一种用于生产多黏菌素B的发酵培养基及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种用于生产多黏菌素B的发酵培养基及其制备方法和用途。以培养基的总重量计，所述的培养基含有0.1-1.5w/w%有机氮源、5.0-15.0w/w%全麦粉和0.3-1.2w/w%无机盐。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域；尤其涉及一种发酵培养基及其制备方法和用 途。

背景技术

多黏菌素B（Polymyxin B，PMB）是由多黏芽孢杆菌或多黏类芽孢杆菌产 生的一种的碱性环肽类抗生素，具有良好的抗革兰氏阴性菌活性。多黏菌素B 的药品包括硫酸多黏菌素B注射剂以及硫酸多黏菌素B与其他抗生素的复方外 用制剂，用来治疗革兰氏阴性菌引起的皮肤创面、腹膜炎、泌尿系统以及呼吸 系统等部位的感染；PMB还可以显著抑制内毒素诱导的急性期反应，因此也可 用于败血症。

目前多黏菌素B的制备采用发酵法，多黏芽孢杆菌或多黏类芽孢杆菌经过 种子培养后，接种在发酵罐中培养并产生多黏菌素B，再经后续的分离纯化得 到高纯度的产品。发酵培养过程中培养基配方对产量有很大的影响。现有报道 涉及的相关培养基配方存在发酵产量不高的问题。

因此，本领域迫切需要提供一种高产多黏菌素B的发酵培养基。

发明内容

本发明旨在提供一种发酵培养基。

本发明的另一个目的是提供上述发酵培养基的制备方法。

本发明的再一个目的是提供上述发酵培养基的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种用于生产多黏菌素B的发酵培养基，以培 养基的总重量计，所述的培养基含有0.1-1.5w/w%有机氮源、5.0-15.0w/w%全麦粉 和0.3-1.2w/w%无机盐。

在另一优选例中，所述的有机氮源选自下述的一种或一种以上：蛋白胨、酵 母抽提物、黄豆粉或玉米浆粉；更佳地，所述有机氮源选自黄豆粉或玉米浆粉。

所述无机盐选自下述的一种或一种以上：磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸镁、硫 酸锌或碳酸钙；更佳地，所述无机盐为硫酸铵或硫酸铵和选自下述的一种或一种以 上物质的混合：磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌或碳酸钙。

在另一优选例中，所述全麦粉的含量为7.0-13.0w/w%。

在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的发酵培养基的制 备方法，所述的方法包括步骤：

（1）以培养基的总重量计，将0.1-1.5w/w%有机氮源、5.0-15.0w/w%全麦粉 和0.3-1.2w/w%无机盐混合得到混合物1；

（2）将淀粉酶作用于经糊化或未经糊化的混合物1（优选糊化），得到如上 所述的本发明提供的发酵培养基。

在另一优选例中，所述淀粉酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶或异 淀粉酶；更优选α-淀粉酶。

在另一优选例中，以全麦粉的重量计，所述淀粉酶的用量为2-1500U/g；更优 选为2-1000U/g。

在另一优选例中，所述淀粉酶的作用温度为50-80℃。

在另一优选例中，所述淀粉酶的作用时间为2-40分钟；更优选为5-20分钟。

在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明提供的发酵培养基的用 途，用于培养多黏芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)或多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus  polymyxa)以生产多黏菌素B。

据此，本发明提供了一种使发酵产物多黏菌素B产量高的发酵培养基。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现如果采用较高浓度的全麦粉作 为培养基组分，并且在灭菌前用淀粉酶处理的已糊化后的发酵培养基，可以较 大的提高多黏菌素B的产量。在此基础上，完成了本发明。

定义

如本文所用，“全麦粉”是指整粒小麦包含了麸皮与胚芽全部磨成的粉。 即整粒小麦在磨粉时，仅仅经过碾碎，而不需经过除去麸皮程序。

如本文所用，“糊化”是指淀粉颗粒受热后，在一定温度范围内，淀粉粒开 始破坏，晶体结构消失，体积膨大，粘度急剧上升，呈粘稠的糊状。

在本发明中，经过淀粉酶作用后的培养基，其中的淀粉变成了糊精和麦芽糖， 糖链由长变短，麦芽糖会增加，培养基黏度下降。

如本文所用，“黄豆粉”可以使用本领域熟知的方法经榨油工艺生产，例 如但不限于，黄豆（大豆）经压榨脱油后的残饼，液压榨油后为圆饼状，螺旋 榨油后为薄片状；为坚硬的块状物，一般先打碎后再粉碎。也可以通过商业渠 道获得，例如但不限于购自（石家庄兴柏生物工程有限公司）。

如本文所用，“玉米浆粉”是指以鲜玉米浆为原料经低温瞬间加热喷雾干 燥而成，其水溶性蛋白质保存完好，保持了玉米浆液的所有特性。可以使用本 领域熟知的方法制备得到，也可以通过商业渠道获得，例如但不限于购自（邹 平西王生物工程有限公司）。

本发明涉及的多黏菌素B其结构如式I所示：

其中涉及的各组分的结构差异参见表1

多黏菌素B各组分 FA X B1 6-MOA L-Leu B1-I 6-MOA L-Ile B2 6-MHA L-Leu B3 OA L-Leu

注：MOA-6甲基辛酸、MHA-异辛酸（或甲基庚酸）、OA-辛酸、Leu-亮氨酸、Ile- 异亮氨酸。

发酵培养基

本发明提供的发酵培养基是用于培养多黏类芽孢杆菌或多黏类芽孢杆菌 的培养基，以所述的培养基的总重量计，其中包含0.1－1.5w/w%有机氮源、5.0 －15.0w/w%全麦粉和0.3-1.2w/w%无机盐。

所述培养基中有机氮源选自下述的一种或一种以上：蛋白胨、酵母抽提物、 黄豆粉、玉米浆粉，其中优选为黄豆粉或玉米浆粉，培养基中有机氮源的用量 较佳为0.3－1.2w/w%，最佳为0.5－1.2w/w%；所述培养基中无机盐包括硫 酸铵，其它选自下述的一种或一种以上：磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌、碳酸 钙，其中优选磷酸二氢钾和碳酸钙，较佳地，培养基中无机盐的含量分别为 0.3-1.0w/w%硫酸铵、0.01-0.08w/w%磷酸二氢钾和0.01-0.1w/w%碳酸钙；培养 基中硫酸铵的含量更佳地为0.7－1.0%；培养基的磷酸二氢钾的含量更佳地为 0.01－0.04w/w%；培养基中的全麦粉的含量较佳为7.0－13.0w/w%，最佳为 8.0－11.0w/w%。

本发明采用的培养菌株为多黏类芽孢杆菌，优选保藏号为ATCC10401的 Paenibacillus polymyxa；多黏芽孢杆菌保藏号为NRRL B-719的Bacillus  polymyxa。

发酵培养基的制备方法

本发明提供的培养基，在灭菌前用淀粉酶处理。

具体地，本发明提供的发酵培养基的制备方法包括以下步骤：

第一步，根据上述配方将有机氮源、全麦粉、无机盐和水混合，得到混合 物1；

第二步，将淀粉酶作用于经糊化或未经糊化的混合物1，得到本发明提供的发 酵培养基。

上述方法中涉及的淀粉酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶或异 淀粉酶；优选α-淀粉酶；以第一步中投入的全麦粉的重量计，所述淀粉酶的用 量为2-1500U/g；优选为2-1000U/g，更优选为100-1000U/g；所述淀粉酶的作 用温度为50-80℃，作用时间为10-60分钟；优选为20-40分钟。

上述方法的第二步中，优选将淀粉酶作用于经糊化的混合物1。

在本发明的实施例中，淀粉酶作用后的培养基在121℃高温灭菌20分钟。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所 揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何 可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特 征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明提供的培养基提高了多黏菌素B发酵产量，且降低了发酵液的 黏度，方便后处理。

2、采用本发明提供的培养基，多黏菌素B发酵产量高于1.90g/L。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所 有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是 指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

以下实施例中，多黏菌素B产量的测定方法参照文献（田东,袁其朋,孙 新晓,等.响应面法优化多粘菌素B的发酵条件[J].中国农学通报,2010, 26(15):53-57）

以下实施例中使用的全麦粉购自（潍坊风筝面粉有限责任公司）

以下实施例中使用的玉米浆粉购自（邹平西王生物工程有限公司）

以下实施例中使用的黄豆粉购自（石家庄兴柏生物工程有限公司）

以下实施例中使用的多黏芽孢杆菌（Bacillus polymyxa NRRL B-719）购自 美国农业研究菌种保藏中心。

以下实施例中使用的多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa  ATCC10401）购自美国菌种保藏中心。

以下实施例中使用的BF7658α-淀粉酶购自邢台万达生物工程有限公司

以下实施例中使用的β-淀粉酶购自山东安克生物工程有限公司

以下实施例中使用的葡萄糖淀粉酶购自山东隆大生物工程有限公司

以下实施例中使用的异淀粉酶购自丹麦Novo公司

实施例1

培养菌株：多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa ATCC10401）

种子培养基/%：玉米浆2.0；葡萄糖5.0；硫酸铵0.4；氯化钠0.1；碳酸钙0.3； pH6.8～7.0。

发酵培养基/%：全麦粉8.0；玉米浆粉0.4；硫酸铵0.9；磷酸二氢钾0.03； 碳酸钙0.03。

将发酵培养基进行糊化，加入BF7658α-淀粉酶（邢台万达生物工程有限 公司），淀粉酶加量100U/g，在50℃—80℃下,作用30min；之后121℃高温灭 菌20min。

培养方法：将斜面保藏的菌种接种至种子培养基中，28℃培养18h。以4% 接种量接入18L上述发酵培养基中（发酵罐全容积35L），搅拌速度400r/min， 在50kPa罐压下，通气量为1.2vvm,30℃培养48h。

多黏菌素B含量测定，参照文献（田东,袁其朋,孙新晓,等.响应面法优 化多粘菌素B的发酵条件[J].中国农学通报,2010,26(15):53-57.）

经检测，在上述培养基条件下多黏菌素B产量为3.22g/L。

实施例2

其它操作同实施例1，不同之处在于出发菌株是NRRL B-719。经检测，培 养得到的多黏菌素B产量为3.14g/L。

实施例3-14

其它操作同实施例1，不同之处在于全麦粉含量。经检测，培养得到的多 黏菌素B产量分别如表2所示：

实施例 全麦粉含量（w/w%） 多黏菌素B产量（g/L） 3 5 1.90 4 6 2.73 5 6.6 2.82 6 7 2.90 7 8 3.22 8 9 3.18 9 10 3.14

10 11 3.11 11 12 3.07 12 13 3.04 13 14 2.95 14 15 2.56

实施例15

其它操作同实施例1，不同之处在于发酵培养基为全麦粉8.0%、黄豆粉 1.0%、硫酸铵0.3%、磷酸二氢钾0.06%和碳酸钙0.1%，经检测，培养得到的 多黏菌素B产量为2.90g/L。

实施例16

其它操作同实施例1，不同之处在于全麦粉含量为8.0%，加入β-淀粉酶， 经检测，培养得到的多黏菌素B产量为2.43g/L。

实施例17

其它操作同实施例1，不同之处在于全麦粉含量为8.0%，加入葡萄糖淀粉 酶，经检测，培养得到的多黏菌素B产量为2.21g/L。

实施例18

其它操作同实施例1，不同之处在于全麦粉含量为8.0%，加入异淀粉酶， 经检测，培养得到的多黏菌素B产量为1.97g/L。

实施例19

其它操作同实施例1，不同之处在于全麦粉含量为8.0%，加入α-淀粉酶含 量为2U/g，经检测，培养得到的多黏菌素B产量为1.99g/L。

实施例20

其它操作同实施例1，不同之处在于全麦粉含量为8.0%，加入α-淀粉酶含 量1000U/g，经检测，培养得到的多黏菌素B产量为3.08g/L。

实施例21

其它操作同实施例1，不同之处在于培养基未经糊化直接加入淀粉酶灭菌 消毒。经检测，培养得到的多黏菌素B产量为2.27g/L。

实施例22

其它操作同实施例1，不同之处在于培养基不添加磷酸二氢钾、硫酸镁和 硫酸锌。经检测，培养得到的多黏菌素B产量为2.83g/L。

对比例1

按照文献（Anand,H.，Guduri,B，et al.Process for the preparation of  Polymyxin B employing Bacillus polymyxa【P】US8,119,371,B2Feb.21,2012。） 中配制培养基和培养方法。发酵结束后，取发酵液200mL，用中速滤纸减压过 滤，用时18min。

对比例2

操作同实施例1，取发酵液200ml与对比例1的过滤条件相同，过滤用时 10min。

对比例1与对比例2说明，在本发明培养基能降低发酵结束后发酵液的黏 度，使培养基固液分离速度更快。

对比例3

按照文献（Anand,H.，Guduri,B et al.Process for the preparation of  Polymyxin B employing Bacillus polymyxa【P】US8,119,371,B2 Feb.21,2012。）中配制培养基和培养方法（参见此文献实施例1）。多黏菌素 B发酵产量1.77g/L。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术 内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任 何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相 同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。