银鲫鱼背鳍细胞系

摘要

本发明涉及银鲫鱼背鳍细胞系，所述的银鲫鱼背鳍细胞系银鲫鱼的背鳍经过原代培养、传代培养得到的，所用的细胞培养液为M199培养基制得。本发明还提供该银鲫鱼背鳍细胞系的构建方法和应用。其优点表现在：本发明建立的银鲫鱼背鳍细胞系可以连续传代，能提供大量的银鲫鱼背鳍细胞系。该细胞系可以直接应用于银鲫鱼免疫相关功能基因的研究，对于银鲫鱼的病毒感染实验可以应用细胞系，节约了大量的人力，物力且效果较好。银鲫鱼背鳍细胞系可以反复冻融，可应用于细胞生物学、病毒学、毒理学、分子生物学、遗传学和免疫学等重要研究。

说明书

技术领域

本发明涉及生命科学技术领域，具体地说，是银鲫鱼背鳍细胞系。

背景技术

银鲫鱼(C.auratus gibelio)隶属于鲤型目(Percoiformes)、鲤科(Sparidae)、 鲫属(Carassius)，C.auratus的亚种。分布于我国的鲫鱼包括黑鲫、鲫和银鲫， 其中鲫的染色体数为100，属二倍体，银鲫染色体数为150±，属三倍体。银鲫 鱼个体具有生长快，抗病性强等良好的经济性状，是我国主要的饲养的淡水养 殖品种。

细胞培养技术是生命科学领域，细胞工程、基因工程和生物医学工程主要 的研究手段。鱼类细胞系的构建为鱼类病毒性疾病的病原学研究和病毒的疫苗 研究提供了基础的生物学材料具有重要的研究价值。通过细胞株来鉴定和分离 敏感病毒株是世界动物卫生组织Office International Des Epizooties(OIE)推荐 的最有效方法，这些细胞系为鱼类病毒学、免疫学、细胞学等方面的研究提供 了良好的实验材料。

Wolf和Quimby在20世纪60年代建立了世界上第一株鱼类细胞系，即虹 鳟鱼生殖腺细胞系RTG-2。目前，已经报道的鱼类细胞系有300余种(Lakra W  S,Swaminathan T R,Joy K P.Development,characterization,conservation and  storage of fish cell lines:a review[J].Fish Physiology and Biochemistry,2011, 37(1):1-20)。其中已经报道的鲫鱼的细胞株主要有异育银鲫细胞系(Isogeneic  ginbuna crucian carp,Lake Suwa)(Hasegawa S,Nakayasu C,Okamoto N,et al. Fin cell line from isogeneic ginbuna crucian carp[J].In Vitro Cellular& Developmental Biology-Animal,1997,33(4):232-233.)，锦鲤鳍条细胞系(肖艺， 曾令兵，徐进，等.锦鲤鳍条组织细胞系的建立及其生物学特性[J].中国细胞 生物学学报,2012,34(8):767-774.)，鲫鱼异倍体细胞系(陈敏容,陈宏溪,易 詠兰.鲫鱼异倍体细胞系的建立及生物学特性[J].1985.)，鲫鱼腮盖膜细胞系 (HCC-87)(李亚男,张义,毛树坚.两株鱼类细胞系-草鱼尾鳍组织细胞系 (HGC-87)及鲫鱼腮盖膜细胞系(HCC-87)的建立[J].毛树坚.生命科学论文 集,1992:112-119.)。目前尚无关于建立银鲫鱼背鳍细胞系的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种银鲫鱼背鳍细胞系。

本发明的再一的目的是，提供一种银鲫鱼背鳍细胞系的构建方法。

本发明的另一的目的是，提供一种银鲫鱼背鳍细胞系的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种银鲫鱼背鳍细胞系，所 述的银鲫鱼背鳍细胞系的保藏编号为CCTCC NO:C201525。

所述的银鲫鱼背鳍细胞系是银鲫鱼的背鳍经过原代培养、传代培养得到 的。

原代培养和传代培养所用的细胞培养液为M199培养基制得。

原代培养和传代培养所用的细胞培养液通过如下方法制得：取M199培养 基，加入占培养基总体积10-20％的胎牛血清，终浓度为20ng/ml的碱性成纤 维生长因子，终浓度为1ng/ml的表皮生长因子。

原代培养的方法为：剪下银鲫鱼的背鳍，然后用75％酒精消毒，再用青霉 素、链霉素除去银鲫鱼背鳍上的黏液，接着用含两性霉素B的D-PBS冲洗， 冲洗后，在无菌条件下用剪刀将背鳍剪成小块后浸泡在胰蛋白酶和EDTA中； 接着将剪碎的银鲫鱼的背鳍转移到细胞培养瓶中，且保持底部温度为25℃， 然后加入含有10％胎牛的血清、青霉素、链霉素、两性霉素B、碱性成纤维生 长因子和表皮生长因子的M199培养基。

传代培养的方法为：当原代培养的银鲫鱼的背鳍细胞单层铺满细胞培养瓶 后，用吸管除去旧的培养液，用PBS清洗，加入胰酶消化细胞，待显微镜镜 下观察细胞变圆后，加入新鲜的完全培养液，反复吹打，悬起细胞，以1:2进 行传代，放入27℃培养箱中进行传代培养。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种银鲫鱼背鳍细胞 系的构建方法，所述的构建方法包括以下步骤：原代培养、传代培养。

所述的构建方法包括以下步骤：

a)原代培养

剪下银鲫鱼的背鳍，然后用75％酒精消毒，再用青霉素、链霉素除去银鲫 鱼背鳍上的黏液，接着用含两性霉素B的D-PBS冲洗，冲洗后，在无菌条件 下用剪刀将背鳍剪成小块后浸泡在胰蛋白酶和EDTA中；接着将剪碎的银鲫鱼 的背鳍转移到细胞培养瓶中，且保持底部温度为25℃，然后加入含有10％胎 牛的血清、青霉素、链霉素、两性霉素B、碱性成纤维生长因子和表皮生长因 子的M199培养基；

b)传代培养

当原代培养的银鲫鱼的背鳍细胞单层铺满细胞培养瓶后，用吸管除去旧的 培养液，用PBS清洗，加入胰酶消化细胞，待显微镜镜下观察细胞变圆后， 加入新鲜的完全培养液，反复吹打，悬起细胞，以1:2进行传代，放入27℃培 养箱中进行传代培养。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的银鲫鱼背鳍细 胞系在细胞工程、基因工程或生物医学工程中的应用。

本发明优点在于：

1、本发明建立的银鲫鱼背鳍细胞系可以连续传代，能提供大量的银鲫鱼 背鳍细胞系。

2、该细胞系可以直接应用于银鲫鱼免疫相关功能基因的研究，对于银鲫 鱼的病毒感染实验可以应用细胞系，节约了大量的人力，物力且效果较好。

3、银鲫鱼背鳍细胞系可以反复冻融，可应用于细胞生物学、病毒学、毒 理学、分子生物学、遗传学和免疫学等重要研究。

附图说明

附图1是显微镜下的银鲫鱼背鳍组织块附近迁移出的细胞(3天左右)。

附图2是显微镜下稳定传代后的银鲫鱼背鳍细胞系。

附图3是细胞感染鲫鱼疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)情况.(A):正常细胞,scale  bar.＝100μm.(B和C)感染鲫鱼疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)，感染后6天,scale  bar.＝100and 50μm.箭头所指为病变细胞.(D)感染鲫鱼疱疹病毒Ⅱ型 (CyHV-2)，感染后8天,scale bar.＝100.

附图4是鲫鱼疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)感染银鲫鱼背鳍细胞系上清中病 毒的复制曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明要解决的技术问题是提供一种可以稳定传代的建立银鲫鱼背鳍细 胞系(SCC-DF cell line，Silver crucian carp dorsal fin cell line)，该细胞系的构 建为研究银鲫鱼的免疫学和筛选未知鱼类病毒提供了良好的生物材料。

实施例1银鲫鱼背鳍细胞系的构建方法

1、制备细胞培养液

取GIBCO公司M199培养基，加入占培养基总体积10-20％(以下所述百分比 若无特别说明，均为体积百分比)的胎牛血清，终浓度为20ng/ml的碱性成纤维 生长因子(bFGF)，终浓度为1ng/ml的表皮生长因子(EGF)，4℃存放，备用。

2、原代培养

剪下银鲫鱼的背鳍，然后用75％酒精消毒，再用1000IU mL^-1青霉素， 1000ug mL^-1链霉素除去银鲫鱼背鳍上的黏液，接着用含2.5ug mL^-1的两性霉素 B的D-PBS冲洗3次。冲洗后，在无菌条件下用剪刀将背鳍剪成约1mm³的 小块后浸泡在0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA中。

接着将剪碎的银鲫鱼的背鳍转移到底部为25cm²的细胞培养瓶中，且保持 底部温度为25℃。15小时后，加入2mL含有10％胎牛的血清(FBS)，200IU  mL^-1青霉素，200ug mL^-1链霉素，0.5ug mL^-1两性霉素B，FGF和EGF的 M199培养基。24小时后，加入3mL含有10％FBS，200IU mL^-1青霉素，200ug  mL^-1链霉素，0.5ug mL^-1两性霉素B，FGF和EGF的培养基。每天更换50％ 的新鲜培养基。

3、传代培养

当原代培养的银鲫鱼的背鳍细胞单层铺满细胞培养瓶后，用吸管除去旧的 培养液，用PBS清洗两遍，加入0.25％胰酶(含EDTA)1mL消化细胞，待显微 镜镜下观察细胞变圆后，加入10mL新鲜的完全培养液，反复吹打，悬起细胞， 以1:2进行传代，加入完全培养液至5mL/瓶，放入27℃培养箱中进行传代培养。

实施例2银鲫鱼背鳍细胞系

经过离体培养，本发明获得了一株传代稳定成分均一的银鲫鱼背鳍细胞系 (SCC-DF cell line，Silver crucian carp dorsal fin cell line)传代至今。

本发明得到的银鲫鱼背鳍细胞系在中国典型培养物保藏中心进行了保藏， 银鲫鱼背鳍细胞系SCC-DF，其保藏编号为CCTCC NO:C201525，分类命名为 银鲫鱼(Carassius C.auratus)，中国典型培养物保藏中心的地址为中国湖北省 武汉市武汉大学，保藏日期为2015年3月27日。

进一步地，所述银鲫鱼背鳍细胞系具有以下生物学特性：

1)原代分离自组织块附近的细胞，呈纤维样细胞的形态特点；

2)细胞增殖能力一般，每一个组织块在处理后7d左右均能分离出大量细 胞，具有连续传代的能力；

3)该细胞系培养条件为25℃恒温细胞培养箱，无需二氧化碳。

本细胞系采用鱼类细胞系培养最常用的培养基M199，培养条件同普通鱼 类细胞一致。传代时需要胰酶消化，分瓶5天可长满。细胞形态呈典型的纤维 状。因此该细胞系是一种特性稳定、成分均一的银鲫鱼背鳍细胞系，是研究水 产动物免疫学和病毒学的良好生物材料。

实施例3病毒感染实验

一、实验方法

1、病毒的感染

将已培养好的草金鱼腹鳍细胞系传至6孔板中，隔夜贴壁生长。分别含鲫 鱼疱疹病毒Ⅱ，CyHV-2)和碱性磷酸盐缓冲液，PBS(阴性对照组)取500μl感 染细胞，孵育1小时后弃去上清，用PBS洗3次，加入完全培养基500μl放置 在培养箱中培养，每天观察细胞生长情况。

2、病毒在细胞上清中复制曲线的绘制

将细胞传至24孔板中，按1中步骤感染病毒，每24小时取上清，高速离 心弃去沉淀，上清按下述步骤提取DNA进行荧光定量PCR检测。

3、病毒DNA的提取

(1)加入等体积的PBS缓冲液，混合均匀，以8000rpm离心5分钟，弃 上清；

(2)加入20μL蛋白酶k.在56℃水浴中保温3小时；

(3)8000rpm离心5分钟，取750μL上清液中于一新离心管中，加入等体 积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)；以50转/分钟的速度混合10分钟，再以 8000转/分钟离心5分钟，取650μL上清液于一新离心管中；重复1次；

(4)取600μL上清液于一新离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)。 以50转/分钟速度混合10分钟，8000转/分钟离心5分钟；

(5)取480μL上清液于一新离心管中，加入40μL 3mol/L的醋酸钠和960μL 4℃的冷却乙醇；轻摇，可见白色絮状物；

(6)在零下20℃放置20-30分钟，后以12000转/分钟离心10分钟，弃去 上清液；

(7)用200ul 75％的乙醇洗涤，14000转/分钟离心5分钟，弃上清；重复 做一次；

(8)晾干10分钟后用50ul的超纯水洗涤，于零下20℃保存。

4、荧光定量PCR检测

上游引物CyHV-2rtF2(5’-3’)：TTAGCGTCAGGTCCATAG

下游引物CyHV-2rtR1(5’-3’)：GGCGTGTAGAAATCAAAC

反应体系：

震荡混匀，配平离心。

Real-time PCR反应条件：95℃10min，(95℃10s，59℃15s，72℃20s)39 个循环；融解曲线：95℃1min，55℃1min，65℃到95℃0.1℃/秒。

4、实验结果

如图3A所示，阴性感染组(未感染病毒)细胞生长良好；图3B，C，感 染病毒6天左右收缩形成空泡样；图3D，感染8天左右细胞形成明显的病毒 病变现象(CPE)。

病毒在细胞上清中扩增曲线结果见图4，病毒在前3天进行扩增，4天后 进入平台期。

以上检测结果表明：该银鲫鱼背鳍细胞系能够应用于鲫鱼疱疹病毒Ⅱ (CyHV-2)的检测以及相应的病毒学、免疫学相关实验。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些 改进和补充也应视为本发明的保护范围。