得好的疗效的，对鸡等禽类生活习性以及生理状况的综合考察也是必不可少的，环境因素对于鸡大肠杆菌病治疗的效果也有着重大的影响，因此对于药物的复配，必须考虑到环境因素的影响，才能达到最优的治疗效果。

本发明的莲香散主要用于鸡大肠杆菌病的治疗，尤其是针对高温、多雨、湿热地区，既选苦寒之穿心莲清热解毒、燥湿，又配伍苍术燥湿健脾；木香、厚朴行气化湿，佐以干姜温运脾阳以除湿，并佐制他药苦寒之性以护胃气，诸药合用，共奏清热解毒、健脾除湿、止泻之功。因除湿浊而止泻，除下焦湿浊改善输卵管粘膜充血、糜烂变薄，发挥抗炎抑菌功效。

本方面的处方组成科学合理：穿心莲清热解毒、燥湿止泻为君药，苍术健脾燥湿为臣药，木香、厚朴行气化湿为佐药，干姜温运脾阳除湿为使药。共同除湿热，调脾胃，止泻痢。方中穿心莲苦，寒。归大肠经，清热大肠解毒，凉血燥湿止痢。

苍术：辛，苦，温。归脾胃经。叶天士《临证指南医案》曰：“夫疫为秽浊之气，古人所以饮芳香、采兰草，以袭芬芳之气也，重涤秽也。”《名医别录》记载苍术“主头痛，消痰水，逐皮间风水结肿，除心下急满及霍乱吐下不止，暖胃消谷嗜食。”《本草纲目》：“治湿痰留饮……脾湿下流，浊沥带下，滑泄肠风。”苍术苦温，燥脾胃湿浊之力尤胜，其气辛香，可健脾和胃，以助病鸡食欲好转，减少腹泻次数。

木香，辛，苦，温。归脾胃，大肠经。《药品化义》云：“木香，香能通气，和合五脏，为调诸气要药。以此治痞闷嗳气，水肿腹胀，痢疾脚气，皆调滞散气之功。故该品善行胃肠气滞，调中导滞止痛，用于泄泻痢疾后重之症。”《日华子本草》：“治心腹一切气，止泻，霍乱，痢疾，安胎，健脾消食。疗赢劣，膀胱冷痛，呕逆反胃。”《本经》：“主邪气，辟毒疫，强志，主淋露。”

厚朴，苦、辛，温。归脾、胃、大肠经。《名医别录》：“主温中，益气，消痰下气。治霍乱及腹痛，胀满，胃中冷逆，胸中呕逆不止，泄痢，淋露。除惊，去留热，止烦满，厚肠胃。”《本草正》云厚朴能“温降，散滞，除寒湿泻痢。”本品苦燥辛行，既能燥湿，又能行气，善行胃肠气滞胀满。《集验良方》立止水泻方，《圣济总录》厚朴汤等均以本品随证配伍以治湿盛、寒湿泄泻痢疾。厚朴与木香相配伍，增强行气止痛之功，改善病鸡食欲减少、腹泻等症状。

干姜，辛，热。归脾、胃经。本品辛热燥烈，主入脾胃而长于温中散寒、健运脾阳，为温暖中焦之主药。《神农本草经》：“主胸满咳逆上气，温中，止血，出汗，逐风湿痹，肠澼下痢。生者尤良。”《珍珠囊》：“干姜其用有四：通心阳，一也；去脏腑沉寒痼冷，二也；发诸经之寒气，三也；治感寒腹痛，四也。”方中加入干姜，既佐治清热药物之寒性，防治过于寒凉损伤脾阳，又取干姜温运之效，使脾湿易除。

纵观本方，穿心莲清热解毒，苍术燥湿，配伍木香、厚朴调畅脾胃气机，佐以温运脾阳之干姜，既助脾之运化，又防止清热解毒而不伤后天之本，诸药合用共奏清热解毒、燥湿行气，固护脾胃之功效，使湿热易除，胃肠气机调顺，增强病鸡免疫力，缓解大肠杆菌病症状。

综上所述，本处方的选择具有充分的中兽医理论依据：鸡大肠杆菌病多发于气候炎热潮湿季节，湿热偏盛，鸡感受湿热毒邪发病，邪气按温病卫气营血传变，卫分证表现羽毛蓬乱，精神萎靡；湿热下注大肠，故表现水便和溏便。湿热传入气分，表现发热、呼吸喘粗，伤及五脏，易于死亡。严重者热邪逆传心包或深入血分，本方莲香散紧守以上病因病机，在未发病时，及时清热燥湿，祛除湿热病因防止发病，配伍健脾行气治法，调整和增强鸡的胃肠功能，提高鸡自身的免疫力和抵抗力，从而降低大肠杆菌病的发病率。力争未病先防。在发病病程中，卫分阶段，湿热雍盛，脾胃不和，大肠传导失常，表现为精神不佳，采食量下降，羽毛蓬乱，水便和溏便时及早清热解毒、燥湿，湿不去则热不除，同时调理胃肠气机，防治湿热邪气进一步入里传变，降低大肠杆菌病发病后的损害。此外，本方在继承祛湿清热、卫气同治的基础上，增强燥湿之力，并结合“脾胃同治”的保胃气原则，增强扶助健运鸡脾胃功能中药，以扶正祛邪，标本同治。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种中兽药复方制剂在制备治疗鸡大肠杆菌病的药物中的应用，该处方中药对鸡大肠杆菌病有非常好的疗效，能够有效控制该病的蔓延和扩散，且安全、副作用小，应用前景良好。

纵观本方，穿心莲清热解毒，苍术燥湿，配伍木香、厚朴调畅脾胃气机，佐以温运脾阳之干姜，既助脾之运化，又防止清热解毒而不伤后天之本，诸药合用共奏清热解毒、燥湿行气，固护脾胃之功效，使湿热易除，胃肠气机调顺，增强病鸡免疫力，缓解大肠杆菌病症状。

实验结果显示，以充分的中兽医理论为依据，通过合理的复配，在我国华南地区，本发明的处方中药对鸡大肠杆菌病的疗效优于对照药四味穿心莲散。尤其对高温、多雨、湿热地区，治疗效果好、速度快，安全、副作用小，能够达到标本兼治的效果，对我国华南等亚热带气候地区的养禽业意义重大，具有较好的经济意义和社会意义。

附图说明

图1为莲香散的制备工艺流程图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1 本发明治疗鸡大肠杆菌病的中兽药复方制剂的制备方法及小试工艺

1、制备方法

（1）处方名：莲香散。

处方：穿心莲167g、苍术250g、木香167g、厚朴166g、干姜250g，制成1000g。

（2）制备方法：以上五种中药材，分别碎成粗颗粒，再按处方比例混合，进一步粉碎，过30目筛，置V型混合机中混合30分钟，分装，即可。

剂型：本中兽药复方制剂的剂型为散剂。

（3）本莲香散由穿心莲、苍术、木香、厚朴和干姜5味药材组成，其中苍术、木香、干姜3味药材主要含有挥发油，发明人考察了该3味药材水提收油工艺，结果发现出油率较低（约为0.53%）；且主药穿心莲药材中的穿心莲内酯受热不稳定，易转化为脱水穿心莲内酯，故确定直接将药材打粉入药。

2、小试工艺

（1）出粉率考察

按处方量称取穿心莲、苍术、木香、厚朴和干姜净药材，称量3份，每份10kg，粉碎，过30目筛，计算出粉率。结果如表1所示。

表1 莲香散出粉率

（2）制剂处方前研究：莲香散粉碎过30目，测定流动性、吸湿性、堆密度、粒度等，结果如表2所示。结果显示，30目莲香散流动性较好，吸湿性不强。

表2莲香散原料的性质

（3）辅料选择：依据莲香散的性质，其流动性较好，吸湿性不强，加上使用螺杆粉剂分装，对流动性要求不高，因此不必使用助流剂，药粉气香，味苦，混饲后，苦味不是很明显，鸡对苦味感觉不明显，不影响鸡的进食，因此不用加矫味剂、助流剂等辅料。

（4）工艺路线选择：按照中药散剂制剂成型工艺路线，确定莲香散生产工艺路线如附图1所示。

（5）制剂成型工艺研究：莲香散在原料药材前处理研究中已粉碎和过筛，因此制剂成型工艺主要是混合和分剂量。

散剂混合最常用的混合设备是V型混合机，因此使用V型混合机进行试验，以下实验主要考察混合时间与混合均匀度和含量均匀度的关系，从而确定混合时间。

混合时间的考察：称取莲香散粉末20kg，分别在实验室V型混合机混合10分钟、20分钟、30分钟时进行取样（取样点分别在上、中、下各点取样），检查外观均匀度。结果如表3所示。

表3 混合时间考察结果

由表3可知，混合10分钟、20分钟、30分钟外观均匀度合格，外观均匀度没有太大差异，含量均匀度与生产投料规模及设备相关，后续中试规模试验表明，混合30分钟含量均匀度方可合格，因此考虑工艺的适用性，混合时间选择30分钟为宜。

（6）分装：取混合均匀的莲香散，设备调试准确后分装30袋，按最低装量检查法检查，均符合散剂项下要求。

3、工艺验证试验

在工艺验证试验中，按莲香散已确定的处方量和工艺，连续试验3批。即莲香散粉碎，以出粉率为考察项目，结果见表4。

表4 莲香散工艺验证试验结果

结果显示：采用该工艺莲香散出粉率均值为97.6%，工艺重现性好，工艺稳定。

综上所述，根据以上研究，确定莲香散的制备方法为：取穿心莲、苍术、木香、厚朴、干姜五种净药材，分别粉碎成粗颗粒，再按处方比例混合，进一步细粉碎，过30目筛，置V型混合机中混合30分钟，分装，即可（具体生产制备工艺如附图1所示）。

实施例2 莲香散质量标准

【处方名】莲香散Lian xiang san

【处方】穿心莲167g 、苍术 250g 木香 167g  厚朴 166g  干姜 250g。

【制法】以上五味药材，粉碎，过筛，混匀，即得。

【性状】本品为灰黄色粉末；气香，味苦。

【功能】清热解毒、除湿化滞。

【主治】用于鸡大肠杆菌病。

【规格】250g/袋。

【用法与用量】混饲：每1kg饲料，鸡10g.

【贮藏】密封、防潮。

【有效期】两年。

【鉴别】（1）取本品6g，加甲醇100mL，浸泡过夜，超声处理（功率360 W，频率40 kHz）30min，滤过，滤液60℃蒸干，残渣加水15mL使溶解，过AB-8型大孔吸附树脂（柱径1.3cm，柱高15cm），用水洗至无色，再分别用50mL 40%乙醇、100mL 70%乙醇梯度洗脱，收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，加水20mL，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20mL，合并三氯甲烷液，60℃蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液。另取穿心莲对照药材2 g，加乙醇30 mL，超声处理（功率360 W，频率40 kHz）30分钟，滤过，滤液60℃蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国兽药典》2010版二部附录32页）试验，吸取上述供试品溶液10μL、对照药材溶液8μl，分别点于同一GF254薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（4:3:0.4）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

（2）取本品粉末6g，加甲醇50mL，超声处理（功率360 W，频率40 kHz）30分钟，滤过，滤液减压浓缩至稠膏，加水30mL溶解，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，50℃蒸干，残渣加甲醇5mL使溶解，作为供试品溶液。另取苍术对照药材1g，加甲醇10mL，超声处理（功率360 W，频率40 kHz）15分钟，滤过，取滤液，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国兽药典》2010版二部附录32页）试验，吸取供试品溶液6μL、对照药材溶液8μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（22：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

（3）取【鉴别】2项下供试品溶液作为供试品溶液。另取木香对照药材1g，加甲醇20mL，超声处理（功率360 W，频率40 kHz）30分钟，滤过，50℃蒸干，残渣加甲醇定容至2mL，作为对照药材溶液。另取去氢木香内酯对照品、木香烃内酯对照品，加甲醇分别制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国兽药典》2010版二部附录32页）试验，吸取【鉴别】2项下的供试品溶液3μL、对照药材溶液4μL、两种对照品溶液各6μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-甲醇（27：1）的为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

（4）取本品粉末6g，加甲醇50mL，超声处理（功率360 W，频率40 kHz）30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加稀盐酸40mL溶解，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20mL，合并三氯甲烷液，用2%NaOH振摇提取3次，每次20mL，合并碱水液，加盐酸调pH至1～2，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，作为供试品溶液。另取厚朴对照药材1g，加甲醇20mL，密塞，超声处理（功率360 W，频率40 kHz）30分钟，滤过，蒸干，残渣加甲醇定容至2mL，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国兽药典》2010版二部附录32页）试验，吸取上述供试品溶液5μL、对照药材溶液3μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-丙酮（7：2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

【检查】应符合散剂项下有关的各项规定（《中国兽药典》2010二部附录5页）。

【含量测定】 穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、木香烃内酯和去氢木香内酯  的含量照高效液相色谱法《中国兽药典》2010版二部附录34页测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，水为流动相B，按照表5进行梯度洗脱；脱水穿心莲内酯检测波长为254 nm，穿心莲内酯、木香烃内酯、去氢木香内酯均在225 nm下检测。理论塔板数不低于3000。

表5 梯度洗脱表

对照品溶液的制备：分别取穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、木香烃内酯和去氢木香内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含穿心莲内酯50μg、脱水穿心莲内酯50μg、木香烃内酯100μg、去氢木香内酯150μg的混合对照品溶液，即得。

供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品内容物，，约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，超声处理（功率360 W，频率40 kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。本品含木香以木香烃内酯和去氢木香内酯的总量计，每g不得少于2.5mg，含穿心莲以穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的总量计，每g不得少于1.0mg。

综上所述，质量研究采用了与工艺研究一致的指标成分进行控制，处方中全部药材均建立了薄层色谱检验方法，同时穿心莲、木香、厚朴三味主药均建立了高效液相色谱含量测定方法；上述质量研究结果为本品的可控性提供了支持；稳定性研究结果证实了本品的稳定可控性。

实施例3中试工艺

按照实施例1的工艺进行莲香散中试生产，分别称取处方量20倍药材，按莲香散制备工艺进行粉碎、过筛、混合、分装、取样检验，按实施例1的生产工艺中试生产10批产品，并按照实施例2《莲香散质量标准》相关要求进行检测，结果如表6～8所示。

表6 中试结果

表7 中试结果

表8 中试结果

根据以上中试工艺的数据可知，按照中试的方案进行工艺控制，以穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、木香烃内酯、去氢木香内酯为指标，跟踪评价了中试工艺，结果显示，生产工艺流畅，简便可行，成分保留率高，中试产品经检验合格，质量均达到或超过了实验室水平，说明中试放大可行，具有可操作性，能够指导放大生产，其成本控制与普通散剂成本相当。提示该制备工艺合理可行，适于生产。

实施例4 药效学实验研究

本实施例进行本发明药物的药效学实验研究，所有试验数据采用SAS 9.2进行统计学分析，进行方差分析（analysis of variance, ANOVA）或者Kruskal-Wallis秩和检验。数据以均值±标准差（±SD）表示，P<0.05为显著性差异，P<0.01为及显著性差异。

1、实验材料

（1）试验动物：SPF级KM小鼠，体重20±2g，♀♂各半，由广州中医药大学实验动物中心提供，（合格证号SCXK（粤）2013-0002）。分笼常规饲养，饲养温度为25～35℃，湿度为60%，饲以固体饲料，自由饮水。

（2）供试品：

莲香散样品，广州华农大实验兽药有限公司提供，批号：2013030103（按照本发明上述生产工艺制备）。

番泻叶（批号：YPA3A0001，购于广州采芝林药业连锁店）

盐酸洛哌丁胺胶囊，规格：2mg，（批号：130219290，西安杨森制药有限公司）

蓖麻油，天津市福晨化学试剂厂，批号：20130427

盐酸小檗碱片，广东华南药业有限公司，批号：20131214

大肠杆菌O₇₈,购自中国兽医药品监察所。

营养肉汤（批号：20121228）、琼脂粉（批号：20130530）、脑心浸液肉汤BHI（批号：20121020）厂家均为青岛高科园海博生物技术公司

（3）供试品处理：

莲香散水提液的制备：分别取莲香散62.5g，50g，40g，每一份分别加9、6倍量水提取两次，提取时间为1.5h、1h，各次药液滤过，合并后于85℃用旋转蒸发仪浓缩至制成0.625g/ml、0.5g/ml、0.4g/ml的梯度浓度药液，于4℃冰箱保存备用。

番泻叶浸出液的制备：临用前，称取番泻叶10g（过20目筛），用10倍量蒸馏水，于90℃浸泡0.5h，取滤液减压浓缩至0.1g/ml药液。

盐酸洛哌丁胺溶液的制备：称取盐酸洛哌丁胺4mg，加适量蒸馏水，超声溶解后，加蒸馏水配得终浓度为0.1mg/ml药液，于4℃保存备用。

盐酸小檗碱溶液的配制：取盐酸小檗碱片10片（共含盐酸小檗碱1g），加适量蒸馏水，超声溶解后，加蒸馏水配得终浓度为1.5mg/ml药液，于4℃保存备用。

炭末混悬液：称取5g活性炭、1g羧甲基纤维素钠，与100ml蒸馏水混合，充分搅拌后即得。

BHI液体培养基的配制：称取脑心浸液肉汤BHI干粉 3.85g于锥形瓶中，加100mL重蒸馏水，并用涡旋振荡器振荡均匀，高压灭菌后备用。

BHI固体培养基的配制：称取BHI干粉11.55g、琼脂粉4.5g于锥形瓶中，加300mL重蒸馏水涡旋振荡器振荡均匀，高压灭菌后分装于玻璃平板后备用。

（4）仪器设备

循环水真空泵 SHZ－D(Ⅲ）（巩义市予华仪器有限责任公司，最大真空度/Mpa：0.098）；

G&G美国双杰T1000电子天平（常熟市双杰测试仪器厂，产品型号T1000）；

EYELA SB-1000型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；

TC-15型套式加热恒温器（海宁市新华区医疗器械厂）；

高压蒸汽灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司）；

恒温培养箱（池本理化业株式会社）；

空气浴振荡器（哈尔滨市东联电子科技开发有限公司）。

2、莲香散对番泻叶腹泻小鼠的影响实验

（1）实验分组：取20±2g 的KM小鼠60只，♀♂各半，随机分组为空白组、模型组、阳性药组、莲香散高、中、低剂量组，每组10只。

莲香散高、中、低剂量组按0.2mL/10g灌胃相应药液，阳性药组以0.2mL/10g灌胃盐酸洛派丁胺溶液，空白组、模型组给等体积蒸馏水，共给药5d，造模前禁食不禁水过夜，试验当天按照0.2mL/10g体重灌胃番泻叶提取液造模，空白组给等体积蒸馏水，造模30min后各组动物给相应药液。

（2）给药1h后开始观察记录，各组动物单笼观察4h，下铺滤纸作湿便计数，每小时换一次滤纸。记录累计湿便数、湿便级，并计算各组动物腹泻指数。

稀便率：每只动物所排的稀便数/总便数

腹泻指数：稀便率×稀便级

稀便级：表示稀便的程度，以稀便污染纸形成污迹面积(污染直径cm)的大小定级，分为4级，标准级数如下：

表9小鼠稀便级（单位：cm）

（3）实验结果如表10所示

表10莲香散对番泻叶腹泻模型小鼠的影响（n=10，x±s）

结果显示，各莲香散高、中剂量组均可明显降低模型小鼠腹泻指数，具有明显的止泻作用。

3、莲香散对蓖麻油腹泻小鼠的影响实验

按照上述第2项的方法（莲香散对番泻叶腹泻小鼠的影响实验）进行操作，造模试剂给同体积蓖麻油造模。

莲香散对蓖麻油腹泻小鼠的试验结果如表11所示。

表11 莲香散对蓖麻油腹泻模型小鼠的影响（n=10，x±s）

结果显示，各莲香散高、中剂量组均可明显降低模型小鼠腹泻指数，具有明显的止泻作用。

4、莲香散对大肠杆菌O₇₈致腹膜炎的影响

（1）大肠杆菌O₇₈悬液的制备：

取对数生长期的大肠杆菌O₇₈接种于营养琼脂平板，置37℃恒温培养箱培养24h，挑取单个菌落转于营养肉汤中，在恒温水浴振荡器中37℃培养18h，用麦氏比浊管测定菌液浓度，并用生理盐水调整菌液浓度为3.0×10⁸ CFU/mL。将菌液（按动物体重0.01mL/g）与含10% BaSO₄的肉汤按1：1混合，即为造模悬液。

（2）分组：取20±2g 的KM小鼠60只，♀♂各半，随机分组为空白组、模型组、阳性药组、莲香散高、中、低剂量组，每组10只。

莲香散高、中、低剂量组按0.2mL/10g灌胃相应药液，阳性药组以0.2mL/10g灌胃盐酸小檗碱溶液，空白组、模型组给等体积蒸馏水，共给药5d。造模前禁食不禁水过夜，试验当天各组按照0.01mL/g腹腔注射大肠杆菌O₇₈悬液造模，空白组给等体积生理盐水，造模后30min各组动物给相应药液。

（3）给药后开始观察记录各组动物死亡情况，死亡动物进行解剖，共观察1周。

（4）结果如表12所示。

表12莲香散对大肠杆菌型腹膜炎小鼠的影响（n=10）

结果显示，莲香散高、中浓度组可降低大肠杆菌致死率，具有较好的保护作用。

5、莲香散对小鼠肠推进功能的影响

（1）分组：取20±2g 的KM小鼠50只，♀♂各半，随机分组为空白组、阳性药组、莲香散高、中、低剂量组，每组10只。

莲香散高、中、低剂量组按0.2mL/10g灌胃相应药液，空白组给等体积蒸馏水、阳性药组给0.2mL/10g灌胃盐酸洛派丁胺溶液，共给药5d，造模前禁食不禁水过夜，试验当天给药1h后，各组灌胃给5%炭末混悬液0.2mL/10g，20min后处死动物，打开腹腔分离肠系膜，取幽门至回盲部的肠管，测量小肠总长度及炭末推进距离，并计算推进率。

炭末推进率=炭末推进距离/小肠总长度×100%

（2）结果如表13所示。

表13莲香散对小鼠肠推进的影响（n=10，x±s）

注：*：与空白组比较，P＜0.05；**：与空白组比较，P＜0.01。

结果显示，莲香散高、中浓度组均可明显抑制小鼠肠推进功能。

6、综上所述，本试验结果表明，受试药莲香散可以有效的降低大肠杆菌致腹膜炎小鼠的死亡率；同时有效抑制番泻叶及蓖麻油腹泻模型小鼠的腹泻，其中以高、中剂量组为优，还可抑制肠蠕动功能；也为兽药临床试验提供依据，可进一步开发抗大肠杆菌病的中兽药。

实施例5 实验性临床研究

根据《兽用中药、天然药物临床试验技术指导原则》，研究中药莲香散对试验鸡人工感染大肠杆菌病的防治效果与最佳用药剂量，为临床养鸡中常见的鸡大肠杆菌病防治工作中的具体给药方案提供试验数据与科学依据。

1、实验材料

（1）试验动物：1日龄岭南黄商品代肉鸡，购自广东智威农业科技股份有限公司。

（2）试验药品：莲香散：广州华农大实验兽药有限公司提供，批号：2013030102（按照本发明上述生产工艺制备）。

四味穿心莲散，广州华农大实验兽药有限公司提供，批号：2013121301。

（3）试验仪器：恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂生产；无菌操作台，苏州亿达净化实验室设备有限公司生产。

（4）菌种：供试菌株为鸡大肠杆菌O₇₈（购自中国兽医药品监察所，批号：CVCC1569）。

（5）试验动物基础日粮：参照NRC（1994版）肉鸡饲养标准和1998年中国肉鸡饲养标准配制基础日粮，基础日粮中不含药物添加剂。

2、试验菌的制备及计数

将鸡大肠杆菌（O₇₈血清型）接种普通平板，37 ℃培养 24 h 后，挑选典型菌落接种于肉汤中，又经 37℃培养18 h后取出。将此肉汤培养物接种鸡，以求其致病力复壮并能将接种鸡致死。从死鸡的肝脏分离大肠杆菌并接种平板培养，最后挑选典型菌落用普通肉汤培养，采用平板计数法进行菌落计数，将菌液稀释含菌数为2×10⁹cfu/mL，备用。在接种前后观察鸡的临床症状，剖检死亡鸡，取肝脏、脾脏及心脏进行细菌分离培养及鉴定，以确定是否成功诱发疾病。

3、人工感染鸡大肠杆菌病病理模型的建立

将0.2×10⁹cfu/mL～1×10⁹cfu/mL之间的菌液浓度调整为9个浓度组，分别为0.2×10⁹cfu/mL、0.3×10⁹cfu/mL、0.4×10⁹cfu/mL、0.5×10⁹cfu/mL、0.6×10⁹cfu/mL、0.7×10⁹cfu/mL、0.8×10⁹cfu/mL、0.9×10⁹cfu/mL和1×10⁹cfu/mL。每组20只雏鸡，每只鸡各腹腔注射攻毒菌液0.5mL。另设一组为健康对照组。观察攻毒后雏鸡的状态，记录鸡死亡只数。

试验结果显示，以0.6×10⁹cfu/ml和0.7×10⁹cfu/ml，每只鸡腹腔注射0.5ml，可使试验鸡100%发病，呈现典型的鸡大肠杆菌病临床症状，致死率为65%。因此，可以推测实验中大肠杆菌O₇₈株对10日雏鸡人工感染的LD₅₀在0.2～0.6×10⁹cfu/ml之间。在正式攻毒过程中，本试验选择浓度为0.6×10⁹cfu/ml的0.6ml大肠杆菌菌液作为建立鸡大肠杆菌感染模型的攻毒剂量。

4、试验动物分组与处理

试验分组处理情况见表14。将150只1日龄试验鸡，饲养至10日龄时，选取120只健康体重相近试验鸡，随机分为6组，每组20只。第1～3组为受试药物组（感染，受试药物治疗），其中第1组为低剂量（0.5%莲香散）治疗组，第2组为中剂量（1%莲香散）治疗组，第3组为高剂量（2%莲香散）治疗组，第4组为对照药物组（感染，给0.5%四味穿心莲散对照药物），第5组为感染对照组（感染，不给药），第6组为健康对照组（不感染，不给药）并与第1-5组隔离饲养。给第1～5组的每只试验鸡接种鸡大肠杆菌（O₇₈血清型）肉汤菌液0.6 ml/只，第6组注射等量生理盐水。攻毒之后即按表1进行处理投药，第1-4组连续投药7 d，观察至接种后14 d。在试验期间试验鸡自由采食、饮水，并按常规程序进行疫病免疫、卫生清理与消毒。

表14 试验分组与处理情况

5、试验期间主要检测指标及结果

试验数据用（平均值±标准差）表示，并应用 SPSS统计分析软件进行统计分析与处理。

（1）人工诱发肉鸡大肠杆菌病后试验鸡临床生长与发病状况等

在试验期间每天上午、下午仔细观察试验鸡采食、饮水、腹泻等临床表现情况并做详细记录，并记录试验鸡死亡时间与数量，对死亡试验鸡进行病理解剖与细菌分离培养。

试验结果显示，除第6组之外的其他5个感染组试验鸡在攻毒 6 h 后开始发病，表现为精神不振、被毛脏乱、逆立，扎堆、缩颈、翅膀下垂、排黄白稀粪，饮食欲减退。剖检死亡鸡，观察内脏病变，主要表现为肝周炎和心包炎，肝脏肿大、充血，严重者肝脏表面有纤维状渗出物，气囊增厚、混浊，肝包膜增厚并有出血点或出血条带，心包膜增厚，小肠黏膜有出血点。从肝脏、脾脏及心脏均分离出大量典型的大肠杆菌。

试验结果表明，通过试验鸡临床症状、细菌分离培养等试验，确定在本试验中成功诱发鸡大肠杆菌病。

（2）莲香散对试验鸡大肠杆菌病的疗效观察

试验期间记录试验鸡在发病之后经药物治疗之后的恢复情况，记录与计算试验鸡的发病率、死亡率、治愈率、有效率、无效率。

死亡率：在试验期间，发病动物出现鸡大肠杆菌病的典型症状并死亡，尸体剖检有典型鸡大肠杆菌病的病变特征，并从肝、脾及心脏中分离培养出鸡大肠杆菌，判定为感染死亡，并根据死亡数量计算死亡率。

治愈率：在试验期间，发病动物经给药后精神状态、食欲恢复正常，不再出现拉稀粪等临床症状均属治愈，并根据治愈数量计算治愈率。

有效率：在试验期间，发病动物经给药后其临床症状有明显减轻者，判断为有效，并根据其数量计算有效率。

无效率：在试验期间，发病动物经给药后其临床症状未见明显改善，甚至有所加重者，判断为无效，并根据其数量计算有效率。

中药莲香散对人工感染鸡大肠杆菌病试验肉鸡的治疗结果如表15所示。

表15各组试验鸡死亡时间与只数统计（单位：只）

试验结果显示，在接种鸡大肠杆菌后约6 h，全部试验鸡出现临床症状，发病率为100%，在经过使用不同剂量中药散剂治疗7 d之后，各试验组鸡死亡时间及只数见表15。结果显示，在试验前4 d 是试验鸡死亡最集中时间，特别是第5组（感染对照组）试验鸡死亡数13只中有12只均集中在前4 d，占死亡总数的90%以上；而第1～4组（感染，治疗）在前4 d 死亡只数占总死亡数的约70%。同时，在试验期的第8d后，各试验组均未出现死亡鸡。

具体疗效数据统计结果如表16所示。

表16莲香散对试验鸡大肠杆菌病的疗效

注：#表示未投药的感染对照组试验鸡自己对疾病耐过情况。

试验结果显示（见表8），第6组（健康对照组）试验鸡发病率为与死亡率均为0%，第5组（感染对照组）试验鸡死亡率为65%，明显高于第1～4组（感染，治疗组）的死亡率（见表3）；其中，第2、3组（1%莲香散、2%莲香散）的死亡率均低于第1、4组（0.5%莲香散、四味穿心莲散）。第5组试验鸡无效率均明显高于第1～4组；第5组（感染对照组）试验鸡自愈率为15%，均明显低于第1～4组（感染，治疗组），其中，第2、3组（1%莲香散、2%莲香散）的治愈率与有效率均高于第1、4组（0.5%莲香散、四味穿心莲散）。

试验结果表明，当在试验鸡基础日粮中分别添加莲香散、四味穿心莲散，均能显著降低人工感染鸡大肠杆菌试验鸡的死亡率，并能提高其治愈率与有效率；同时，在添加1%莲香散、2%莲香散时对感染鸡的疗效最佳。

（3）试验鸡增重情况

在试验开始与结束时，对试验鸡逐只称重，计算各组试验鸡平均体重。

各组药物对试验鸡体重的影响如表17所示。

表17 各组试验鸡在试验结束后体重情况

注：同一列内不同大写字母间差异极显著（p<0.01），不同小写字母间差异显著（p<0.05）。

试验结果显示，在试验开始时，各试验组鸡平均体重无差异（96±1g），在试验结束计算存活试验鸡体重时发现，全部感染组试验鸡体重均显著低于第6组（健康对照组）；其中，第1～4组（感染，治疗组）试验鸡体重显著高于第5组（感染对照组）。

试验结果表明，当在试验鸡基础日粮中分别添加莲香散、四味穿心莲散，均具有促进人工感染鸡大肠杆菌试验鸡耐过与更好恢复的功效，并能改善试验鸡的生长状况；其中，第2、3组（1%莲香散、2%莲香散）的效果优于第1、4组（0.5%莲香散、四味穿心莲散）。

（4）解剖检查

在试验结束后，从各试验组随机取各组试验鸡进行剖解，并记录相关解剖数据。

试验结果显示，感染并经药物治疗后存活试验鸡的肝脏、心脏、心包、小肠等未见明显的病变或者有轻微的病变；而感染但未经治疗的第5组试验鸡的肝脏、心脏、肾脏、小肠等均出现较明显的病变。

试验结果表明，当在试验鸡基础日粮中分别添加莲香散、四味穿心莲散，均能促进人工感染鸡大肠杆菌试验鸡更好恢复，并能减轻试验鸡组织病变的功效。

6、在本试验中，通过人工诱发试验鸡大肠杆菌病，并观察了莲香散（高、中、低剂量）、四味穿心莲散对感染鸡的疗效，主要考察指标包括：试验鸡临床症状表现情况，发病率、死亡率、治愈率、有效率与无效率，以及试验鸡在试验前后的平均体重，存活试验鸡剖解病理变化等相关指标。

试验结果显示，本试验成功诱发鸡大肠杆菌病，发病鸡主要表现为精神不振、被毛脏乱、逆立，扎堆、缩颈、翅膀下垂、排黄白稀粪，饮食欲减退。剖检死亡鸡，观察内脏病变，主要表现为肝周炎和心包炎，心包膜增厚，小肠黏膜有出血点等主要病理变化，并从肝脏、脾脏及心脏均分离出大量典型的大肠杆菌。

当在试验鸡基础日粮中分别添加莲香散（高、中、低剂量）、四味穿心莲散，所有中药散剂均能明显降低人工感染鸡大肠杆菌试验鸡的死亡率，并能提高其治愈率与有效率，减轻试验鸡主要脏器病变，促进试验鸡耐过与更好恢复健康达到治愈，改善试验鸡的生长状况，增加体重等功效。同时，对比试验结果表明，在添加1%莲香散、2%莲香散时对人工感染鸡大肠杆菌试验鸡的疗效优于0.5%莲香散与四味穿心莲散。

综上所述，本试验结果表明，当在基础日粮中添加莲香散时，能显著降低人工感染鸡大肠杆菌试验鸡的死亡率，并能提高其治愈率与有效率，促进试验鸡耐过与更好恢复，减轻试验鸡主要脏器的组织病变，与改善试验鸡的生长状况。对比试验结果表明，当在基础日粮中分别添加1% 莲香散、2% 莲香散时，对感染鸡的疗效均优于添加0.5% 莲香散与四味穿莲散。

实施例6 扩大临床试验

根据《兽用中药、天然药物临床试验技术指导原则》，研究中药莲香散对临床上鸡大肠杆菌自然病例的防治效果与最佳用药剂量，为临床养鸡中常见的鸡大肠杆菌病防治工作中的具体给药方案提供试验数据与科学依据。

1、实验材料

（1）试验动物：28～35周龄罗曼蛋鸡，广东省云浮市：罗定市原始蛋鸡养殖有限公司。

（2）试验药品：莲香散：广州华农大实验兽药有限公司提供，批号：2013030102（按照本发明上述生产工艺制备）。

四味穿心莲散，广州华农大实验兽药有限公司提供，批号：2013121301。

（3）试验仪器：恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂生产）；无菌操作台（苏州亿达净化实验室设备有限公司生产）。

（4）试验动物基础日粮：参照 NRC(1994)产蛋鸡营养需要标准配制基础日粮，日粮中不含药物添加剂。

2、临床养殖中蛋鸡输卵管炎型大肠杆菌自然病例的选取和确诊

在罗定市原始蛋鸡养殖有限公司生江蛋鸡养殖场，选取临床上表现出精神委顿，排褐色或白色粪便污染肛门，日渐消瘦，产蛋下降或停止，产畸形蛋，蛋壳颜色变淡与易碎等临床症状的病鸡。进行病理剖检可见：卵泡膜变形、充血与出血，有的卵泡呈灰褐色；输卵管粘膜充血，肿胀，输卵管变粗，质地变脆，糜烂变薄，内有黄白色干酪样物质及其他分泌物。

进行实验室细菌分离培养：取输卵管内干酪样团块病料在营养琼脂平板上划线，37 ℃恒温培养 24 小时，呈现一种形态均一的菌落生长，特征为圆形凸起、边缘整齐、光滑湿润、无色半透明与直径1～2 mm。其纯培养物接种伊红美蓝琼脂平板，菌落呈紫黑色、带金属光泽；接麦康凯琼脂平板，菌落呈亮红色。

根据以上的临床症状、剖解病理变化与实验室细菌分享培养与鉴定，确诊病鸡为大肠杆菌引起的蛋鸡输卵管炎症。

3、试验动物分组与处理

试验分组处理情况见表18。选取患有输卵管炎型大肠杆菌病的蛋鸡100只，随机分为2组，每组50只。第1组为莲香散治疗组，第2组对照药物治疗组（四味穿心莲散）。并按表1中所述进行处理，连续投药7 d，观察至用药后14 d。试验期间试验鸡自由采食、饮水，并按常规程序进行疫病免疫、卫生清理与消毒。

表18 试验分组与给药情况

4、试验检测指标和结果

试验数据用（平均值±标准差）表示，并应用 SPSS统计分析软件进行统计分析与处理。

（1）试验蛋鸡经中药治疗后临床表现

在试验期间每天上午、下午仔细观察试验鸡采食、饮水、腹泻等临床表现并做详细记录，记录试验鸡死亡时间与数量，对死亡鸡进行病理解剖与细菌分离培养。本试验中输卵管炎型大肠杆菌病自然发病蛋鸡分别经中药散剂莲香散、四味穿心莲治疗7d并观察到14d。

试验结果显示，随着中药治疗时间的延长，蛋鸡精神有所恢复、拉稀症状逐渐减轻、饮欲增加，特别是产蛋性能逐渐改善，死亡逐渐停止等。

通过对死亡病鸡进行病理剖检可见：卵泡膜变形、充血与出血，有的卵泡呈灰褐色；输卵管粘膜充血，肿胀，输卵管变粗，质地变脆，糜烂变薄，内有黄白色干酪样物质及其他分泌物。同时进行实验室细菌分离培养：取输卵管内干酪样团块病料在营养琼脂平板上划线，37 ℃恒温培养 24 小时，呈现一种形态均一的菌落生长，特征为圆形凸起、边缘整齐、光滑湿润、无色半透明与直径1～2 mm。其纯培养物接种伊红美蓝琼脂平板，菌落呈紫黑色、带金属光泽；接麦康凯琼脂平板，菌落呈亮红色。根据发病蛋鸡临床症状、剖解病理变化与实验室细菌分享培养与鉴定，确诊蛋鸡为大肠杆菌引起的蛋鸡输卵管炎症导致的死亡。

试验结果表明，中药散剂莲香散、四味穿心莲均具有改善大肠杆菌引起的蛋鸡输卵管炎型症的临床症状，促进病鸡恢复健康。

（2）药物疗效

试验期间记录发病试验鸡在经药物治疗之后的恢复情况，并计算死亡率、治愈率、有效率、无效率。

死亡率：在试验期间，发病动物出现典型的鸡输卵管炎大肠杆菌病临床症状并死亡，病理剖检发现：卵泡膜变形、充血与出血，有的卵泡呈灰褐色；输卵管粘膜充血、瘀血，糜烂变薄，质地变脆，内有淡黄色蛋白沉着物；并从输卵管内干酪样团块病料分离出大量典型的大肠杆菌，并根据死亡数量计算死亡率。

治愈率：在试验期间，发病动物经给药后精神状态、食欲、产蛋等均恢复正常者属治愈，并根据其数量计算治愈率。

有效率：在试验期间，发病动物经给药后其临床症状有明显减轻者，判断为有效，并根据其数量计算有效率。

无效率：在试验期间，发病动物经给药后其临床症状未见明显改善，甚至有所加重者，判断为无效，并根据其数量计算有效率。

各组中药对发病试验鸡的疗效结果如表19、20所示。

表19 各组试验鸡死亡时间统计（单位：只）

试验结果显示，第1、2试验组蛋鸡在经中药治疗7d（试验观察到治疗后14d）之后，在试验前期（10d）一直有死亡鸡出现，但第11～14d 期间试验鸡停止死亡，其中第1组（莲香散治疗组）在试验期间共死亡5只（10%），第2组（四味穿心莲散治疗组）在整个试验期间共死亡6只（12%）。

试验结果表明，输卵管炎型大肠杆菌病自然发病蛋鸡在经中药治疗7d 之后，试验鸡病情均有所好转，死亡减少。

表20莲香散对试验鸡大肠杆菌病的疗效

试验结果显示，第1、2试验组蛋鸡在经中药治疗7d后，整个试验观察期内，莲香散治疗组死亡率为10%，四味穿心莲散治疗组死亡率为12%；莲香散治疗组治愈率为52%，治愈率加有效率为82%；四味穿心莲散治疗组治愈率达48%，治愈率加有效率为76%。

试验结果表明，输卵管炎型大肠杆菌病自然发病蛋鸡在经中药治疗7d并观察到14d，试验鸡病情均有所好转，死亡减少，部分试验鸡达到治愈标准，表明莲香散对大肠杆菌病均具治疗作用。

（3）试验鸡产蛋率与蛋品质变化情况

计算各组试验蛋鸡每天产蛋数量、并计算试验期产蛋率等，同时计算各组试验蛋鸡每天蛋平均重、畸形蛋率、软壳破壳蛋率等。

结果如表21所示。

表21 中药对试验鸡产蛋率与蛋品质的影响

注：试验结果分为1～7d，8～14d两个试验阶段进行统计。

试验结果显示，试验组蛋鸡在经中药治疗7d作为一个统计阶段，停药后8～14 d 再作为第二个统计阶段，详细结果见表 12。统计结果显示，第1、2试验组蛋鸡在8～14 d 阶段的蛋产率均明显高于第1～7d，同时蛋平均重也略高于第1～7 d，而鸡蛋的软壳破壳率与畸形率均低于第第1～7 d，对比试验结果显示，第1组（莲香散治疗组）综合效果优于第2组（四味穿心莲散）。

试验结果表明，输卵管炎型大肠杆菌病自然发病蛋鸡在经中药治疗7d并观察到第14d，试验鸡的产蛋率有明显的上升，蛋品质也有所改善，表明两个中药散剂均具有治疗与改善蛋鸡输卵管炎症的功效。

5、本次临床扩大试验地点选在广东省云浮罗定市原始蛋鸡养殖有限公司生江蛋鸡养殖场，由于广东省云浮罗定市地处我国华南地区比较炎热的地方，夏季时间长，尤其是每年6～9月份（特别是7～8月份）在饲养过程常出现的细菌性疾病，特别是由大肠杆菌导致的蛋鸡输卵管炎症长期以来一直影响养殖的效益提高。

本试验选在2014年7月至8月，属于蛋鸡养殖场在一年时间中出现由大肠杆菌导致的蛋鸡输卵管炎症高发时期。在本试验中，通过发病蛋鸡临床症状、典型的剖解病理变化及细菌分离培养与鉴定等方法，筛选出100只由大肠杆菌导致的蛋鸡输卵管炎症自然发病蛋鸡，并随机分为2组，第1组（莲香散）与第2组（四味穿心莲散）每组50只试验鸡。通过药物治疗7d，并观察14d，主要考察指标包括：蛋鸡临床症状表现、死亡率、治愈率与有效率，以及试验鸡的产蛋率、蛋品质等指标。

试验结果显示，输卵管炎型大肠杆菌病自然发病蛋鸡在分别经中药莲香散、四味穿心莲散治疗7d并观察到第14d，随着中药治疗时间的延长，自然发病试验蛋鸡精神逐渐恢复、拉稀症状不断减轻、饮欲增加，死亡逐渐停止，产蛋率不断提高、蛋品质有所改善，并在试验结束时间均有大约50% 蛋鸡被治愈，综合评价结果显示，中药莲香散优于四味穿心莲散。

综上所述，本试验结果表明，在云浮等华南地区，在蛋鸡基础日粮中添加莲香散、四味穿心莲均具有改善蛋鸡输卵管炎症（由大肠杆菌导致）的临床症状，降低蛋鸡死亡率，提高蛋鸡产蛋率与改善鸡蛋品质，促进病鸡耐过与逐渐恢复健康并达到治愈标准，综合评价结果显示，中药莲香散优于四味穿心莲散。

另外，靶动物安全试验、实验性临床试验和扩大临床试验均结果表明，在基础日粮中添加受试药品莲香散，用于防治鸡大肠杆菌病是安全、有效的。推荐临床用量为每100公斤饲料中添加1000 g受试药品莲香散，连续用药7 d。

对比例

1、莲香散处方选择

（1）按照实施例4的方法进行试验，对莲香散的处方进行选择：

对比组1：穿心莲。

对比组2：穿心莲、路边青。

（2）按照实施例4的指标进行检测，结果对比显示，对比组1和2均有一定的抑制大肠杆菌的作用，能够对大肠杆菌型腹膜炎小鼠有一定的治疗效果；但是与本发明的配方（：穿心莲16.7%、苍术25%、木香16.7%、厚朴16.6%、干姜25%）相比较，对比组1和2的配方对大肠杆菌型腹膜炎的防效显著低于本发明的配方。

而且，对比组1和2的配方对蓖麻油和番泻叶引起的腹泻并没有明显的疗效，也没有明显的推进小鼠肠功能的作用。在实际工作中，鸡大肠杆菌并的治疗时受许多因素的影响的，并不是单纯的抑制大肠杆菌就能够完美实现的。因此，综合考虑各因素条件，本发明的配方（：穿心莲16.7%、苍术25%、木香16.7%、厚朴16.6%、干姜25%）是治疗大肠杆菌病最佳的中药配方。

2、莲香散处方配比选择

按照实施例4的方法和指标进行试验，对莲香散处方的配比进行优化，经过实验结果对比，综合考虑各方面因素，本发明中兽药复方制剂中各组分的百分含量为如下配比时：5～55%穿心莲、10～65%苍术、5～55%木香、5～55%厚朴、10～65 %干姜，可达到较好的防治鸡大肠杆菌病的效果。而且最佳配比为：穿心莲16.7%、苍术25%、木香16.7%、厚朴16.6%、干姜25%，且用药最佳剂量为1%。

3、莲香散适用地区的考察

为了考察实际应用时，本发明所述莲香散的地区适用性，我们还在河南地区某养鸡场也做了临床研究实验，具体方法同实施例6。

考察结果显示，与实施例6在罗定市养鸡场应用结果相比，在河南的该养鸡场应用时，莲香散对于鸡大肠杆菌的治疗效果有明显的降低，我们分析这可能是由于南北气候的差异造成的。

但是在与上述对比组1（穿心莲）和对比组2（穿心莲、路边青）的疗效相比，在河南的该养鸡场应用时，莲香散对于鸡大肠杆菌病的治疗效果仍然具有一定的优势。因此，综合来看，本发明的莲香散对于鸡大肠杆菌病具有显著的疗效，尤其适用于我们南方地区等亚热带气候地区。