公开/公告号CN104781669A
专利类型发明专利
公开/公告日2015-07-15
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申请/专利权人 谢鲍生物科技股份公司;
申请/专利号CN201380046821.2
发明设计人 H.舍费尔斯;U.舍费尔斯-博尔歇尔;
申请日2013-07-09
分类号G01N33/558(20060101);G01N33/573(20060101);G01N33/574(20060101);G01N33/72(20060101);
代理机构72001 中国专利代理(香港)有限公司;
代理人李慧惠;吕彩霞
地址 德国吉森
入库时间 2023-12-18 09:43:13
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-03-08
授权
授权
2015-08-12
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/558 申请日:20130709
实质审查的生效
2015-07-15
公开
公开
发明领域
本发明涉及商业上可应用的、成本降低的、新型检验试剂盒（组合的快速检验盒）、体外医疗设备、侧流盒（lateral flow cassetee）、现场即时检验（point of care test）、组合的快速检验、生物测定、快速侧流测试条、平台，用于实施用于在人和/或动物的粪便中检测生物标记物的方法。所述检验试剂盒通过检测可以提供生理变化指示的生物标记物、特别是在胃肠道中恶性事件（食管、胃、小肠、胆管、胰腺和结肠）、特别是肠的肿瘤和肿瘤前体（息肉、腺瘤）的生物标记物，用于健康分析、早期检测和“结肠癌预防”。本发明更特别地涉及用于同时执行免疫层析检测方法的组合的快速检验和组合的快速检验盒和其组分以及需要的试剂。同时的（Synchronous）在语言学含义上是指“同步的”（“simultaneous”），但是同时的在技术含义上还指用于在快速检验盒中检测两种生物标记物肿瘤M2-PK和血红蛋白的活性配对（层析条件、膜、试剂、分配速率等，见描述）的共同的最优协调组合。
本发明进一步涉及评估检验和结果展示（使用交通灯颜色的“风险影响方案”）的更简单的方法。
将组合的快速检验用于在结肠癌筛选程序中的“预过滤”先证者（“pre-filtering” probands）。因为在先证者中实施非侵入性的组合的快速检验比执行侵入性的结肠镜检查导致显著地有更少的焦虑，该检验导致增加的结肠镜检查的参与。
发明背景
癌症，特别地结肠癌是在德国最常见的癌症（65,000例新病例，27,000例死亡）。在欧洲，每年有200,000人死于这种危险的疾病。由于结肠癌的起源方式，结肠癌疾病的结果可以通过成功的筛选，即前体（息肉/腺瘤）的检测和其移除，显著地最小化。
在德国每20分钟有一人死于结肠癌。结肠癌几乎总是从肠壁（intestinal lining） （黏膜）最初的良性生长发展。癌症缓慢地生长并且罹患的人长时间不会注意到它。通常地，症状只会在当肿瘤变大或已经转移时出现。如果未治疗，结肠癌随后通常在12个月内导致死亡。
因为它的起源方式，结肠癌的结果可以通过无症状的先证者的成功筛选几乎完全地预防。前体（息肉/腺瘤）可以通过筛选措施在早期检测到。结肠镜检查被视为结肠癌早期检测最好的方法（黄金标准）。结肠镜检查是只能由特别训练的医生（例如，胃肠病学家）执行的侵入式方法。该过程涉及风险（例如，穿孔、麻醉的风险）。预防性的结肠镜检查由医疗保险对年龄55岁和以上的人群覆盖。然而参与率只有2-3%，并且尽管进行了相当大的教育努力和市场推广，“美丽世界行动”（“glamour world actions”），参与率如今甚至在下降！除了其它之外，这一问题存在的理由是很多人发现检查的过程令人不愉快（心理抑制阈值）。
本发明的目的：
1. 降低心理抑制阈值。
2. 增加筛选结肠镜检查的参与率。
3. 校准（去除质量差异）。
4. 标准化。
5. 增加诊断准确性。
方案：
提供简单的、强劲的、廉价的、适合日常的侧流检验，其同样适合通过同时检测两种特异性生物标记物（M2-PK和血红蛋白），用于检测不正常的胃肠疾病，特别是结肠癌和它的前体。组合的快速检验是简单的并且可以容易地执行，适合用于减少鉴于筛选结肠镜检查的心理抑制阈值。只有一种生物标记物M2-PK和/或血红蛋白的阳性诊断会导致医生实施结肠镜检查用于进一步的诊断。会导致通过结肠镜检查的结肠癌和它的前体的更高的检测率，因为使用先前的组合的快速检验获得了先证者的预选。因为所述组合的快速检验同时测定结肠癌的两种重要生物标记物，该检验作为结肠镜检查前的双过滤器。
具有其前体的结肠癌（息肉-癌症序列）在肠（黏膜）内开始并且随后扩散至组织的其它区域（黏膜下层、肌层、浆膜）。越过黏膜边界的肿瘤生长称为早期或晚期的结肠癌。因为粪便与肠黏膜直接接触，生物标记物可以在胃肠道中作为病理变化的指示物比在血液中更早并且更特异地分析检测。因此，粪便样本比血液样本优选。只有当肿瘤到达黏膜下层时，早期生物标记物在血液中是可检测的。当这些标记物在血液中可检测时，它们是结肠癌和它的前体的“晚期”形式（“late”forms）。通常地，粪便中生物标记物的测定相比在血液中生物标记物的测定是有利地。越早检测到癌症和它的前体，越能更好的预后。初始的治疗（例如，治疗性结肠镜检查、“小的内脏”手术）导致早期结肠癌几乎100%的治愈。
结肠镜检查被视为在肠中检测恶性的、特别是肿瘤过程的“黄金标准”。
只允许特定有资格的医生实施结肠镜检查。结肠镜检查进一步的缺点是它不是标准化的。进一步地，“错误的”先证者进行了结肠镜检查。在肠检查（结肠镜检查）期间（所述检查是早期检测的关键组分），约70%的诊断在正常范围内。在只有约四分之一的病例中，诊断出前体，并且在1%的病例中，诊断出癌。因此筛选结肠镜检查是非常低效并且还是昂贵的筛选方法，因为过多的健康先证者进行了结肠镜检查（要减少医疗成本！）。
因此，期望在结肠镜检查前执行非侵入性的、廉价的并且敏感的、可靠的检验，其同时测量多个生物标记物，以便使具有阳性检验结果的先证者以针对性的方式进行结肠镜检查（减少死亡数）。通过根据本发明的非侵入性的组合的快速检验方法，在用于检测结肠癌和它的前体的筛选程序中的参与率可以极大地增加，并且因此可以获得在患有结肠癌和它的前体的患者（与先证者不同！）生存率的显著增加。如果及时检测到结肠癌和它的前体，这导致患者几乎100%的康复机会。诊断：增加的M2-PK水平和/或血红蛋白水平（在既往病例等的帮助下）导致测量“包”（a “package”of measures）的开始，并且进一步的步骤导致结肠癌的诊断。所述诊断转而导致医生指示，例如手术治疗措施，并且这转而导致结肠癌的治愈，例如，通过手术的治疗可以减少死亡率。
同样，在体外检验中，与全部诊断方法一样，所谓的敏感性和所谓的特异性是决定性的质量特点。敏感性是识别像这样的患病个体的可能性。该质量测量在医学领域非常重要，因为在早期检测测量中，当然要尽可以少的忽视患者。特异性是识别像这样的健康个人的可能性。该测量同样在早期检测中是重要的，因为应当避免将健康的人误诊为患病，使之得到不需要的治疗。
现有技术水平
愈创木脂检验（Guaiac test）（gFOBT）（样本材料：粪便）
该化学的粪便检验是基于愈创树脂。通过化学氧化还原反应，将患者粪便样品中隐藏的（潜隐的）血量检测到。因为该化学检验是基于氧化还原电位，并且氧化剂和还原剂对该氧化还原电位干扰，这将是该检验的干扰，并且会导致低敏感性和特异性。在食物中含有氧化剂和还原剂。因此，该检验具有低敏感性和特异性并且因此认为是过时的和淘汰的。此外，已知只有结肠癌和它的前体的严重的流血形式，而不是轻微的流血形式可以检测到。此外，已知存在癌症和它的前体的流血、不流血和间歇性流血形式。因此，取决于取样的时间，可以将结肠癌和它的前体忽视。
免疫学粪便检验（iFOBT）（样本材料：粪便）
免疫学体外检验也是寻找潜隐血（occult blood），发现其通过前体（息肉）和肿瘤早期阶段进入粪便中的方式。通过使用针对血红蛋白或针对血红蛋白/结合珠蛋白复合体的特异性抗体实现检测。超过10家生产商/经销商提供这些iFOB检验。然而，在市场上提供的检验显示出质量上的极大的差别（对于敏感性和特异性），只有专家，而不是所期望的大量普通实践者（使用者），能够识别这些差别。
此外，应当提及的是这些在粪便检验中所谓的血液只是间接地检测结肠癌和它的前体，因为它们不是对癌症和它的前体特异的，而只是用于检测血液（对结肠癌非特异性）。与经典的愈创木脂检验（gFOBT）一样，这些检验只可以检测结肠癌或它的前体的流血形式。此外，已知结肠癌和它的前体有流血、不流血和间歇性流血的形式。因此，取决于测定的时间，可以将结肠癌和它的前体忽视。
通过使用gFOBT 和iFOBT 检验，只有流血的肿瘤和它们的前体可以检测到。
因此，这些检验可以“检测”并“忽视”结肠癌和它的前体。
一般而言：
因此，偶然地和病理生理地，粪便中的潜隐血只是间接地涉及结肠癌和它的前体！
酶促粪便检验（M2-PK）（样本材料：粪便）
该检验不能检测粪便中潜隐血，而是检测对癌症典型的酶。该酶通常大量存在于各种癌症的恶性变化的组织中——同样包括结肠癌和恶性变化的结肠息肉。该检验，其同样可以在市场上以侧流检验和ELISA的形式得到，检测生物标记物肿瘤M2-PK。所述肿瘤M2-PK是丙酮酸激酶（PK）的特别的同工酶。在正常组织中，所述丙酮酸激酶（M1-、M2-PK形式）以四聚体形式存在（M2-PK四聚体）。在癌症和它的前体中，发现该PK的二聚形式（二聚M2-PK=肿瘤M2-PK）越来越常见。针对该特别的肿瘤M2-PK分子，已生产两种不同的单克隆抗体。这些肿瘤M2-PK特异性的特别的抗体可以在市场上可得到的检验中使用（在ELISA和/或侧流形式中使用）。
一般而言：
偶然地并同样是病理生理地，所述生物标记物M2-PK直接地涉及癌症和它的前体。到目前为止所述酶M2-PK（同工酶M2-PK的二聚形式）通常在检测的全部肿瘤中（例如，12种不同组织/器官的肿瘤），同样在结肠癌和它的前体中，可以检测到。
临床研究已显示在市场上的肿瘤M2-PK检验（以侧流和/或ELISA形式）可以检测流血和不流血的结肠癌和它的前体。
然而，这些检测（测试条）同样可以“忽视”结肠癌和它的前体。因此，本发明的进一步的目标是提供改善的M2-PK检测（测试条）。
技术方案：
根据本发明的检验试剂盒包括由塑料盒和两种较现有技术（“iFOBT”、“免疫检验”、“粪便血液检验”）改善的用于测定M2-PK和血红蛋白的新型测试条组成的组合的快速检验。
血液检验（样本材料：血液）
肿瘤将DNA（和/或甲基化的DNA）释放至血流中。这样，结肠癌留下了典型的信号——生物标记物。使用血液检验可以检测该生物标记物。为了该目的，医生从先证者获取血液样本并且将其送至特定的实验室用于通过不适合每天使用的PCR技术的方法进行相当复杂的、昂贵的测定和评估。
一般而言：
偶然地和同样病理生理地，DNA甲基化模式、信号、典型的痕迹（生物标记物SEPT9，septin-9血液检测）只是间接地涉及癌症和它的前体。
M2-PK可以只检测流血和不流血的肿瘤和它的前体。但是M2-PK检验同样“忽视”结肠癌和它的前体。因此，本发明的目标是实现改善。该目标通过本发明的权利要求和技术描述实现。
先前已知的肿瘤M2-PK检验（以侧流PCT/EP00/09303和/或ELISA的形式）以及gFOBT 和iFOBT 的缺点是：三种检验均不能通过其本身覆盖整个诊断相关时期，特别是涉及患者。
从WO 2007/071366 A1（Roche Diagnostics GmbH）已知一种方法，其在粪便中测定了肿瘤M2-PK和血红蛋白。两种参数的定量测定在两个分开的检验中执行，评估应当通过数学算法进行。在上述文件的描述中，提及了大量可能的方法，其可以是发展这样的算法的基础（见第7页，12行—第9页，21行），没有实际已经公开的评估算法。该文件的技术教导因此只涉及搜索评估算法的方法。
用于息肉-癌症序列的全部阶段的完全诊断的检测/查找的方法没有在现有技术中描述过。
因此，发展用于检测结肠癌和它的前体是目标，这使得在单个检验中，可靠地和完全地检测息肉-癌症序列的全部诊断可检测阶段的成为可能。所述检验应当允许血红蛋白和肿瘤M2-PK的同时测定。
该目标通过在肠内诊断/检测病理变化的根据本发明的方法，通过特异的检测血红蛋白和肿瘤M2-PK的检验试剂盒（组合的快速检验）的方式实现。通过根据本发明的方法的帮助，在当上述任一分析物（血红蛋白、肿瘤M2-PK）出现时安全地并且非常早地检测已经出现的病理变化是可能的。
令人惊讶地，已经显示出通过使用根据本发明的组合的快速检验和两种用于测定M2-PK和血红蛋白的新的、改善的测试条，以及用于同时实施免疫层析检测方法所需要的试剂，可以解决相比在两个分开的盒或一个盒中使用两种生物标记物增加整体敏感性的技术问题。
因此，本发明更特别地涉及用于同时实施免疫层析检测方法的组合的快速检验和组合的快速检验盒和组分及需要的试剂。同时地（Synchronously）在语言学含义上是指在相同时间，但是同时地在技术含义上还指用于在组合的快速检验盒中检测两种生物标记物M2-PK和血红蛋白的活性配对、层析条件（特别对两种新的测试条）的共同的、最优的协调。
然而，这只有通过盒和全部组分（膜和规格（specification）（毛细流速等）的选择）的最优化、所谓背衬（backing）的选择、洗涤剂和增溶剂的选择、液体扩散相对于蛋白质扩散、选择的膜的特异性（例如，硝酸纤维素膜相对于尼龙），样本垫选择和规格、结合垫选择和规格、吸附垫选择和规格、粘合卡选择和规格、外壳（塑料盒、双盒）选择和规格、生产方案才是可能的。
基于免疫层析原理的体外诊断测试条是现有技术中已知的。从设计阶段通过全部产品改善至最终生产过程考虑免疫层析测试条，随后使用生物学、化学、物理学和工程学原理执行。
以下专利号描述了关于那些相关技术的教导：例如US 433,734、US 4,376,110、US 4,435,504、US 4,703,017、US 4,855,240、US 4,954,452、US 5,028,535、US 5,075,078、US 95/16207、US 5,654,162、EP 0810436 A1。
在一个检验盒中具有多于一个测试条的检验盒（组合的检验盒）属于现有技术（通过测试条(strip)检验的药物检测）。进一步地，已知这些盒用于测定血红蛋白/结合珠蛋白复合物和血红蛋白。已知目前为止只有单个的检验盒（single test cassettes）用于同时测定M2-PK和血红蛋白。单独的两种检验会“忽视”很多病理变化。除其它之外，对于此的原因是，测试条“较差”设定的截止和较差选择检验系统的层析条件。检验系统的生产商的挑战是所谓“截止”（“cut-off”）的最优选择。原则上，该截止可以从先证者群体的测量值的直方图（histogram）得到。技术问题是在“健康的”和“患病的”先证者之间区分。该问题通过所述检验试剂盒和通过提供具有改善的截止和层析条件的两个新的测试条在技术上解决。截止的重要性由van Rossum在研究中解释，没有已知公开使用最优截止的血红蛋白和肿瘤M2-PK的测量的检验试剂盒。
本发明的目标是改善所述截止和较差选择的层析条件。根据本发明，所述目标通过提供检验试剂盒、组合的快速检验盒在技术上实现，所述组合的快速检验盒含有两个新的测试条，其具有“良好的”调节的截止以及良好选择的层析条件，用于实施组合的快速检验。
从文件WO 01/21826 A2、WO 02/50546 A2和 WO 03/069343 A2，已知用于检测胃肠道肿瘤的肿瘤标记物的不同方法，其中为胃肠道的肿瘤标记物检查了先证者的粪便。这些方法已经在实践中证明是成功的，但是仍然展示出高数量的假阴性和/或假阳性结果。这是可改善的。
在另一方面，已知为检测肿瘤而检测肿瘤标记物的各种方法，其基于在血液或血清中检测肿瘤标记物（见，例如，Anticancer Research 19:2785-2820 （1999）; WO 03/065003 A2, Leman ES, 等, Cancer Res. 67 （12）:5600- 5605 （2007）, 和 Leman ES 等, Clinical Cancer Research 14:1349-1354 （2008））。在一方面，对于诊断肿瘤疾病毕竟是有利的，同时在另一方面，对各种肿瘤疾病的生物标记物的检测不允许得到关于受影响的器官或组织的性质和位置的可靠信息，因为肿瘤标记物在极少的情况下是真正的组织特异的，并且因此在对肿瘤标记物的血液分析的阳性结果的情况中，没有关于受影响的组织的可靠的结论是可能的。因此需要额外的昂贵的并且复杂的诊断方法来可靠地测定真实存在的肿瘤类型。因此血液、血浆或血清的标记物主要用于肿瘤的治疗和跟踪随访（follow-up）。
此外，该检测方法暗示发现了在肿瘤中形成的肿瘤标记物以足够的量进入血流或进入血清的途径。在癌症发展的早期，特别是结肠癌，还没有发现足够量的这些肿瘤标记物进入血流的途径，由此通过血液或血清检查的检测是不可能的。
生物标记物的同时检测
此外，为了同时地、精确地检测根据本发明的生物标记物（M2-PK和血红蛋白），需要对在检测盒中测定（可靠的检测=没有统计学置信区间的超过数）两种生物标记物的共同协调（common coordination）的技术方案。这意味着共同的层析条件。见图1至图6。
这通过以下实现：在根据本发明的参数选择意义上，选择用于在组合的快速检验盒中检测所述两种生物标记物M2-PK和血红蛋白的层析条件的共同的最优的协调。
具体地，通过盒和其组分的最优化（膜和规格（毛细流速等）的选择）、所谓的背衬处理的选择、洗涤剂和增溶剂的选择、液体扩散相对于蛋白质扩散、选择的膜的特异性（例如，硝酸纤维素膜相对于尼龙），样本垫的选择和规格、结合垫的选择和规格、吸附垫的选择和规格、粘合卡的选择和规格、外壳（housing）的选择和规格、生产方案来实现。
根据本发明的具有两种检验领域的（使用硝酸纤维素膜）这种组合的盒的生产根据体外诊断装置（IVD）指示98/79/EC和根据ISO 13485和质量管理QM ISO 9001实施。
技术问题
通过已应用的筛选方法（gFOBT、 iFOBT、肿瘤M2-PK、筛选结肠镜检查）获得较差的临床敏感性和特异性。
本发明目标
改善临床敏感性（阳性预测值）和特异性（阴性预测值），特别是敏感性。
技术方案
根据本发明的组合的检验盒的用途，其获得优于使用两种检验盒（可能是两个不同的生产商）的显著优势（更高的全面敏感性）。在现有技术中，存在侧流检验（ScheBo M2-PK Quick Test）用于将结肠镜检查有目的性地引入无症状先证者。
技术问题
敏感性和特异性的改善。
技术方案
根据本发明的组合的检验盒的用途，其能够同时免疫化学的测定潜隐血和肿瘤M2-PK生物标记物。
根据本发明的组合的检验盒含有两个侧流测试条。两个测试条均不对应现有技术，而是各自代表根据本发明的更好的侧流检验方法。即，相比于现有技术，在本发明优选的实施方案中的组合的检验盒上，优化的肿瘤M2-PK检验=M2-PK plus检验并且改善的iFOB检验=iFOB plus检验。
在组合的盒（具有用于实施所述检验的全部必需的试剂和组分的检验试剂盒）中使用协调的截止，同时（在技术含义上）检测生物标记物肿瘤M2-PK和血红蛋白比通过两种侧流盒（具有用于实施检验的两种不同试剂和组分设定的两种检验试剂盒）的方法按时间顺序处理（测定）两种生物标记物（肿瘤M2-PK和血红蛋白）具有优势，因为特异的固相/液相抗体，以及组合的检验试剂盒全部需要的试剂和组分是良好的协调的。例如：如果使用者会购买ScheBo侧流检验用于测定肿瘤M2-PK和购买来自另一个生产商的另一种侧流检验用于测定血红蛋白，并且以时间顺序的方式处理它们，他或她会通过这些不同的和不协调的检验的方法获得较差的临床敏感性和特异性。
本发明的目标和技术方案：
1. 通过有目的性地引入（targeted introduction）结肠镜检查减少医疗保健费用。
2. 为结肠癌的早期检测提供有目的性的、简单的、可管理的“进入诊断”。
3. 通过提供根据本发明用于同时测定肿瘤M2-PK和iFOB测定以优化这样的个体（先证者）的选择的组合的快速检验盒的方法通过早期检测改善个体结肠癌疾病的预后，其需要通过结肠镜检查的特定的进入诊断。用于结肠镜检查的预选的技术问题可以使用根据本发明的组合的快速检验盒解决。只有那些在分析物（肿瘤M2-PK和/或iFOB检验）的测量中是阳性诊断的先证者以针对性的方式经历结肠镜检查。根据本发明的组合的快速检验盒在选择过程中作为双重“过滤器”作用。
4. 提供根据本发明的侧流双检验盒和具有特定的理化性质的全部相关试剂、特异性抗体（抗-肿瘤M2-PK（特异表位）、抗-血红蛋白（特异表位）），例如，特定结合常数和特定动力学特征。此外，直接针对两种不同的分析物选择的固相和液相抗体，具有例如，在侧流检测方法中特定的特性（例如，与玻璃纤维、硝酸纤维素膜的兼容性，对例如金胶体的良好的耦合特性）。
5. 在组合的快速检测中使用特异性的抗体，所述抗体对肿瘤M2-PK或血红蛋白在它们的结合特点上特异，并且可以用于免疫层析方法（例如，是“膜-适应”、“洗涤剂-适应”）
6. 通过提供根据本发明用于目标引导至侵入性方法-结肠镜检查-并且因此靶向对治疗程序（手术、化疗）的准备（根据“诊断的”测量-决策树/决策矩阵）的组合的快速检验减少来自结肠癌的死亡率。
7. 最优化关于结肠癌和它的前体的检测的筛选措施的成本/效益。
从文件WO 01/21826，已知肿瘤M2-PK可以通过层析处理的方法在测试条上检测到。因此，例如，在该检验中，测试条可以（硝酸纤维素膜）在需要的抗体在测试条的多个区域以可溶的形式或固定的固相排列上使用。如果，例如，肿瘤M2-PK和/或血红蛋白在样本中存在，样本（例如，粪便提取物，多种物质的混合物，并且有在洗涤剂溶液中检测的分析物）或样本的液体部分或提取物可以通过测试条迁移并且在检测位点产生信号。高特异性的捕获抗体的根据本发明的使用确保来自粪便提取物的目标蛋白质（例如，肿瘤M2-PK）的结合。通过在第二种高特异性的抗体存在时使用金胶体，在例如肿瘤M2-PK存在时形成免疫复合体。该分析物检测复合体可以作为测试条上的线用肉眼观察到。测试条上单独的组分的精确安排取决于应用的免疫学方法，并且是本领域技术人员已知的。特别的挑战是最优抗体的使用。在根据本发明的组合的快速检验中，使用特异地结合肿瘤M2-PK的特定抗体。
肿瘤M2-PK特异性抗体结合（同样立体特异地M2-PK的二聚体形式）一个具有至少四个氨基酸长度的以下表位或其片段：
这些表位或其片段（具有四个氨基酸的最小长度）中的一个或其组合在粪便样本提取物中的出现，是在胃肠道中病理变化（结肠癌或它的前体）的指示。
在粪便检验（gFOBT）中所谓的血液展示了不充足的敏感性，对检测结肠癌只有25%。与之相比，肿瘤M2-PK检验具有80%的更高的敏感性。使用肿瘤M2-PK检验，大于1cm的息肉可以以60%（FOBT：20%）的敏感性检测，小于1cm的息肉以20%（FOBT：0%）的敏感性检测（全部数值对95%的特异性）。
通常地，在粪便检验中免疫层析的血液比通常使用的gFOBTs显示出对结肠癌和它的前体更高的敏感性，因此在考虑表达性上gFOBTs劣于iFOBTs。
阳性率和特异性和敏感性在这些检验中有广泛的变化。观察到的模式暗示显著不同的阳性率是基于不同的截止水平、不同的边界区域和来自不同国家的各生产商的检验的限制。来自不同生产商的生产质量也不同。
来自不同生产商的检验试剂盒提出了不同的截止（=容许限，其表示容许残留值）。容许残留值在当认为检验结果是阳性或阴性时特异。将截止从检测限定的概念中区分。（Lit: Inter-test agreement and quantitative cross-validation of immunochromatographic fecal occult blood tests, Hermann Brenner 等, Int. J. Cancer （2010））。
因此，可以观察到在单个检验的检验特征中巨大的变化（技术问题）。因此，在科学文献中，要求制作更好的检验试剂盒并且发现和使用优化的截止（H. Brenner, S. Tao, European Journal of Cancer （2013））。
进一步的研究证实在市场上可获得的检验试剂盒的高度变化（Brenner et al., Int. J. Cancer, 2010）。这导致在该领域内对能够指示粪便样本中的肿瘤M2-PK和血红蛋白的检验试剂盒的高度需求，使用截止，确保最高可能的诊断效率。
该技术问题通过提供包括含有比现有技术改善的两种测试条的组合的盒的检验试剂盒解决。
通过全面的内部测量已经发现并测定了两种生物标记物的截止水平、边界区域和限制。检测通过生物标记物水平直方图的描述性统计分析和解释（箱线图分析和Kruskal-Wallis计算）执行。为了实现更好的临床敏感性和特异性，用于同时测定两种生物标记物的两种测试条的生产和层析条件的调节代表了主要的挑战。这通过调节全部化学和生理条件（见权利要求和实施例）在技术上解决。因此，选择用于测定两种生物标记物的全部条件，以使当实施所述组合的检验时，获得尽可能少的“假阳性”和“假阴性”，以便以这种方式显著地提高诊断效率（其表明全部真阳性和真阴性检验结果对于全部结果总和的比例）。
为达到该目标，寻找并发现了技术方案。为了所述技术方案，发现了在协调的层析和协调的材料条件下，即，膜的适当选择、运行条件等，生物标记物在技术含义上的同时检测，（见实施例和权利要求）。
肿瘤标记物是对于正常比较组织，在肿瘤组织中差异表达的遗传产物，即，肿瘤标记物相比于正常组织，在肿瘤组织中过表达或低表达。为了实践，那些过表达的肿瘤标记物更加重要，因为样本的阳性分析结果（生物标记物的存在）指示的生物标记物特异的肿瘤的存在。肿瘤标记物存在于组织细胞的细胞质中，同样可以存在于体液中，诸如血液、尿液、汗、精液、唾液等，同样存在于粪便中。
肿瘤标记物应当具有以下性质：i）高特异性，即，对良性疾病和健康的人不能检测到，ii）高敏感性，即，其可以在高百分比的肿瘤人群中检测到，iii）器官特异性。iv）与肿瘤阶段或肿瘤质量（mass）良好的相关，v）与预后的关系，和vi）可靠的预测水平。100%特异性和100%敏感性的标准和其它所列的标准直到现在没有通过任何一种已知的肿瘤标记物满足。
其它以外，对胃肠道肿瘤的特异的肿瘤标记物包括CCSA-2、CCSA-3、CCSA-4、CC2、CC3、CC4、CC5、CC6a、CC6b、L1、L2、N1、N2、N3、N4、N5和 N6（见，例如，WO 03/065003 A2; Leman ES等, Cancer Res. 67 （12）:5600-5605 （2007）和 Leman ES等, Clinical Cancer Re-search 14:1349-1354 （2008））。然而，这些肿瘤标记物只在血浆检验的情况下在现有技术中使用，导致上文提及的缺陷。
期望的是能够尽快检测到在胃肠道中的肿瘤事件，特别地在生长阶段，此时肿瘤还没有与身体的血管系统完成接触（例如，已经在“息肉-癌症序列”中，即，在黏膜下层渗透前）。如果在胃肠道中有怀疑的瘤事件，特别是关于所谓的在息肉中的腺瘤-癌序列，在现有技术中，会试图通过各种测定方法在粪便中检测潜隐血。为了该目的，使用非免疫学检验（例如，假性过氧化酶活性、卟啉检测）和免疫学检验（Favenne L. 等, （1992） Ann. Biol. Clin. 50:311-313）。
然而，两种检验原则都不是非常特异的。此外，基于氧化还原反应的非免疫学检验（检验原则）可以通过多种因素（假阳性/假阴性，例如，通过在患者方面未遵守绝对需要的饮食要求和大量药物和过量的维他命C的摄入（例如，在蔬菜、果汁中等），Thomas L., Labor und Diagnose, 5th edition, 1998）干扰。
在粪便中的潜隐血的阳性检验必须澄清至这样的时间，直到定位出血来源或发现出血原因。在任何情况中临床诊断判断迅速地执行进一步的诊断（“通过排除诊断”）例如，通过内窥镜检查、超声波、X-光。
发明的技术问题
存在的现有技术M2-PK侧流检验（测试条）忽视了病理变化。
根据本发明的M2-PK plus测试条同样忽视了病理变化。
存在的现有技术iFOBT忽视了病理变化。
根据本发明的iFOBT plus测试条忽视了病理变化。如果根据本发明改善的检验M2-PK plus和iFOBT plus均作为测试条在组合的盒中一同放置，根据本发明获得对在肠内的病理变化更高的识别率。问题的技术解决，特别是对两种生物标记物同时检测的活性配对的选择（见实施例和根据本发明所列的组分和活性成分，抗体的正确选择和对各参数截止的正确选择、分析敏感性、毛细流速等），是根据本发明的参数选择的主题。
因此本发明的技术目标是说明简单构建的检验试剂盒（组合的快速检验），其用作人或动物粪便中检测标记物、生物标记物、特定的酶生物标记物的方法，所述方法适合用于检测在胃肠道和腹腔（食管、胃、小肠、胆道、胰腺和结肠）中的恶性事件，特别是肠部肿瘤和肿瘤前体（息肉、腺瘤）。根据本发明的组合的检验试剂盒（组合的快速检验）试图允许以简单的方式检测病理变化，以使此该检验可以通过技术人员实施。
特别地，本发明的技术目标是满足持续增长的对特异的、简单实施的方法的需求，以使病理事件，特别地肿瘤事件可以特别早地且毫无疑义地检测，特别地关于所谓的具有息肉的腺瘤-癌序列问题。
本发明的原则和优选的实施方案
为解决该技术问题，本发明教导了用于检测胃肠道中病理事件的检验试剂盒（组合的快速检验），其中人或动物的粪便样本溶解于特定的提取缓冲液中，在载体上应用，并且肿瘤M2-PK和血红蛋白均在支持物上检测。在此，以在视觉上用肉眼的简单的方式发生读取（不使用设备）。
在本发明优选的实施方案中，血红蛋白以血红蛋白/结合珠蛋白复合体（Hb/Hp）的形式测定。已经发现上文提及的生物标记物的测量对测定早期恶性变化，特别是肿瘤特别地适合。通过测量该生物标记物组合，肿瘤M2-PK+血红蛋白；肿瘤M2-PK+血红蛋白/结合珠蛋白复合体（Hb/Hp），实现显著改善的说明（报告）的准确性，特别是假阴性的显著减少，并且假阳性诊断的显著减少。
这是特别令人惊讶的，因为关于其它在粪便中的特定分析物（蛋白质）的广泛研究没有发现任何它们作为生物标记物，特别是作为肿瘤标记物应用的证据。提及的肿瘤标记物的结构和物理化学性质明显地没有受到胃肠道显著的蛋白水解活性和极端生理条件（例如，pH，胃中的酸，肠中的碱）的影响。这同样应用于通过免疫学方法的方式检测的生物标记物。因此发现并显示：不管上文提及的在胃肠道中的蛋白质变性和蛋白质分解，在肿瘤患者的粪便中可以实施数种酶生物标记物的特异的检测。
对检测酶生物标记物必需的系统在商业上不容易获得。为发展根据本发明的组合的快速检验，检测限制和试剂的组合物（根据本发明：对于两种分析物对液相和对固相特异的抗体，为同时测量分析物的最优化），和缓冲溶液、洗涤剂等，必须以代价极高的方式调节。
因此，在M2-PK和/或血红蛋白阳性粪便样本中，立刻获得在胃肠道中即特别是在肠、食管、胃、胆道、胰腺和/或结肠中，病理的、潜在肿瘤特别是恶性事件的指示，并且因此能够确定在胃肠道中事件的位置。
应当注意的是粪便样本不能作为“体液”样本考虑，因为整个胃肠道在生物学上是位于身体之外的。
使用根据本发明的方法，现在有可能以非侵入性方法，以简单的方式通过测定多个所述肿瘤标记物蛋白质，在粪便中检测恶性肿瘤事件，并且同时使用阳性检验步骤，能够清楚地确定肿瘤存在于胃肠道中并且不是在身体的其它位置。
通过该方法，这不但有可能产生“初始怀疑”、“初级诊断”、诊断，而且有可能有跟踪随访。因为单独的蛋白质分布，可以存在单独的诊断。
令人惊讶地，使用根据本发明的组合的快速检验在粪便中检测作为游离蛋白质的所述酶生物标记物是可能的。这是进一步有利的，因为所述检验可以通过助理实施，例如，通过医学技术助理（MTA）实施。由于两种分析物（肿瘤M2-PK和血红蛋白）同时检测的事实，具体地避免读数错误（例如，由MTA），因为为了所述检验的实施，患者的两个样本液滴成功地应用（自然地，有数秒的延迟），并且在数分钟的特定时期后，读出两个结果。通过该步骤，不但实现了更方便的检验步骤，而且实现了错误来源的减少（相比于常规检验）。
对根据本发明的检验，不需要从粪便分离细胞并且分析细胞中含有的蛋白质。发现固体肿瘤将提及的酶生物标记物作为可溶蛋白质释放至胃肠道的内腔中，并且这些生物标记物不存在于剥落的胃肠上皮细胞中。所述酶生物标记物从肿瘤细胞释放，以蛋白质通过胃肠道，并且可以最终在粪便中以蛋白质检测到。该可能性，也就是这些蛋白质在例如通过胃和肠后在粪便中仍然可检测，是不能期望的，因为会期望在正常的分解过程中正常地各自蛋白质的高程度的分解。
在本发明的情况中，已发现即使在已经储存较长时间（例如，当运输样本时）的高度均质的粪便样本中，所述酶生物标记物保持数量上地可检测。即使使用显著稀释的粪便，仍获得显著的反应。此外，检测可以在粪便样本中选择地发生，即使没有之前的提取。但是，优选地，使用例如，使用特定洗涤剂（例如CHAPS）的提取方法（所述提取过程在实施例2中更详细地描述）。
在根据本发明的方法中，优选地测定在人或动物的胃肠道中的恶性事件。此外，优选地免疫化学地检测肿瘤标记物，特别通过抗肿瘤标记物抗体。可以使用单克隆或多克隆抗体，优选地单克隆抗体。有利地，使用的抗体不与粪便的其它组分交叉反应，特别是不与其它粪便蛋白质交叉反应。
片段在本发明中的意义是具有与一种所述肿瘤标记物的部分序列一致的氨基酸序列的蛋白质或多肽。片段的长度可以从5个aa（aa=氨基酸）至n-1个aa（n=片段来源的肿瘤标记物的长度）。典型地，所述长度长于10个aa。
根据本发明使用的抗体可以根据现有技术的方法生产。本领域技术人员熟悉生产特异性单克隆抗体的方法。例如，为了该目的，抗原，即，在该情况中的酶生物标记物，用于生产抗体。原则上，可以使用由Koehler 和 Milstein首次描述的该方法，但是，这些方法的修改和进一步发展也是本领域技术人员已知的。通过该类型的生产，可以获得特异的抗体，其中特异性可以通过选择确定。所述选择对特异的抗体执行，其结合酶生物标记物，但是不结合其它粪便蛋白质。
在特别优选的实施方案中，通过使用免疫分析的原则进行检测。根据本发明的免疫测定以这样的方式实施：a）将样本与至少两种不同的受体接触，其中第一种受体R1存在于固相并且能够结合肿瘤标记物，并且第二种受体R2存在于液相并且还能够结合相同的酶生物标记物，其中受体R2携带标签或调节对可检测分子的结合，b）从液相中分离固相，并且c）测定在一种相中优选地在固相中的标签或可检测的分子，并且因此通过使用如至少一种R1或R2受体的抗体定量存在于样本中的酶生物标记物，所述抗体能够特异地结合肿瘤M2-PK，并且特别地不与其它粪便蛋白质结合。
在特别优选的实施方案中，针对肿瘤M2-PK的抗体作为受体R1还作为受体R2使用。根据本发明，将肿瘤M2-PK理解为该酶生物标记物的二聚体形式，其与四聚体形式不同。
血红蛋白的测定根据对肿瘤M2-PK的上文描述的检验原则发生。
除了以免疫测定的形式并且特别是ELISA的形式实施根据本发明的方法，还可以使用其他检测技术，诸如晶体振荡器技术、微尺度技术、侧流技术、叠生星状技术（candelabra technology）、TRACE技术或电化学发光技术，而且可以使用微颗粒或纳米颗粒凝集（通过浊度法测量）和在液相或固相的多通道技术或列阵技术，诸如使用蛋白质芯片。这些技术是本领域技术人员熟悉的并且因此不需要在此详细的描述。
优选地，使用侧流技术。因此，本发明的主题是用于检测和/或怀疑诊断在人或动物胃肠道中的恶性肿瘤事件的组合的快速检验，其特别为用于实施上文描述的方法提供，通过测定酶生物标记物组合，所述组合的快速检验同时测定肿瘤M2-PK和血红蛋白或血红蛋白/结合珠蛋白。
优选地，组合的快速检验含有不与其它粪便蛋白质交叉反应的针对肿瘤M2-PK的抗体，和不与任何其它粪便蛋白质交叉反应的，特异地检测血红蛋白/结合珠蛋白的抗体。如果可以适用，所述检验试剂盒可以任选地含有用于实施免疫分析或用于实施各自提供的检验步骤需要的其它试剂。优选地，所述试剂盒含有结合于固相的抗体，并且其对至少一种所述酶生物标记物是特异的。
本发明的另一个主题是抗体，特别是单克隆抗体，其特异地结合所述酶生物标记物中的一种并且优选地不与任何其它粪便蛋白质交叉反应。所述抗体可以，例如，通过 Koehler和Milstein的方法（Nature 256, 495-497 （1995））生产。
此外，本发明涉及适配体（aptamers）或镜像适配体（spiegelmers）和它们替代上文描述抗体的用途（全部其它抗体相关的说明以类似的方式应用），其特异地结合至所述酶生物标记物中的一种并且任选地不与任何其它粪便蛋白质交叉反应。适配体是寡核苷酸序列，其具有特异的结合特性。这样的适配体可以根据例如US 5,270,163中或Sumedha, Clin. Chem. 45 （1999）, 1628-1650中描述的方法产生或鉴定。镜像适配体是寡核苷酸适配体，其从L-寡核苷酸形成。
根据本发明的检验的评估通过使用自动分类、聚类分析、模式识别实施。特别地，应用“最大拟然法”或通过概率分布的聚类成员（cluster membership）的方法。
对实验室人员和主治医生，结果优选地以多色图示（风险影响方案）、决策矩阵和其它用于决策制定的算法呈现。
例如，测量的参数（血红蛋白和M2-PK）可以按如下分配：
在任何情况下，根据本发明的试剂盒含有用于粪便的样本设备。为了该目的，可以使用全部常规设备，例如，在DE 102 05 709 A1中描述的设备。
为实现最优操作原则的特别的挑战是最优活性配对的选择。这些活性配对列于以下实例、列表和专利权利要求中，并且特别在图1-6中。
例如，图2、3、4和6显示不同的功能。本发明的特别的挑战是在大量不同的功能（组合的可能性）中选择用于实现最优操作原则（参数的选择）的最优活性配对。
在本发明特定的实施方案中，自动地实施评估。例如，可以对根据本发明的检验试剂盒拍照，并且检验结果可以通过评估程序分配至合适的风险水平。本发明因此还包括这类用于对检验试剂盒照相的设备和用于表征检验结果的评估软件，优选地以多色显示的形式（风险影响方案）。分配的实例在图10中显示。
实施例
本发明通过以下实施例进一步解释。
实施例1：检验试剂盒
基于免疫分析的检验试剂盒由两个取样和制备设备和检验盒组成。
两个取样设备均含有能够接收要求量的粪便（4-30mg，优选地25mg）的棒。所述取样设备进一步包含用于接收样本的一个管，其使用缓冲溶液填充。
用于肿瘤M2-PK检验的缓冲水溶液具有以下组分：
缓冲液1=10-70 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.7至7.6）或缓冲液2=10-70 mM HEPES缓冲液（pH7.6至8.2）或缓冲液3=10-70mM 三羟乙基胺（pH7.3至7.7），优选地其混合物体积为各1:1:1。
洗涤剂1= CHAPS（3-[（3-胆酰胺丙基）二甲氨基]-1-丙烷磺酸盐，10mM-50mM（Sigma），洗涤剂2=十二烷基硫酸钠（SDS）0.01%-0.1%，例如来自Biochrom，洗涤剂3=十二烷基二甲基氧化胺（10mM-50mM），例如来自Biochrom或其混合物。
用于血红蛋白检测的缓冲水溶液含有以下组分：
缓冲液1=10-70 mM磷酸盐缓冲液（pH6.7至7.6）或缓冲液2=10-70 mM HEPES缓冲液（pH7.6至8.2）或缓冲液3=10-70mM三羟乙基胺（pH7.3至7.7），或其混合物。
使用的抗体
测量需要的四种抗体（在“液相”中各有一种并且在“固相”中有一种抗体）是能够特异结合抗体，可以是多克隆抗体，然而优选是单克隆抗体。
多克隆抗体和单克隆抗体是根据现有技术通过使用相应抗原免疫动物的经典方法可以获得的，优选地，通过使用Koehler 和 Mielstein的杂交瘤方法。
结合人丙酮酸激酶和同样结合丙酮酸激酶的同工酶的多克隆和单克隆抗体，属于现有技术。优选的是结合二聚体形式即丙酮酸激酶的肿瘤形式的多克隆抗体和单克隆抗体。
蛋白质的四级结构涉及蛋白质亚基的空间排列。
“正常M2-PK”具有四聚体结构（四级形式）。健康人的M2-PK与“肿瘤M2-PK”不同。“肿瘤M2-PK”具有二聚体结构。
针对这些特定形式（肿瘤M2-PK二聚体或M2-PK四聚体）的多克隆抗体和单克隆抗体是通过常规免疫方法以及通过杂交瘤方法（Kohler-Mielstein技术）可以获得的。
因此，可以将M2-PK的肿瘤形式清理并用作抗原。另一个选择是购买同样在肿瘤形式中遗传表达的M2-PK并且将其用于免疫。另一个途径是合成特异的片段，即，氨基酸序列并且将它们用于免疫。
肿瘤M2-PK抗体
优选的用于喷涂（spraying）至硝酸纤维素膜上的是单克隆小鼠抗体（克隆PATAM3AT, IgG1）。该克隆已经通过小鼠的骨髓瘤细胞与淋巴B细胞杂交产生。将来自大肠杆菌（E. coli ）的具有氨基酸1-531的重组人肿瘤M2-PK用作免疫原。除了其它的，抗体可以从ProSpec 公司（East Brunswick, USA）获得。任选地，可以使用单克隆小鼠抗体（克隆AT1 E3, IgG1）。将重组人M2-PK作为免疫原使用。除了其它的，抗体可以从Novus Biologicals公司（Littleton, USA）获得。特别优选的与金偶联的是单克隆抗体（克隆1 E3, IgG1）。具有氨基酸序列第47-574位的重组人肿瘤M2-PK作为免疫原使用。除了其它的，抗体可以从Novus Biologicals公司（USA）获得。任选地，可以使用来自Randox 公司（United Kingdom）的从绵羊生产的多克隆抗体（Ig部分）。来自大肠杆菌的重组人肿瘤M2-PK作为免疫原使用。
血红蛋白抗体
优选的喷涂至硝酸纤维素膜上的是单克隆小鼠抗体（克隆M1202100, IgG1）。所述抗体通过使用人血红蛋白免疫生产。除了其它的，所述抗体可以从Thermo Scien-tific 公司（Rockford, USA）获得。可选地，可以使用针对人血红蛋白的单克隆抗体。来自克隆7202 SPR-5的该抗体具有亲合常数1x10-10 l/mol和5.8的等电点。所述抗体可以从Medix 公司（Finland）获得。对于偶联金的血红蛋白抗体，使用了单克隆小鼠抗体（克隆HB11-2312）。纯化的人血红蛋白作为免疫原使用。抗体可以从Thermo Scientific公司（Rockford, USA）获得。
抗体选择中最重要的一个条件是其不与粪便中其它组分交叉反应，特别地不与其它丙酮酸激酶同工酶（例如，M1-PK、M2-PK（四聚体形式）、L-PK、R-PK）交叉反应。
上文的血红蛋白抗体特别地适合用于结合至膜（固相），以优选的硝酸纤维素膜形式。上文提及的抗体不与来自猪、马、绵羊和牛的血红蛋白交叉反应。上文的血红蛋白抗体优选地适合用于结合至乳胶或纳米颗粒——优选地金胶体——（液相）。它们不与来自绵羊、马、牛或猪的血红蛋白交叉反应。所述抗体等同地良好地结合血红蛋白A0和A1，部分地具有较低的结合常数结合A2，并且部分地具有非常低的结合常数结合AS。固相抗体优选地以1:1 w/w混合。液相抗体优选地以1:1 w/w混合。
洗涤剂1（CHAPS（3-[（3-胆酰胺丙基）二甲氨基]-1-丙烷磺酸盐，10mM（Sigma）），洗涤剂2=十二烷基硫酸钠（SDS）0.01%-0.1%，例如来自Biochrom，洗涤剂3=十二烷基二甲基氧化胺（10mM-50mM），例如来自Biochrom或其混合物。
用于实施血红蛋白检验的取样设备含有上文描述的缓冲液中的一种（1.5-2.5ml）。进行检验的人将剂量头（dosing tip）移至粪便中并且转移粪便样本至使用对应的缓冲液填充的空管中。
医生交给待测者的用于肿瘤M2-PK检验的取样设备不含有任何缓冲液。患者将剂量头移至粪便中并且转移粪便样本至空管中。
根据本发明的检验试剂盒进一步包括检验盒，其中比现有技术改善的两种免疫测定通过侧流技术实施。为了该目的，所述检验盒含有用于粪便样本的应用的两个优选地圆形凹陷，和用于读取检验结果的两个优选地延长凹陷。
检验盒含有具有优选的135 秒/4 cm的毛细流速的在其内部的硝酸纤维素膜作为固定相。
在发展根据本发明的检验试剂盒的研究期间，已经发现硝酸纤维素膜在结果的扩散上具有显著的影响。该扩散在新鲜制备的硝酸纤维素膜上特别大，但是在储存3至6个月（成熟）后变得较小。本发明中使用的硝酸纤维素膜在经历进一步检验前已经储存了3至6个月。这样“成熟的”硝酸纤维素膜的使用能够显著的减少结果的扩散。特别地，其相比“新鲜的”硝酸纤维素膜可以获得在不同批次生产的检验试剂盒之间发生显著更低的变化。
抗体偶联至胶体，优选地金胶体或乳胶胶体，优选地具有20纳米直径的金胶体。
固定相=优选地以上文指定的混合比例含有血红蛋白抗体1、血红蛋白抗体2的硝酸纤维素膜（优选地具有毛细流速90 秒/4 cm）。
固定相=进一步包含肿瘤M2-PK抗体（来自克隆P1F3）、肿瘤M2-PK抗体（来自克隆P5A1），优选地以以下体积混合比例1:3.5 w/w的克隆P1F3和P5A1抗体混合物的硝酸纤维素膜（优选地具有毛细流速135 秒/4 cm）。
来自克隆P1F3和克隆P5A1的抗体作为用于结合膜的捕获抗体（固定相）特别有用，优选地膜是硝酸纤维素膜。来自克隆P1A6的肿瘤M2-PK抗体优选地结合至金胶体或乳胶胶体，优选地金胶体具有80纳米的直径。
用于所述检验试剂盒生产的设备和方案，特别地对两种测试条的生产：
密封设备-薄膜密封设备（Kopp公司），包装系统（Reichenbach公司）。
密封温度60℃，Type MSC 440 瓦特。
Biodot 设备。
2. Biodot 设备
Zeta Corporation公司的切割器，www.zetacorporation.com,设备型号 GC1800-081101。设备是CE认证的。
层压和切割层压的M2-PK卡的硝酸纤维素膜数量的方案。
设备设置和操作Kinematic公司的层压机Matrix 2210。
用于硝酸纤维素膜层压和切割的方案、设备设置、层压机Matrix 2210的操作。
执行设备设置和操作。
Zeta Corporation公司的切割器GSI-800的设备设置和操作。
盒的生产和ScheBo M2-PK Quick Kits的安装。
检验盒的生产。
部分成品在冰箱中的储存。
质量控制。
记录生产进行的地点的温度和湿度。
FUJITSU DG Inverts空调用于空气调节并且保持湿度和温度恒定。遵从空气温度和湿度对检验膜的质量保证特别重要。
选择操作模式/设置恒温器1，设置风扇转速。
在组合的盒中的两种测试条的最优协调的关键成功因素特别是：
a）测定Hb的Heidelberger曲线。
b）测定M2-PK的Heidelberger曲线。
令人惊讶地，已经发现当将终浓度为6.7%的牛胆汁（来自Schmincke公司，Part No. 50031, Schmincke, Erk-rath, Germany，干净的，天然润湿剂）混合至M2-PK的提取缓冲液时，获得了特别好的可重复的免疫层析结果。
令人惊讶地，已经发现当将终浓度为2.8%的牛胆汁混合至血红蛋白的提取缓冲液时，获得了特别好的可重复的免疫层析结果。
在组合的盒中技术上同时测定两种分析物。
为优化层析起始时间的“时间推移”（“time shift”），使用者通过将M2-PK粪便样本提取物滴入盒的左侧样本窗（随后设置计时器至5分钟）起始层析。在将M2-PK粪便提取物滴入1分钟后将Hb粪便样本提取物滴入盒的右侧样本窗。即，两个层析在推移的时间起始。然而，两种检验的结果在5分钟停止时间结束后读取。
层析，特别地免疫层析检验方法，如其名称暗示的，实质上取决于时间和结合亲合力（在液相和固相中抗体对抗原的结合，以及在硝酸纤维素膜中的各种动力学），即，它们经历了各种动力学。
之后读取的检验结果是无效的！（这全部在组合检验的描述中解释）。在检验膜的硝酸纤维素膜测试条的检验区域中形成的粉色-红色检验线是复杂的凝集反应在生物物理学上的结果（各种动力学和亲合力在此发挥特定的作用，还见上文更详细描述的Heidelberger 曲线）。
平行的，在技术含义中即同时的，处理或测定根据本发明的分析物。
1. 起始“层析”M2-PK，随后再起始层析Hb。
在技术含义中，同时测定是一个挑战，因为免疫层析测定是非常复杂的。
为了实现根据本发明的多个目标，很多参数是特别重要的：
（全部目标已经在ScheBo Biotech AG实现）。
这些目标根据本发明，已经通过例如，鉴定特异的/重要的活性配对实现：
1.单独的抗体对根据本发明的对应的物质（蛋白质）、分析物的结合常数/亲合力。
另一个重要的因素还是“干燥的”金的组合物和从PAD的金的“释放”，即，通过含有对应分析物（粪便样本提取物）的提取缓冲液的逐滴加入的干燥金颗粒（在玻璃纤维基质/干燥的糖基质中）的再溶解。
根据本发明的检验试剂盒的制备含有用于两种分析物免疫层析测定的双盒（dual cassette）。
为了实现此，我们首先以所谓的浸入棒形式（dipstick format）检验了两种分析物的免疫层析测定。该浸入棒形式非常不复杂，因为它不含有结合物释放PAD。
以下任务和挑战必需根据本发明解决：
根据本发明的技术方案几乎没有是“显而易见的”。
一般注解：
对于测试条的制备，维持湿度在18 ℃ 至 25 ℃在40%至60%之间特别重要。
通过在ScheBoBiotech AG的R&D部门执行的一系列检验，以创造性的方式测定了最优湿度为在20 ℃，35 %。
任务/挑战：
1a.在膜中缓慢流动液体或甚至停止/打断层析的液体流动。
1b.液体中的样本在膜条的中间（在膜的流动方向）停止。
对于本申请选择的膜中的流速过慢么？
膜变得疏水了么？
已经使用了正确的芯（wick）么？
硝酸纤维素膜含有“表面活性剂”和“湿润剂”。
检验膜具有高“背景着色”（该背景着色通过根据本发明的非显而易见的方案解决）。
有必要澄清是否会使用特异性阻断剂。
将金的释放以最优和完整的方式置于硝酸纤维素膜上（通过根据本发明的非显而易见的方案解决）。
液体前端不是直线的（通过根据本发明的非显而易见的方案解决）。
检验线是过粗的或“模糊的”、“不清楚的”（通过根据本发明的非显而易见的方案解决）。
可重复地观察到/发现在检验线上太过于弱的信号（通过根据本发明的非显而易见的方案解决）。
检验线显示假阳性/假阴性结果（通过根据本发明的非显而易见的方案解决）。
根据本发明的检验试剂盒含有金属胶体，优选地金胶体。特定的实施方案是，例如，乳胶颗粒，还有纳米颗粒。乳胶颗粒可以染色并且还提供带有荧光染料并且具有不同的大小（即，大小在微米范围并且在纳米范围）。
磁性颗粒也是可能的（使用特定的读数设备（读数器）起始量化）。
主要的技术挑战特别地涉及质量保证。良好的生产方案的产生（通过根据本发明的非显而易见的方案解决）。
目标/任务：实现最优的，小的产品间和测定间变化。特别重要的：非常好的批次间变化（即，最小可以的批次间变化）。
在根据本发明的生产过程中在质量保证的条件下确保这种小的批次间变化（通过根据本发明的非显而易见的方案解决）。
生产具有相同批号、相同到期日的大量的，多于100,000个检验试剂盒（通过根据本发明的非显而易见的方案解决）。
挑战：确保极好的质量-利于消费者（通过根据本发明的非显而易见的方案解决）。
凝集-定义
在医学领域，凝集指细胞病原体等的粘附或集合。
在实验室诊断中凝集反应用于进行定量说明。通过浊度测定方法测量凝集。
红色检验线通过凝集反应以复杂的动力学形成。在测试条的硝酸纤维素膜的三维结构中，出现凝集。该“凝集”通过肉眼以粉色线可见。
该粉色-红色线是通过抗原/抗体反应的物质检测的结果。该抗原/抗体反应经历了多种效应。这些效应中的一种是所谓的钩状效应（hook reaction）（同样指的是高剂量钩状效应），该效应出现在分析物的错误的低测定中，其出现于非常高的样本溶液浓度中（即，在特定情况下分析物的高浓度可以冒充假阴性测量信号）。
一旦分析物浓度过高，抗体结合位点可以由分析物占据，并且额外的分析物分子不再在结合曲线中鉴定。这会出现错误的低读数。
技术目标是避免所述钩状效应。
通过样本的多个稀释的平行测量，可以注意到高剂量效应的存在，因此该测量可以被修正（该技术问题的目标已经通过根据本发明的非显而易见的方案解决）。
与现有技术的实施方案相反，在权利要求中描述的根据本发明检验试剂盒没有高剂量钩状效应。这可以通过使用具有超过截止200倍（达到160,000 ng/ml）的肿瘤M2-PK浓度的检测以令人信服的方式显示。
通常地，免疫生物分析检测方法，特别地免疫层析方法，会经历以下失败：
1.通过交叉反应和非特异性结合导致的失败。
2.通过基质效应的失败。
3.通过“抗-动物抗体”的失败。
4.通过样本内源性组分的失败。
5.通过异染性（heterophiles）和其它交联干扰的失败。
（这些失败1-5可以通过根据本发明的非显而易见的方案解决）。
特别感兴趣的是特别的LowCross Buffer（由ScheBo Biotech AG生产）的使用。其包含多种洗涤剂、蛋白质、多克隆抗体、表面活性物质和改变表面张力的物质。
所有这些与根据本发明的检验试剂盒的上文描述的试剂、物质等一起，导致技术含义上的活性配对的最优协调。全部这些允许两种分析物在组合的检验盒中同时测定。
令人惊讶地，发现对于测试条上两种分析物的共同的、同时的（在技术含义中）测定的方案，当精确地分配抗体液体和胶体金时湿度控制和液体的脱气作用至关重要。
为了提供根据本发明的检验试剂盒，创造性的，并且系统的工作是需要的。
需要广泛的检验系列以检测活性配对和它们的共同的、最优的协调。
这是为了发展以快速检验的形式的强劲的、可重复的和可靠的检验（平台和/或现场即时检验）的基本要求。
对于可得到的材料（先证者的粪便）的样本的极大地变化性，两对试剂和抗体的每一对必需相互协调以获得逐步可重复的结果。
当设计和发展这样复杂的平台时，要经过大量的可以以未期望的方式影响检验结果的物理和化学现象。
所述检验试剂盒的另一个实施方案是在检验“全部”最优的，基本活性配对后，优选的根据本发明的分析物的定性的、半定量的和定量的测定（通过其它免疫化学检验原则诸如ELISA的方法的生物标记物）的使用，凝集，优选地用于在液相中起始凝集的纳米颗粒的使用。
根据现有技术水平的Turbometric、浊度测量技术允许测量数据的产生。这些测量数据可以使用合适的计算机软件处理。通过“内部”校准曲线（同样取决于批次）的方法，例如根据本发明的两种分析物的测定是可能的。各种图示，诸如对数-对数、对数-十进制的表示是可能的。
特定的实施方案允许统计评估，例如，来自模糊逻辑分析、分类和模式和图像识别、探索性数据分析、数据可视化、强劲的和计算机支持的统计、初始数据分析（IDA）和演进系统（ES）、数据挖掘和探索性数据分析、模糊系统、神经网络、演化算法领域的算法。优选的是Prof. Dr. Frank Klawonn的算法。Prof. Klawonn已经发展了改善数据可靠性的良好的评估策略。Prof. Klawonn是Institute for Applied Computer Science（Institut für angewandte Informatik）的主任。
另一个实施方案提供了WLAN的界面。
患者的时间进度同样是可能的。
单独患者数据系列可以能用于评估。
用于两种分析物测量的其它设备、应用等是可以想到的。
其它实施方案平台“ELISA”是可以想到的。
各种阵列：液相（Luminex）或固相（阵列）是可能的。全部免疫化学检测方法是可以想到的。
凝集
令人惊讶地，发现液滴大小（体积在纳升范围内）和这些液滴的距离是重要的。
液滴的大小和这些液滴之间的距离是特别重要的。因此没有分散的“线”，而是单独的液滴。硝酸纤维素膜的毛细力在数秒内（in fractions of seconds）吸附液滴并且导致线的形成。液体中存在的抗体分布于硝酸纤维素膜的三维结构中。
令人惊讶地，发现为了获得非常精确的线，“干燥水平”是重要的。
令人惊讶地，还发现疏水性非常非常重要。为确保使用的硝酸纤维素膜是干燥的，其在先前在铝膜中密封，铝膜包被一侧并且不允许任何湿气通过，打开，与抗体一同提供并且立刻在密封于加有干燥剂的铝膜中。令人惊讶地，这些生产步骤是重要的并且在6分钟的周期内实施。
令人惊讶地，值得注意的是为了确保在膜上的恒定流动，测试条的结构以合适的顺序制作。
在测试条的反应区（检验结果线区域），形成了相应的线（粉色-红色线）。
有色的检验结果线（阳性结果）是抗原/抗体反应的结果，并且测定的“Heidelberger曲线”显示了根据抗体过量和抗原过量的测量信号。目标是使用根据“Heidelberger曲线”的等值范围。
抗原/抗体反应的最优使用，即，在M2-PK测试条的等效面积的液相中存在的固定的抗体和抗体偶联的金颗粒的协调，在测试条上为M2-PK提供最优的信号。
抗原/抗体反应的最优使用，即，在Hb测试条的等效面积的液相中存在的固定的抗体和抗体偶联的金颗粒的协调，在测试条上为Hb提供最优的信号。
在一个M2-PK测试条的等效面积和Hb测试条的等效面积中的抗原/抗体反应的最优使用是本发明的目标。
本发明的目标是通过活性配对的最优共同协调，特别是通过抗体的合适的选择、洗涤剂的合适的选择等，但特别是通过抗体溶液在两个硝酸纤维素膜检验膜上的可重复的、高精确的分配实现。
这允许在来自先证者的粪便样本中同时检测两种分析物。全部这些活性配对和技术方案在本申请中描述。为了该目的，通常需要非显而易见的方案，幸运的巧合同样会导致阳性结果。
血红蛋白检验管和M2-PK管必需在48小时内在医生办公室交出。将带有粪便样本的剂量头转移至使用上文描述的缓冲液填充的管中。用于M2-PK检验的管和用于血红蛋白检验的管均用力振荡。
准备的粪便样本提取物在各自置于两凹陷处后立刻应用。在5-10分钟后，通过标记线的帮助读取一种或两种测量的生物标记物是否是阳性的。
对胃肠道内恶性事件可靠检测的关键是所谓“截止”的选择。该截止标记了指示阳性结果的样本中分析物最小浓度。根据本发明的血红蛋白检验的截止是每克粪便18至38 μg血红蛋白，优选地每克粪便24 μg血红蛋白。肿瘤M2-PK的截止是3-6单位/ml粪便提取物，优选地4±1单位/ml。
检测的限度是150 ng血红蛋白/ml粪便提取物。
检验结果的评估和风险水平的分配，如例如图10中展示的，可以通过手动的、半自动的或全自动进行。例如，根据本发明的检验盒可以手动上样至读出设备，所述读出设备通过光电管或相机的方法实施评估，并且随后在监视器上展示结果。优选地，展示以彩色进行（风险影响方案）。特别优选的是，为了安全原因，以另一种方式进行平行展示（例如，风险水平1-4或相似的）。
当然，检验设备可以同样被配置以使全自动评估是可能的，例如，通过检验试剂盒的电化学方法或通过光学记录（扫描）检测金颗粒。
实施例2：
根据本发明的组合的快速检验盒不含有在市场上存在的用于测定M2-PK的侧流测试条，而是根据本发明用于测定M2-PK（肿瘤M2-PK）的新的、改善的侧流测试条，例如Sartorius。
此外，所述组合的快速检验盒不含有在市场上存在的用于测定血红蛋白的侧流测试条，而是根据本发明用于测定血红蛋白（iFOB plus）的新的、改善的侧流测试条，例如Sartorius。
本发明特别地涉及组合的快速检验和组分，和全部用于同时实施免疫层析检测方法的需要的试剂。同时地在语言学含义上是指在相同的时间，但是同时的在技术含义上还指在组合的快速检验盒中用于检测两种生物标记物M2-PK和血红蛋白的层析条件的共同的、最优的协调。
检测试剂：
可以使用多种检测试剂：乳胶珠、胶体金颗粒、胶体银颗粒等。这些颗粒最重要的特征之一是其群体必须是以恒定的球形大小单分散的。
根据本发明，优选的是金颗粒。
胶体金颗粒的生产是原理上熟知的。典型地，含有Au3+ 的溶液是在快速搅拌下化学地还原，于是原子金颗粒沉淀，其经过一段时间聚集。聚集可以通过稳定剂防止。通过选择正确的添加剂，可以设定形成的胶体的大小。关于Au3+源，通常使用H[AuCl4]。柠檬酸钠溶液、硼氢化钠或对苯二酚可以用作还原剂。为了稳定，通常可以使用含硫化合物（诸如烷基硫醇）。含有金颗粒的溶液可以从多种来源得到。
聚合物组合物和蛋白质结合
为了侧流检验的生产，使用硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯、电荷改性的尼龙、聚醚砜。
聚合物表面大小取决于孔的大小、孔隙度、厚度和其它结构特征。
表面随孔径非线性增加，但是随厚度线性增加，并且随孔隙度非线性增加。蛋白质结合给定的表面区域取决于蛋白质的密度、其结构和它的Stokes半径（有效直径）。此外，蛋白质对聚合物的结合取决于pH和固定方法。
在根据本发明的组合的快速检验中，优选地将纤维素用作所谓的样本垫，硝酸纤维素用作检验膜，并且纤维素用作吸收垫。
结合/样本垫 = 22 mm （+/- 0.2 mm） x 5 mm （+/- 0.2 mm）.
硝酸纤维素膜 = 25 mm （+/- 0.2 mm） x 5 mm （+/- 0.2 mm）.
吸收垫 = 16.5 mm （+/- 0.2 mm） x 5 mm （+/- 0.2 mm）.
检验膜的宽度 = 4 mm （+/- 0.2 mm）.
毛细流速: 通常 1 - 6 cm/分钟；根据本发明 3.74 cm/分钟。
检测限制
在研究M2-PK粪便检验ELISA的各种研究中发现4个单位M2-PK/ml的特别优选的截止。根据本发明的层析条件，诸如根据本发明的组合的快速检验的截止值是基于先前的M2-PK粪便检验ELISA测定的截止值测定的。
用于硝酸纤维素膜的毛细流速
分析敏感性随毛细流动减少，即，具有最慢毛细流动时间的硝酸纤维素膜导致最高的分析敏感性。毛细流动时间在240 - 75 秒/4 cm之间。根据本发明的毛细流速是120 秒/4 cm。
根据本发明的组分和根据本发明的活性成分的列表
提取/运行缓冲液
在根据本发明检验试剂盒的发展过程的检验中，令人惊讶地发现当在免疫层析检验原则下运行的液体具有pH5-6，优选地pH5.7时，临床敏感性和特异性，和化学分析敏感性都有相当的增加。该发现特别地令人惊讶，因为根据关于蛋白质性质的现有技术水平，这些蛋白质应当在pH5.7出现部分变性的情况。因此，在该环境的改善的敏感性、特异性，以及反应性的实现是令人惊讶的。目前在市场上可以获得的用于检测血红蛋白的全部免疫层析检验试剂盒在运行缓冲液中涉及pH从7至7.5。对此的最终科学解释还不能给出。可能地，没有希望受限于解释，存在部分的变性，以这种方式使得分析物的表位更易接近各种抗体。为了实施具有pH5-6，特别地5.7的运行液体的本发明的该实施方案，需要对应的缓冲液。也就是，醋酸盐缓冲液（pH ≈ 5.7），其有利地进一步含有0.1 %白蛋白作为稳定剂。这样的缓冲液系统是本领域技术人员熟悉的，并且在这点上不需要进一步的表达。
附图描述
图1
侧流快速检验的塑料盒中测试条的示意图
图2
“气泡点”和孔的大小的关系。
膜的“气泡点”是推动空气通过湿润的膜所需要的压力。
图3
毛细流速对侧流快速检验的分析敏感性的作用。
实例：
流速= 1.00 cm/分钟 →有效分析物浓度 = 1.00 x.
流速 = 1.25 cm/分钟 →有效分析物浓度 = 0.65 x。
图4
洗涤剂或润湿剂浓度对膜的不同特征性性能的作用。
图5
带宽随分配率变化的计算。
膜床体积=10 μL/cm2。
试剂分配率=1 μ/cm。
带宽=试剂分配率/膜床体积=1 μ/cm/10 μL/cm2 = 0.1 cm。
图6
膜流速和免疫层析检验功能之间典型的关系。
敏感性=分析敏感性=按μg检测=质量。
图7-9
图7-9以示例的方式显示了根据本发明检验试剂盒。图7中可见取样设备。图9显示真实的检验盒。
图10
图10显示各种测量结果对风险水平的分配的实例。为了方便读取，结果有利地以彩色的方式显示。为了避免由例如色盲人群错误读取，可以使用额外的区分特征（例如，不同的形状、数字和/或字母）。
本发明的目标
本发明的目标因此是：
1. 工具=在结果的事实情况中用于诊断和分配的分类器：正确和错误的分类。因为这是是/否问题，也可以称该检验为阳性（意为不正常）或隐性（意为正常）。如果该检验只有一种生物标记物是阳性，阳性诊断进一步评估通过结肠镜检查指示。
2. 基于特定的特征（M2-PK/血红蛋白的测定）用于分类的工具。
3. 用于决策的工具：是否应当执行结肠镜检查用于进一步诊断：是/否。
4. 用于通过改善初始诊断促进医疗指示的工具（显著的额外益处）。
5. 用于在措施上促进医学决策的工具，例如，其它诊断程序的应用，例如结肠镜检查等，或治疗措施，例如，手术、化疗等。
6. 报告基于先证者粪便样本，用于改善预测准确性的工具。
7. 具有对血红蛋白和M2-PK高整体敏感性和整体特异性的用于检测结肠癌的检验试剂盒。所述试剂盒作为“双重预过滤器”使用，作为通过结肠镜检查的方法筛选结肠癌的一部分。
8. 具有较低的“批次间”偏差的试剂盒，其允许不但在生产批次内，而且在批次之间的检验结果的最可能的可比较性。
9. 用于预测治疗成功的工具。
10. 用于改善治疗监视的工具。
11. 用于检验结果可视化（风险影响方案）的工具。
12. 根据本发明的检验试剂盒用于可预测的问题预防：
1. 预防（拉丁语：praevenire，避免、防止），在保持不期望的发展免于发生的意义上。
a. 疾病、发病原、疾病严重性（严重）的预防。
b. 某些医疗程序的预防，例如，不需要的、危险的、昂贵的措施（手术、化疗、副作用）。
根据本发明的检验试剂盒相比于诊断性的结肠镜检查被视为最优化损失/利益/风险的考虑的情况。并且非常重要的是保护生活质量和防止早逝。
13. 根据本发明的检验试剂盒的目标：所述试剂盒用于世界性的严重健康问题的方案。所述检验试剂盒用于不正常先证者的“选择”（效率的增加）。
根据本发明的该工具通过提供组合的快速检验实现。
组合的快速检验用于同时分析测定酶生物标记物肿瘤M2-PK和血液生物标记物（血红蛋白）。
组合的快速检验包括在检验盒上的测试条（肿瘤M2-PK plus）+测试条（iFOB plus）。
组合的快速检验用于同时分析测定酶生物标记物肿瘤M2-PK和生物标记物血红蛋白/结合珠蛋白复合体（Hb/Hp复合体）。
组合的快速检验包括在检验盒上的测试条（肿瘤M2-PK plus）+测试条（Hb/Hp复合体 plus）。
优选的检测方法是免疫层析方法。在特别的实施方案中，在阵列、微阵列形式中的免疫化学方法，以及浊度方法是进一步可能的。本发明的主题进一步是单克隆抗体。
在所述组合的快速检验中特异的抗体的使用，其对于肿瘤M2-PK或血红蛋白的结合是特异的和可以用于免疫层析方法（例如，是“适合膜的”、“适合洗涤剂的”）。
为提供根据本发明的组合的快速检验，使用特异性抗体（克隆P1F3 AK特异地检测M2-PK的空间的、二聚体构象）。该肿瘤M2-PK特异性抗体优选地结合一个以下表位或其片段或具有最少4个氨基酸长度的这些的组合（表位或其片段）：
机译： 用于粪便中生物标志物同步证明的检测试剂盒（组合快速检测），用于检测胃肠道（尤其是肠道）的病理变化
机译： 同步检测粪便中生物标志物的检测试剂盒（组合快速检测），用于检测胃肠道（尤其是肠道）的病理变化
机译： Testkit（组合快速测试），用于同步检测粪便中的生物标志物，以检测胃肠道（尤其是肠道）的病理变化
