荧光融合多肽、包含所述多肽的生物感应器及其用途

摘要

本发明涉及一种荧光融合多肽，能够在细胞质中的第二信使浓度增加时，将自己在细胞中的定位从细胞质膜转移至滞留囊泡中，所述多肽包括膜定位肽、第二信使转导蛋白结合肽、内质网滞留信号和荧光肽，其中：a.所述膜定位肽位于所述荧光融合多肽的N端，且物理性地连接在所述荧光多肽上，可选地，该连接通过连接子实现；而所述荧光多肽物理性地连接在所述第二信使转导蛋白结合肽上，可选地，该连接通过连接子实现；以及b.所述第二信使转导蛋白结合肽物理性地连接在所述内质网滞留信号上，可选地，该连接通过连接子实现，而所述内质网滞留信号位于所述荧光融合多肽的C端。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是荧光融合多肽、包含所述多肽的生物感应器及其用途。

背景技术

以下背景探讨仅用于促进读者对本发明的理解，并不应理解为描述或构成本发明的现有技术。

基于细胞体系的高容量筛选(HCS)使用活细胞作为生物研究工具，用于说明正常细胞和患病细胞的活动。 HCS还用于发现和优化新备选药物。

高容量筛选是现代细胞生物学及其分子工具与自动化高解析度显微镜和机器人操作的结合。首先，令细胞 接触化学试剂或RNAi试剂。然后，使用图像分析来检测细胞形态改变。使用各种技术，例如与内源蛋白 融合的绿色荧光蛋白或荧光抗体，来测定细胞合成蛋白量的改变。

在细胞尺度上并行采集不同细胞性质的数据，例如信号级联传导活动和细胞谷歌完整性，是该方法的主要 优势，与之相比，高通量筛选较快，但不够详细。虽然HCS相比较慢，但所得的丰富数据允许对药物作 用的理解更深刻。在此意义上，HCS获取信号级联转导活动相关数据的目的之一，在于通过测量胞内第二信使水平，来测定不同药物在信号传导过程中的作用。

第二信使是从细胞表面的受体处接力将信号传递给细胞内细胞质或细胞核中的目标分子。他们接力传导荷 尔蒙信号(例如肾上腺素、生长因子等)并引起细胞活动的某些改变。他们极大地放大信号强度。第二信 使是信号级联转导的参与者之一。这些第二信使中，cAMP和钙是第二信使概念的范例，且被认为是普遍 存在并调控许多细胞内关键过程的关键胞内分子。

理想状态下，所述测量要求精确定位、高动态范围的、以及尽可能少的细胞生理学干扰的工具，其能够使 用高容量筛选方法来监控体内第二信使水平。

基于此，产生了各种基于荧光性质动态变化的荧光生物感应器。在此意义上，所述生物感应器种类通常基 于荧光共振能量转移(FRET)的改变。FRET是能量通过非辐射的偶极到偶极的偶联，从激发的供体荧光 团转移到受体荧光团的过程。该能量传递的效率高度依赖于供体和受体荧光团之间的距离(例如，对 CFP/YFP而言<10nm)和相对方向。但是，高容量筛选方法中，基于FRET的生物感应器要求至少具有4 个过滤器的探测设备，其中2个用于激发，2个用于发射。此外，由于探测信号的强度低，探测信号范围 和筛选敏感性也低。最后，使用大于1个荧光发射信号，要求使用更多算法以正确地分析最终信号。

因此，仍存在开发用于在活细胞动态环境中实时测量第二信号浓度的改进方法。

发明内容

本发明的第一个方面，涉及一种荧光融合多肽，能够在细胞质中的第二信使浓度增加时，将自己在 细胞中的定位从细胞质膜转移至滞留囊泡中，所述多肽包含膜定位肽、第二信使转导蛋白结合肽、内质网 滞留信号和荧光肽，其中：

a.所述膜定位肽位于所述荧光融合多肽的N端，且物理性地连接在所述荧光多肽上，可选地，所述 连接是通过连接子；而所述荧光多肽物理性地连接在所述第二信使转导蛋白结合肽上，可选地，所述连接 是通过连接子；以及

b.所述第二信使转导蛋白结合肽物理性地连接在所述内质网滞留信号上，可选地，所述连接是通过连 接子，而所述内质网滞留信号位于所述荧光融合多肽的C端。

在本发明第一方面的另一个优选实施例中，所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的胞外 域，或根据氨基酸同源性与所述序列整个区域具有至少90％同源性的变体；以及，所述内质网滞留信号是 选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX和RXR的多肽，其中X为任意氨基酸，且优选地，所述内质网滞留信号是KDEL。

本发明第一方面的更优选实施例中，所述第二信使转导蛋白结合肽是cAMP转导蛋白结合多肽、钙转导蛋 白结合多肽、IP3转导蛋白结合多肽、cGMP转导蛋白结合多肽或甘油二脂转导蛋白结合多肽。因此，在 本发明的一个更优选的实施例中，本发明第一方面的荧光融合多肽能够在细胞质中的第二信使浓度增加时 将自己在细胞中的定位从细胞质膜转移至滞留囊泡中，且所述第二信使选自：钙、IP3、cAMP或甘油二酯。

本发明的第二方面中，涉及一种荧光融合多肽，所述多肽能够在胞内钙浓度增加时，将自己在细胞中的定 位从细胞质膜转移至滞留囊泡中，所述多肽包括膜定位肽、包含钙调素结合序列的第二信使转导蛋白结合 肽、内质网滞留信号和荧光肽，其中：

a.所述膜定位肽位于所述荧光融合多肽的N端，且物理性地连接在所述荧光多肽上，可选地，所述连 接是通过连接子；而所述荧光多肽物理性地连接在包含钙调素结合序列的所述第二信使转导蛋白结合肽 上，可选地，所述连接是通过连接子；以及

b.所述第二信使转导蛋白结合肽物理性地连接在所述内质网滞留信号上，可选地，所述连接是通过 连接子，而所述内质网滞留信号位于所述荧光融合多肽的C端。

在本发明第二方面的一个优选实施例中，所述钙调素结合序列选自SEQ ID No 1 (MEKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)、SEQ ID No 2(ASPWKSARLMVHTVATFNSI)、SEQ ID No 3 (AIGFKKLAEAVKFSAKLMGQ)、SEQ ID No 4(KKTFKEVANAVKISASLMGT)、SEQ ID No 5 (GAVLKVLTTGLPALISWIKR)、SEQ ID No 6(RGGFRRIARLVGVLREWAYR)、SEQ ID No 7 (GGRLALLRARLKELAALEAA)和SEQ ID No 8(AEGVRNIKSMWEKGNVFSSP)或根据氨基酸同源性与 任一所述序列的整个区域具有至少90％同源性的变体。

在本发明第二方面的又一个优选实施例中，所述内质网滞留信号是选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX 和RXR的多肽，其中X为任意氨基酸，且其中优选地，所述内质网滞留信号为KDEL和/或所述膜定位肽 是如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的胞外域，或根据氨基酸同源性与任一所述序列的整个区域具有 至少90％同源性的变体。

在本发明第二方面的另一个优选实施例中，本发明的所述荧光多肽选自GFP、YFP、turboGFP、tRFP和 tRFP602。

在本发明第二方面的又一个优选实施例中，

a.所述钙调素结合序列选自SEQ ID No 1(MEKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)、SEQ ID No 2 (ASPWKSARLMVHTVATFNSI)、SEQ ID No 3(AIGFKKLAEAVKFSAKLMGQ)、SEQ ID No 4 (KKTFKEVANAVKISASLMGT)、SEQ ID No 5(GAVLKVLTTGLPALISWIKR)、SEQ ID No 6 (RGGFRRIARLVGVLREWAYR)、SEQ ID No 7(GGRLALLRARLKELAALEAA)和SEQ ID No 8 (AEGVRNIKSMWEKGNVFSSP)或根据氨基酸同源性与任一所述序列的整个区域具有至少90％同源性的 变体；

b.所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的胞外域或根据氨基酸同源性与所述序列 整个区域具有至少90％同源性的变体；以及

c.所述内质网滞留信号是选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX和RXR的多肽，其中X为任意氨基 酸，且优选地，所述内质网滞留信号为KDEL。

在本发明的另一个优选实施例中，所述钙荧光融合多肽包括SEQ ID No 15，或优选地，由SEQ ID No 15 组成。

本发明第三个方面涉及一种荧光融合多肽，所述多肽能够在胞内cAMP浓度增加时，将自己在细胞中的定 位从细胞质膜转移至滞留囊泡中，所述多肽包括膜定位肽、包含与PKA的RI和RII调控域结合的结合序 列的第二信使转导蛋白结合肽、内质网滞留信号和荧光肽，其中：

a.所述膜定位肽位于所述荧光融合多肽的N端，且物理性地连接在所述荧光多肽上，可选地，所述连 接是通过连接子；而所述荧光多肽物理性地连接在所述第二信使转导蛋白结合肽上，可选地，所述连接是 通过连接子；以及

b.所述第二信使转导蛋白结合肽物理性地连接在所述内质网滞留信号上，可选地，所述连接是通过 连接子，而所述内质网滞留信号位于所述荧光融合多肽的C端。

在本发明第三方面的一个优选实施例中，与PKA的RI和RII调控域结合的结合序列选自：SEQ ID No 9 (DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY)、SEQ ID no 10(VQGNTDEAQEELAWKIAKMIVSDVMQQ)、SEQ ID  No 11(VQGNTDEAQEELLWKIAKMIVSDVMQQ)、SEQ ID No 12(FEELAWKIAKMIWSDVFQQ)、SEQ ID  No 13(QIEYLAKQIVDNAIQQAK)和SEQ ID No 14(LEQYANQLADQIIKEATE)或根据氨基酸同源性与所 述序列整个区域具有至少90％同源性的变体。

在本发明第三方面的又一个优选实施例中，所述内质网滞留信号是选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX 和RXR的多肽，其中X为任意氨基酸，且其中优选地，所述内质网滞留信号为KDEL，和/或所述膜定位 肽是如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的胞外域或根据氨基酸同源性与所述序列整个区域具有至少 90％同源性的变体。

在本发明第三方面的又一个优选实施例中，所述荧光多肽选自GFP、YFP、turboGFP、tRFP和tRFP602。 在本发明第三方面的又一个优选实施例中，

a.所述与PKA的RI和RII调控域结合的结合序列选自SEQ ID No 9 (DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY)、SEQ ID no 10(VQGNTDEAQEELAWKIAKMIVSDVMQQ)、SEQ ID  No 11(VQGNTDEAQEELLWKIAKMIVSDVMQQ)、SEQ ID No 12(FEELAWKIAKMIWSDVFQQ)、SEQ ID  No 13(QIEYLAKQIVDNAIQQAK)和SEQ ID No 14(LEQYANQLADQIIKEATE)，或根据氨基酸同源性与 任一所述序列的整个区域具有至少90％同源性的变体；

b.所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的胞外域或根据氨基酸同源性与所述序列 整个区域具有至少90％同源性的变体；以及

c.所述内质网滞留信号是选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX和RXR的多肽，其中X为任意氨基 酸，且其中优选地，所述内质网滞留信号为KDEL。

在本发明第三方面的又一个优选实施例中，所述荧光融合多肽包含SEQ ID No 16，或优选地，由SEQ ID No  16组成。

本发明第四个方面涉及一种荧光融合多肽，所述多肽能够在胞内甘油二脂浓度增加时，将自己在细胞中的 定位从细胞质膜转移至滞留囊泡中，所述多肽包括膜定位肽、包含与PKCδ,结合的结合序列的第二信使转 导蛋白结合肽、内质网滞留信号和荧光肽，其中：

a.所述膜定位肽位于所述荧光融合多肽的N端，且物理性地连接在所述荧光多肽上，可选地，所述连 接是通过连接子；而所述荧光多肽物理性地连接在所述第二信使转导蛋白结合肽上，可选地，所述连接是 通过连接子；以及

b.所述第二信使转导蛋白结合肽物理性地连接在所述内质网滞留信号上，可选地，所述连接是通过 连接子，而所述内质网滞留信号位于所述荧光融合多肽的C端。

在本发明第四方面的一个优选实施例中，所述与PKCδ,结合的结合序列为SEQ ID No 19 (AARKRKGSFFYGG)或根据氨基酸同源性与所述序列整个区域具有至少90％同源性的变体。

在本发明第四方面的又一个优选实施例中，所述内质网滞留信号是选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX 和RXR的多肽，其中X为任意氨基酸，且其中优选地，所述内质网滞留信号为KDEL，和/或所述膜定位 肽是如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的胞外域或根据氨基酸同源性与所述序列整个区域具有至少 90％同源性的变体。

在本发明第四方面的又一个优选实施例中，所述荧光多肽选自GFP、YFP、turboGFP、tRFP和tRFP602。 在本发明第四方面的又一个优选实施例中，

a.所述与PKCδ，结合的结合序列为SEQ ID No 19(AARKRKGSFFYGG)或根据氨基酸同源性与所述 序列整个区域具有至少90％同源性的变体；

b.所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的胞外域或根据氨基酸同源性与所述序列 整个区域具有至少90％同源性的变体；以及

c.所述内质网滞留信号是选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX和RXR的多肽，其中X为任意氨基 酸，且优选地，所述内质网滞留信号为KDEL。

在本发明第四方面的又一个优选实施例中，所述所述荧光融合蛋白包含SEQ ID No 18。

本发明第五个方面涉及含有编码如本发明上述任一方面所述多肽的多核苷酸序列的核酸分子。

本发明第六个方面涉及含有如本发明上述第一、第二、第三和第四方面所述的融合多肽的生物感应器。

本发明第七个方面涉及含有如本发明上述第一、第二、第三和第四方面所述的荧光融合多肽或如本发明上 述第六方面所述的生物感应器的细胞，其中优选地，所述细胞为细胞系U2O2。

本发明的又一方面涉及如本发明上述第一、第二、第三和第四方面中任一方面所述的荧光融合蛋白的若干 用途，或如本发明上述第六方面所述的生物感应器的用途。

附图说明

以下附图属于并构成本说明书的一部分，演示了若干实施例，并与下文具体描述共同阐明了本公开的组合 物和方法。

图1.荧光生物感应器细胞定位模型的示意图。当细胞质中的第二信使浓度增加时，荧光生物感应器在细 胞中的定位从细胞胞质膜变化到囊泡中。

图2.使用荧光生物感应器测定第二信使。第二信使浓度的提高促进了荧光生物感应器的再分布。细胞荧 光变化计算为所述细胞粒度的增量。图中所述的上述细胞系的三种不同克隆得到了相同结果，这证明含有 钙生物感应器的3种克隆(左图)或含有cAMP生物感应器的3种克隆(右图)的相应结果具有可再现性。

图3.钙生物感应器刺激下的细胞分布。以10μM P物质(Substancia P)激动剂对稳定表达人神经激肽受体 1和荧光钙生物感应器的U2OS进行6小时刺激。处理后，荧光生物感应器进入细胞质囊泡。使用图像分 析算法来测量囊泡生成，以测定人神经激肽受体1的活性。

图4.神经激肽1受体-钙生物感应器细胞系对P物质的浓度反应曲线。以10log稀释系列(n＝4)处理细胞。 以激动剂处理6小时后，P物质的Ec50为约9.5x10^-12M。固定细胞，并以DAPI对细胞核染色。相对于阳 性对照(10μM)计算％活性。对于高容量筛选，以平均值Z′＝0.85+/-0.01来验证内化实验。

图5.cAMP生物感应器刺激下的细胞分布。以10μM异丙肾上腺素激动剂对稳定表达人肾上腺素β2受体 和荧光钙生物感应器的U2OS进行36小时刺激。处理后，荧光生物感应器进入细胞质囊泡。使用图像分 析算法来测量囊泡生成，以测定人肾上腺素β2受体的活性。

图6.人肾上腺素β2受体-cAMP生物感应器细胞系对异丙肾上腺素的浓度反应曲线。以6log稀释系列 (n＝4)处理细胞。以激动剂处理36小时后，异丙肾上腺素的Ec50为约2.3x10^-7M。固定细胞，并以 DAPI对细胞核染色。相对于阳性对照(10μM)计算％活性。对于高容量筛选，以平均值Z′＝0.7+/-0.01来验 证内化实验。

图7.DAG生物感应器刺激下的细胞分布。以25ng/ml PMA对稳定表达荧光DAG生物感应器的U2OS进 行4小时刺激。处理后，荧光生物感应器进入细胞质囊泡。使用图像分析算法来测量囊泡生成，以测定 DAG生物感应器的活性。

图8.DAG生物感应器细胞系的浓度反应曲线。以9log稀释系列(n＝4)处理细胞。以PMA处理4小时后， PMA的Ec50为2.89x10^-4ng/ml。固定细胞，并以DAPI对细胞核染色。相对于阳性对照(10μM)计算％活 性。对于高容量筛选，以平均值Z′＝0.76+/-0.01来验证内化实验。

具体实施方式

除非另有明确说明，否则，本文所称术语“包含(comprising)”指的是，除“包含”所指的物项外，还可 以可选地存在其他物项。但是，在本发明的特定实施例中，术语“包含”涵盖了不存在其他物项的可能性， 亦即，对该实施例而言，“包含”应当理解为“仅包含”。

定义

本发明中，术语“融合多肽”指的是包含来自不同蛋白但却组合在同一多肽结构中的至少4个多肽的组合 的杂交多肽。

本发明中，术语“膜定位肽”指的是天然胞内定位在质膜中的多肽。

本文所称的术语“转导蛋白结合多肽”指的是能够与特定构型的转导蛋白结合的多肽。因此，该多肽仅能 在所述转导蛋白与第二信使(cAMP、Ca2+、IP3、cGMP、甘油二脂等)相互作用时，与该转导蛋白结 合。

本文所称的术语“内质网滞留信号”指的是引导多肽运输到内质网上并经过分泌途径从而赋予多泡定位的 短肽链

本文所称的术语“荧光多肽”指的是具有荧光能力的荧光多肽。荧光多肽域的特征在于，具有特定激发光 谱和发射光谱。

本发明中，所述连接子具有至少1个氨基酸残基，优选为至少2个连续的氨基酸残基。

本文所称的术语“生物传感器”指的是一种能够对物理性或化学性刺激做出应答并传递细胞状态相关信息 的分子工具或物体。

本文所称的术语“药物”指的是具有作为信号传导通路的激动剂或拮抗剂或调控剂的潜力的分子。

本文所称的术语“稳定细胞系”指的是异源DNA转染或感染且并入细胞基因组的细胞系。

本文所称的术语“钙调素结合序列”指的是骨骼肌肌球蛋白轻链激酶的钙调素结合域对应的氨基酸序列。 该序列包含在1-14钙调素结合基序的基本1-8-14子类中。基本1-8-14的共有序列为 (RK)(RK)(RK)(FILVW)xxxxxx(FAILVW)xxxxx(FILVW)。所述序列类型能够容易地在钙调素结合数据库 (http://calcium.uhnres.utoronto.ca/ctdb/ctdb/home.html)中找到。

本文所称的术语“与PKA的RI和RII调控域结合的结合序列”指的是存在于A激酶锚定蛋白家族(AKAP) 中且基本功能为与蛋白激酶A(PKA)的调控域(RI或RII)结合的保守氨基酸序列。

本文所称的“HT31”指的是源自人甲状腺A激酶锚定蛋白(AKAP)并能通过与AKAPs竞争来破坏对A 激酶的锚定(由cAMP信号激活后)的多肽。HT31与蛋白激酶A的调控域(RI或RII)结合，但亲和度 并不相同：对RI域的亲和性低，对RII域的亲和性高。

本文所称的术语“与PKCδ,结合的结合序列”指的是与PKCδ特异性结合而不与其他PKCs结合的可溶性 合成多肽的对应氨基酸序列。所述序列种类可以在PKCLab数据库中容易地找到 (http://www.pkclab.org/PKC/link/substrate_specificity.htm)。

具体实施方式

本发明解决的问题在于：提供精确定位、高动态范围、细胞生理学干扰尽可能少的工具，用于在基于细胞 的体系中使用高容量筛选方法(HCS)来监控体内第二信使水平，其中所述工具没有基于FRET的生物传 感器的缺陷。

为了解决上述问题，本发明的发明人设计了一种新型荧光融合多肽，包含膜定位肽、荧光多肽、第二信使 转导蛋白结合肽和内质网滞留信号。该生物感应器由靶向2个不同的细胞区室的2种多肽组成，允许通过 监控细胞质中的荧光多肽分布来测量第二信使浓度。基于此，细胞内的生物感应器易位应是因为所述转导 蛋白与第二信使转导蛋白结合肽的结合，引起其3D构型的改变，从而隐藏或暴露该多肽两端的定位信号。 在基础状态下，该生物感应器位于所述细胞区室之一；这意味着，其3D构型隐藏了指向另一细胞区室的 定位多肽。当细胞受到刺激，第二信使浓度增加时，所述第二信使与被激活的转导蛋白结合。活性转导蛋 白能够与生物感应器中的转导多肽结合，引起构型变化。此时，生物感应器中的不同结构元件的空间分布 改变，新的3D构型中，指向另一细胞区室的定位多肽暴露出来，由此整个生物感应器被转运至新细胞区 室中的新位置。由于生物感应器中荧光蛋白的存在，可以在活细胞中追踪此全过程。该过程的可视化示意 图如图1所示。

但是，本发明的发明人认识到，上述荧光融合多肽中多肽的顺序不能是任意存在的。在多次试验后， 发明人认识到，只有一种元件组合能够提供将生物感应器转运至另一细胞区室的技术效果，所述组合为：

a.所述膜定位肽必须位于所述荧光融合多肽的N端，且必须物理性地连接在所述荧光多肽上，可选地， 所述连接是通过连接子；而所述荧光多肽必须物理性地连接在所述第二信使转导蛋白结合肽上，可选地， 所述连接是通过连接子；以及

b.所述第二信使转导蛋白结合肽必须物理性地连接在所述内质网滞留信号上，可选地，所述连接是 通过连接子，而所述内质网滞留信号必须位于所述荧光融合多肽的C端。

发明人测试了具有上述结构的生物感应器是否能用于探测和量化不同类型的第二信使。如本公开的实施例 1-3所示，本发明的发明人构建了不同的荧光融合多肽，其中所有所述多肽均包含：如SEQ ID No 17所示 的白细胞介素-2受体的胞外域，作为膜定位肽；多肽KDEL，作为内质网滞留信号；以及，turboGFP，作 为荧光多肽；因此，所述荧光融合多肽之间的唯一区别即为，使用了不同的第二信使转导蛋白结合肽。基 于此，发明人在实施例1的钙生物感应器中，使用了包含钙调素结合域的第二信使转导蛋白结合肽；在实 施例2的cAMP生物感应器中，使用了包含来自激酶A锚定蛋白(AKAP)的蛋白激酶A(PKA)结合域 的第二信使转导蛋白结合肽；在实施例3的甘油二脂生物感应器中，使用了包含SEQ ID No 19所示的结 合域的第二信使转导蛋白结合肽。

令人吃惊地，如实施例和附图中所示，使用了上述实施例1-3的融合多肽的实验结果表明，第二信使浓度 的提高，诱导了生物感应器的构型变化，促进了荧光生物感应器的再分布。在所有3个实施例中，该活性 计算为转染了本发明的生物感应器的细胞粒度的增量。该生物感应器的荧光再分布是使用了图像分析算法 进行荧光探测。由此一来，可以通过生物感应器的定位信号的“隐藏和暴露”过程和生物感应器的最终定 位来监控第二信使浓度。

因此，本发明的第一个方面，涉及一种荧光融合多肽，能够在细胞质中的第二信使浓度增加时，将 自己在细胞中的定位从细胞质膜转移至滞留囊泡中，所述多肽包括膜定位肽、第二信使转导蛋白结合肽、 内质网滞留信号和荧光肽，其中：

a.所述膜定位肽位于所述荧光融合多肽的N端，且物理性地连接在所述荧光多肽上，可选地，所述 连接是通过连接子；而所述荧光多肽物理性地连接在所述第二信使转导蛋白结合肽上，可选地，所述连接 是通过连接子；以及

b.所述第二信使转导蛋白结合肽物理性地连接在所述内质网滞留信号上，可选地，所述连接是通过连 接子，而所述内质网滞留信号位于所述荧光融合多肽的C端。

在本发明第一方面的另一个优选实施例中，所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的 胞外域，或根据氨基酸同源性与所述序列整个区域具有至少90％同源性的变体；以及，所述内质网滞留信 号是选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX和RXR的多肽，其中X为任意氨基酸，且优选地，所述内质 网滞留信号是KDEL。

本发明第一方面的更优选实施例中，所述第二信使转导蛋白结合肽是cAMP转导蛋白结合多肽、钙转导蛋 白结合多肽、IP3转导蛋白结合多肽、cGMP转导蛋白结合多肽或甘油二脂转导蛋白结合多肽。因此，在 本发明的一个更优选的实施例中，本发明第一方面的荧光融合多肽能够在细胞质中的第二信使浓度增加时 将自己在细胞中的定位从细胞质膜转移至滞留囊泡中，且所述第二信使选自：钙、IP3、cAMP或甘油二酯。

本发明的第二方面中，涉及一种荧光融合多肽，所述多肽能够在胞内钙浓度增加时，将自己在细胞中的定 位从细胞质膜转移至滞留囊泡中，所述多肽包括膜定位肽、包含钙调素结合序列的第二信使转导蛋白结合 肽、内质网滞留信号和荧光肽，其中：

a.所述膜定位肽位于所述荧光融合多肽的N端，且物理性地连接在所述荧光多肽上，可选地，所述 连接是通过连接子；而所述荧光多肽物理性地连接在包含钙调素结合序列的所述第二信使转导蛋白结合肽 上，可选地，所述连接是通过连接子；以及

b.所述第二信使转导蛋白结合肽物理性地连接在所述内质网滞留信号上，可选地，所述连接是通过连 接子，而所述内质网滞留信号位于所述荧光融合多肽的C端。

在本发明第二方面的一个优选实施例中，所述钙调素结合序列选自SEQ ID No 1 (MEKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)、SEQ ID No 2(ASPWKSARLMVHTVATFNSI)、SEQ ID No 3 (AIGFKKLAEAVKFSAKLMGQ)、SEQ ID No 4(KKTFKEVANAVKISASLMGT)、SEQ ID No 5 (GAVLKVLTTGLPALISWIKR)、SEQ ID No 6(RGGFRRIARLVGVLREWAYR)、SEQ ID No 7 (GGRLALLRARLKELAALEAA)和SEQ ID No 8(AEGVRNIKSMWEKGNVFSSP)或根据氨基酸同源性与 任一所述序列整个区域具有至少90％同源性的变体。

在本发明第二方面的又一个优选实施例中，所述内质网滞留信号是选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX 和RXR的多肽，其中X为任意氨基酸，且其中优选地，所述内质网滞留信号为KDEL和/或所述膜定位肽 是如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的胞外域或根据氨基酸同源性与任一所述序列的整个区域具有至 少90％同源性的变体。

在本发明第二方面的另一个优选实施例中，本发明的所述荧光多肽选自GFP、YFP、turboGFP、tRFP和 tRFP602。

在本发明第二方面的又一个优选实施例中，

a.所述钙调素结合序列选自SEQ ID No 1(MEKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)、SEQ ID No 2 (ASPWKSARLMVHTVATFNSI)、SEQ ID No 3(AIGFKKLAEAVKFSAKLMGQ)、SEQ ID No 4 (KKTFKEVANAVKISASLMGT)、SEQ ID No 5(GAVLKVLTTGLPALISWIKR)、SEQ ID No 6 (RGGFRRIARLVGVLREWAYR)、SEQ ID No 7(GGRLALLRARLKELAALEAA)和SEQ ID No 8 (AEGVRNIKSMWEKGNVFSSP)或根据氨基酸同源性与任一所述序列的整个区域具有至少90％同源性的 变体；

b.所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的胞外域或根据氨基酸同源性与所述序列 整个区域具有至少90％同源性的变体；以及

c.所述内质网滞留信号是选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX和RXR的多肽，其中X为任意氨基 酸，且优选地，所述内质网滞留信号为KDEL。

在本发明的另一个优选实施例中，所述荧光融合多肽包括SEQ ID No 15，或优选地，由SEQ ID No 15组 成。

本发明第三个方面涉及一种荧光融合多肽，所述多肽能够在胞内cAMP浓度增加时，将自己在细胞中的定 位从细胞质膜转移至滞留囊泡中，所述多肽包括膜定位肽、包含与PKA的RI和RII调控域结合的结合序 列的第二信使转导蛋白结合肽、内质网滞留信号和荧光肽，其中：

a.所述膜定位肽位于所述荧光融合多肽的N端，且物理性地连接在所述荧光多肽上，可选地，所述 连接是通过连接子；而所述荧光多肽物理性地连接在所述第二信使转导蛋白结合肽上，可选地，所述连接 是通过连接子；以及

b.所述第二信使转导蛋白结合肽物理性地连接在所述内质网滞留信号上，可选地，所述连接是通过连 接子，而所述内质网滞留信号位于所述荧光融合多肽的C端。

在本发明第三方面的一个优选实施例中，与PKA的RI和RII调控域结合的结合序列选自：SEQ ID No 9 (DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY)、SEQ ID no 10(VQGNTDEAQEELAWKIAKMIVSDVMQQ)、SEQ ID  No 11(VQGNTDEAQEELLWKIAKMIVSDVMQQ)、SEQ ID No 12(FEELAWKIAKMIWSDVFQQ)、SEQ ID  No 13(QIEYLAKQIVDNAIQQAK)和SEQ ID No 14(LEQYANQLADQIIKEATE)或根据氨基酸同源性与任 一所述序列的整个区域具有至少90％同源性的变体。

在本发明第三方面的又一个优选实施例中，所述内质网滞留信号是选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX 和RXR的多肽，其中X为任意氨基酸，且优选地，所述内质网滞留信号为KDEL，和/或所述膜定位肽是 如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的胞外域或根据氨基酸同源性与任一所述序列的整个区域具有至少 90％同源性的变体。

在本发明第三方面的又一个优选实施例中，所述荧光多肽选自GFP、YFP、turboGFP、tRFP和tRFP602。 在本发明第三方面的又一个优选实施例中，

a.所述与PKA的RI和RII调控域结合的结合序列选自SEQ ID No 9 (DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY)、SEQ ID no 10(VQGNTDEAQEELAWKIAKMIVSDVMQQ)、SEQ ID  No 11(VQGNTDEAQEELLWKIAKMIVSDVMQQ)、SEQ ID No 12(FEELAWKIAKMIWSDVFQQ)、SEQ ID  No 13(QIEYLAKQIVDNAIQQAK)和SEQ ID No 14(LEQYANQLADQIIKEATE)，或根据氨基酸同源性与 所述序列整个区域具有至少90％同源性的变体；

b.所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的胞外域或根据氨基酸同源性与所述序列 整个区域具有至少90％同源性的变体。；以及

c.所述内质网滞留信号是选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX和RXR的多肽，其中X为任意氨基 酸，且其中优选地，所述内质网滞留信号为KDEL。

在本发明第三方面的又一个优选实施例中，所述荧光融合多肽包含SEQ ID No 16，或优选地，由SEQ ID No 16组成。

本发明第四个方面涉及一种荧光融合多肽，所述多肽能够在胞内甘油二脂浓度增加时，将自己在细胞中的 定位从细胞质膜转移至滞留囊泡中，所述多肽包括膜定位肽、包含与PKCδ,结合的结合序列的第二信使转 导蛋白结合肽、内质网滞留信号和荧光肽，其中：

a.所述膜定位肽位于所述荧光融合多肽的N端，且物理性地连接在所述荧光多肽上，可选地，所述 连接是通过连接子；而所述荧光多肽物理性地连接在所述第二信使转导蛋白结合肽上，可选地，所述连接 是通过连接子；以及

b.所述第二信使转导蛋白结合肽物理性地连接在所述内质网滞留信号上，可选地，所述连接是通过连 接子，而所述内质网滞留信号位于所述荧光融合多肽的C端。

在本发明第四方面的一个优选实施例中，所述与PKCδ,结合的结合序列为SEQ ID No 19 (AARKRKGSFFYGG)或根据氨基酸同源性与所述序列整个区域具有至少90％同源性的变体。

在本发明第四方面的又一个优选实施例中，所述内质网滞留信号是选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX 和RXR的多肽，其中X为任意氨基酸，且其中优选地，所述内质网滞留信号为KDEL，和/或所述膜定位 肽是如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的胞外域或根据氨基酸同源性与任一种所述序列的整个区域具 有至少90％同源性的变体。

在本发明第四方面的又一个优选实施例中，所述荧光多肽选自GFP、YFP、turboGFP、tRFP和tRFP602。 在本发明第四方面的又一个优选实施例中，

a.所述与PKCδ,结合的结合序列为SEQ ID No 19(AARKRKGSFFYGG)或根据氨基酸同源性与所述序 列整个区域具有至少90％同源性的变体；

b.所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的胞外域或根据氨基酸同源性与所述序列 整个区域具有至少90％同源性的变体；以及

c.所述内质网滞留信号是选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX和RXR的多肽，其中X为任意氨基 酸，且优选地，所述内质网滞留信号为KDEL。

在本发明第四方面的又一个优选实施例中，所述荧光融合蛋白包含SEQ ID No 18。

本发明第五个方面涉及含有编码如本发明上述任一方面所述多肽的多核苷酸序列的核酸分子。

本发明第六个方面涉及含有如本发明上述第一、第二、第三和第四方面所述的融合多肽的生物感应器。

本发明第七个方面涉及含有如本发明上述第一、第二、第三和第四方面所述的荧光融合多肽或如本发明上 述第六方面所述的生物感应器的细胞，其中优选地，所述细胞为细胞系U2O2。

本发明的又一方面涉及如本发明上述第一、第二、第三和第四方面中任一方面所述的荧光融合蛋白的若干 用途，或如本发明上述第六方面所述的生物感应器的用途。本发明的生物感应器的第一用途在于，用于探 测和量化第二信使，包括但不限于，cAMP、钙、甘油二脂、IP3和cGMP。如上所述，第二信使与本发明 任一方面中的荧光融合多肽的结合，使得空间构型发生巨大变化，引起胞内荧光定位的变化。该荧光易位 能够用于荧光显微镜的第二信使量化。此外，由于生物感应器中存在荧光蛋白，可以在活细胞中全程追踪 该过程。

本发明第一、第二、第三或第四方面中任一项中所述的荧光融合多肽或本发明第六方面中所述的生物感应 器的应用，涉及用作药物筛选工具。

此外，本发明第一、第二、第三或第四方面中任一项中所述的荧光融合多肽或本发明第六方面中所 述的生物感应器，尤其可用于任何获取第二信使转导读数的应用中。所述应用在本领域中众所周知。但是， 仅举例而言，本命的应用包括但不限于：

a.通过使用荧光显微仪器研究第二信使移动，来识别选自生长因子、细胞因子、G-蛋白偶联受体、 整合素和钙离子通道的作为细胞表面受体的激动剂、拮抗剂、反向激动剂或天然配体的测试化合物。在优 选实施例中，所述细胞表面受体为G-蛋白偶联受体(GPCR)。

b.受体的多肽激动剂、拮抗剂和反向激动剂的表达克隆。

c.改变第二信使胞内存在的调控因子的表达克隆。

d.建立膜分子调控因子的剂量-应答曲线。

e.测定参与了信号级联传导依赖于所述第二信使的疾病或失调的膜分子和调控因子的变化，由此将 该生物感应器用作诊断工具。

本发明的优选实施例中，本发明第一、第二、第三或第四方面中任一项中所述的荧光融合多肽或本发明第 六方面中所述的生物感应器，可用于产生用于研究G蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道和活细胞中其他蛋 白活性的稳定细胞系。本发明的生物感应器的迅速易位，允许对GPCR和离子通道刺激进行量化。

本发明的荧光融合多肽和对应的生物感应器可由本领域技术人员通过本领域已知的技术来制备，但仅作为 举例，可以如下进行构建。膜定位肽、荧光多肽、蛋白转导相互作用多肽和内质网定位信号的编码序列， 可以容易地通过PCR扩增，并克隆入穿梭质粒中。所述编码序列可以随后容易地使用各序列侧翼的限制酶 位点，以本发明所述的特定顺序克隆到最终融合质粒中。

下列实施例仅用于对本发明进行说明的目的。

实施例

实施例1.用于在活细胞中以宽生理浓度动态范围测定第二信使钙的钙生物感应器的构建和用途

本发明的发明人构建了一种荧光融合多肽，包含：如SEQ ID No 17所示的白细胞介素-2受体的胞外 域，作为膜定位肽；来自如SEQ ID No 1所示的肌球蛋白轻链激酶的钙调素结合域，作为第二信使转导蛋 白结合肽；多肽KDEL，作为内质网滞留信号；以及，turboGFP，作为荧光多肽；其中：

a.所述膜定位肽位于所述荧光融合多肽的N端，且通过连接子物理性地连接在所述荧光多肽上；而 所述荧光多肽通过连接子物理性地连接在所述第二信使转导蛋白结合肽上；以及

b.所述第二信使转导蛋白结合肽通过连接子物理性地连接在所述内质网滞留信号上，而所述内质网滞 留信号位于所述荧光融合多肽的C端。

完整的上述荧光融合多肽如SEQ ID No 15所示。

为了评估该多肽是否在活细胞中诱导的胞内荧光再分布，将turboGFP多肽克隆为荧光多肽，并在钙诱导 激活后分析该生物感应器的细胞定位。在此意义上，细胞系HEK293和U2O2稳定地转染了含有上述生物 感应器cDNA(参见SEQ ID No 15)的质粒结构。转染后，两种细胞系均呈现出荧光的膜分布。但是，当 以10ng/ml PMA和1uM离子霉素提高胞内钙浓度后，观察到该生物感应器膜分布的大幅下降。该结果表 明，胞内高浓度的增加，诱导生物感应器的构型变化，促进荧光生物感应器的再分布。该活性计算为细胞 粒度的增量。上述细胞系的3种不同克隆中，也得到了相同结果，如图2(左图)所示，这证明了所述结 果的可再现性。

其次，为了测定钙是否在生理动态范围内诱导显著构型变化，在U2O2生物感应器稳定细胞系中稳定转染 人速激肽受体1。人速激肽受体1(TACR1)亦称为神经激肽1受体(NK1R)或P物质受体(SPR)是见 于中枢神经系统和外周神经系统中的G蛋白偶联受体。该受体的内源配体为P物质，但其对其他速激肽也 有一些亲和性。P物质由神经元合成，并转运至突触囊泡中；P物质的释放，是通过钙依赖性机制的去极 化。当NK1受体受到刺激时，能够产生各种第二信使，用于触发调控细胞应激性和功能的多种不同效应 器机制。所述功能之一的结果是内源和外源钙的移动。

在96mm光学板上以20000细胞/孔接种双稳定细胞系，并以补充了10％牛胎血清的200μl DMEM F12培 养基培养。为了荧光生物感应器的再分布，以不同浓度的激动剂P物质刺激6小时。处理后，以DAPI对 细胞核染色，并以图像分析算法检测生物感应器荧光再分布。以激动剂处理细胞后，生物感应器从质膜内 化进入高密集度囊泡(图3)。其活性计算为所述细胞粒度的增量。以11log稀释系列(n＝5)处理细胞。 以激动剂处理6小时后，P物质的Ec50为约9.5x10^-12M。对于高容量筛选，以平均值Z′＝0.85+/-0.01来 验证内化实验(图4)。

为了检查与其他方法相比的生物感应器敏感性，使用Fura-2/AM比率计进行了经典荧光钙实验。使用与离 子结合的Fura2和未与离子结合的Fura2的荧光比值来测量细胞内的钙增加。使用Fura2-AM培养细胞， 并以递增浓度的P物质处理细胞，其中P物质浓度范围为0至10μM，一式四份。P物质的Ec50为约 1.4x10-8M。对于高容量筛选，以平均值Z′＝0.84来验证该钙实验。

在两个定量方法中，均使用“BD Pathway 855”高容量生物影像仪(BD Biosciences)来进行图像采集。

实施例2.用于在活细胞中以宽生理浓度动态范围测定第二信使cAMP的cAMP生物感应器的构建和用途

本发明的发明人构建了一种荧光融合多肽，包含：如SEQ ID No 17所示的白细胞介素-2受体的胞外域， 作为膜定位肽；来自如SEQ ID No 9所示的激酶A锚定蛋白(AKAP)的蛋白激酶A(PKA)结合域，作 为第二信使转导蛋白结合肽；多肽KDEL，作为内质网滞留信号；以及，turboGFP，作为荧光多肽；其中：

a.所述膜定位肽位于所述荧光融合多肽的N端，且通过连接子物理性地连接在所述荧光多肽上； 而所述荧光多肽通过连接子物理性地连接在所述第二信使转导蛋白结合肽上；以及

b.所述第二信使转导蛋白结合肽通过连接子物理性地连接在所述内质网滞留信号上，而所述内质 网滞留信号位于所述荧光融合多肽的C端。

完整的上述荧光融合多肽如SEQ ID No 16所示。

如同实施例1中的生物感应器一样，为了评估上述多肽的激活是否在活细胞中诱导的胞内荧光再分布，将 turboGFP肽克隆为荧光多肽，并在cAMP诱导激活后分析该生物感应器的细胞定位。在此意义上，细胞系 SHSY5Y和U2O2稳定地转染了含有上述生物感应器编码序列的质粒结构。两种细胞系均呈现出荧光的膜 分布。如同实施例1，该活性计算为：以10uM毛喉素和25uM IBMX处理上述细胞系的3种不同稳定克 隆36小时后，细胞粒度的增量。如图2(右图)所示。

其次，为了测定cAMP是否在生理动态范围内诱导显著构型变化，在U2O2生物感应器稳定细胞系中稳定 转染人肾上腺素β2受体。该肾上腺素受体是G蛋白偶联受体中的一类，是儿茶酚胺的目标，尤其是去甲 肾上腺素(降肾上腺素)和肾上腺素的目标。在96mm光学板上以20000细胞/孔接种双稳定细胞系，并以 补充了10％牛胎血清的200μl DMEM F12培养基培养。为了荧光生物感应器的再分布，以不同浓度的激 动剂异丙肾上腺素刺激36小时(图5)。处理后，以DAPI对细胞核染色，并以图像分析算法检测生物感 应器荧光再分布。以激动剂处理细胞后，生物感应器从质膜内化进入高密集度囊泡。其活性计算为所述细 胞粒度的增量。以11log稀释系列(n＝5)处理细胞。以激动剂处理24小时后，异丙肾上腺素的Ec50为 约2.3x10-7M。对于高容量筛选，以平均值Z′＝0.7+/-0.01来验证内化实验。实验结果如图6所示。

实施例3.用于在活细胞中以宽生理浓度动态范围测定第二信使甘油二脂的甘油二脂生物感应器的构建和用途

本发明的发明人构建了一种荧光融合多肽，包含：如SEQ ID No 17所示的白细胞介素-2受体的胞外 域，作为膜定位肽；来自如SEQ ID No 19所示的结合序列，作为第二信使转导蛋白结合肽；多肽KDEL，作 为内质网滞留信号；以及，turboGFP，作为荧光多肽；其中：

a.所述膜定位肽位于所述荧光融合多肽的N端，且通过连接子物理性地连接在所述荧光多肽上； 而所述荧光多肽通过连接子物理性地连接在所述第二信使转导蛋白结合肽上；以及

b.所述第二信使转导蛋白结合肽通过连接子物理性地连接在所述内质网滞留信号上，而所述内质网 滞留信号位于所述荧光融合多肽的C端。

完整的上述荧光融合多肽如SEQ ID No 18所示。

如此前的实施例，为了评估上述多肽的激活是否在活细胞中诱导的胞内荧光再分布，将turboGFP肽 克隆为荧光多肽，并在甘油二脂诱导激活后分析该生物感应器的细胞定位。在此意义上，细胞系U2O2稳 定地转染了含有上述生物感应器编码序列的质粒结构。该稳定转染的细胞系在甘油二脂诱导激活之前，呈 现出荧光的膜分布。如此前的实施例，通过以递增剂量的PMA处理所述细胞，将活性计算为细胞粒度的增 量。实验结果如图7和图8所示。

序列表

SEQ ID No 1:MEKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL

SEQ ID No 2:ASPWKSARLMVHTVATFNSI

SEQ ID No 3:AIGFKKLAEAVKFSAKLMGQ

SEQ ID No 4:KKTFKEVANAVKISASLMGT

SEQ ID No 5:GAVLKVLTTGLPALISWIKR

SEQ ID No 6:RGGFRRIARLVGVLREWAYR

SEQ ID No 7:GGRLALLRARLKELAALEAA

SEQ ID No 8:AEGVRNIKSMWEKGNVFSSP

SEQ ID No 9:DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY

SEQ ID no 10:VQGNTDEAQEELAWKIAKMIVSDVMQQ

SEQ ID No 11:VQGNTDEAQEELLWKIAKMIVSDVMQQ

SEQ ID No 12:FEELAWKIAKMIWSDVFQQ

SEQ ID No 13:QIEYLAKQIVDNAIQQAK

SEQ ID No 14:LEQYANQLADQIIKEATE

SEQ ID No 15:

MDSYLLMWGLLTFIMVPGCQAELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTG NSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERI YHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRP ESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTDLQVAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSGRTIGIQLVVD QQQQQQGILQSTVPMESDESGLPAMEIECRITGTLNGVEFELVGGGEGTPEQGRMTNKMKSTKGALTFSP YLLSHVMGYGFYHFGTYPSGYENPFLHAINNGGYTNTRIEKYEDGGVLHVSFSYRYEAGRVIGDFKVMG TGFPEDSVIFTDKIIRSNATVEHLHPMGDNDLDGSFTRTFSLRDGGYYSSVVDSHMHFKSAIHPSILQNGGP MFAFRRVEEDHSNTELGIVEYQHAFKTPDADAGEERSREMEKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGALKDE L

SEQ ID No 16:

MDSYLLMWGLLTFIMVPGCQAELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTG NSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERI YHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRP ESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTDLQVAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSGRTIGIQLVVD QQQQQQGILQSTVPMESDESGLPAMEIECRITGTLNGVEFELVGGGEGTPEQGRMTNKMKSTKGALTFSP YLLSHVMGYGFYHFGTYPSGYENPFLHAINNGGYTNTRIEKYEDGGVLHVSFSYRYEAGRVIGDFKVMG TGFPEDSVIFTDKIIRSNATVEHLHPMGDNDLDGSFTRTFSLRDGGYYSSVVDSHMHFKSAIHPSILQNGGP MFAFRRVEEDHSNTELGIVEYQHAFKTPDADAGEERSRVDLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAYGGKDEL SEQ ID No 17:

MDSYLLMWGLLTFIMVPGCQAELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTG NSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERI YHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRP ESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTDLQVAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSGRTI

SEQ ID No 18:

MDSYLLMWGLLTFIMVPGCQAELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTG NSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERI YHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRP ESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTDLQVAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSGRTIGIQLVVD QQQQQQGILQSTVPMESDESGLPAMEIECRITGTLNGVEFELVGGGEGTPEQGRMTNKMKSTKGALTFSP YLLSHVMGYGFYHFGTYPSGYENPFLHAINNGGYTNTRIEKYEDGGVLHVSFSYRYEAGRVIGDFKVMG TGFPEDSVIFTDKIIRSNATVEHLHPMGDNDLDGSFTRTFSLRDGGYYSSVVDSHMHFKSAIHPSILQNGGP MFAFRRVEEDHSNTELGIVEYQHAFKTPDADAGEERSRVAARKRKGSFFYGGKDEL

SEQ ID No 19:

AARKRKGSFFYGG

SEQ ID No 20:

MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQC FSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHK LEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSK DPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK

SEQ ID No 21

MFKGIVEGIGIIEKIDIYTDLDKYAIRFPENMLNGIKKESSIMFNGCFLTVTSVNSNIVWFDIFEKEARKLDT FREYKVGDRVNLGTFPKFGAASGGHILSARISCVASIIEIIENEDYQQMWIQIPENFTEFLIDKDYIAVDGISL TIDTIKNNQFFISLPLKIAQNTNMKWRKKGDKVNVELSNKINANQCW

SEQ ID No 22

MESDESGLPAMEIECRITGTLNGVEFELVGGGEGTPEQGRMTNKMKSTKGALTFSPYLLSHVMGYGFYH FGTYPSGYENPFLHAINNGGYTNTRIEKYEDGGVLHVSFSYRYEAGRVIGDFKVMGTGFPEDSVIFTDKII RSNATVEHLHPMGDNDLDGSFTRTFSLRDGGYYSSVVDSHMHFKSAIHPSILQNGGPMFAFRRVEEDHSN TELGIVEYQHAFKTPDADAGEE

SEQ ID No 23

MVSKGEELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYG SRTFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGVNFPSNGPVMQKK TLGWEANTEMLYPADGGLEGRSDMALKLVGGGHLICNFKTTYRSKKPAKNLKMPGVYYVDHRLERIKE ADKETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHKLN

SEQ ID No 24

MVGEDSELITENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMKIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYG SKAFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERITTYEDGGVLTATQDTSLQNGCLIYNVKINGVNFPSNGPVMQKK TLGWEASTEMLYPADSGLRGHGQMALKLVGGGYLHCSLKTTYRSKKPAKNLKMPGFHFVDHRLERIKE ADKETYVEQHEMAVAKYCDLPSKLGHS

SEQ ID No 25

MSGGEELFAGIVPVLIELDGDVHGHKFSVRGEGEGDADYGKLEIKFICTTGKLPVPWPTLVTTLCYGIQCF ARYPEHMKMNDFFKSAMPEGYIQERTIQFQDDGKYKTRGEVKFEGDTLVNRIELKGKDFKEDGNILGHK LEYSFNSHNVYIRPDKANNGLEANFKTRHNIEGGGVQLADHYQTNVPLGDGPVLIPINHYLSTQTKISKD RNEARDHMVLLESFSACCHTHGMDELYR