检测NF1基因第31-34号全外显子的方法和引物

摘要

本发明公开了检测NF1基因第31-34号全外显子的方法、引物和试剂盒，所述引物、试剂盒均包括扩增覆盖NF1基因第31-34号全外显子序列的3对正、反向引物和3对测序引物。基于采用Sanger测序法，利用所述3对测序引物可用于快速检测幼年型粒单核细胞白血病患者的NF1基因第31-34号全外显子序列的突变情况。

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测NF1基因第31-34号全外显子突变的 引物和方法

背景技术

幼年型粒单核细胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia，JMML)是一种少见的 儿童慢性髓系白血病，恶性程度高，兼有骨髓增生异常综合征(myelodysplastic，MDS)和 骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disease，MPD)的特征。目前发现RAS信号通路中 RAS，PTPN11，NF1，CBL 4种基因的突变在JMML患儿中占有极高的比例，治疗难度大，靶 向治疗是目前研究的方向。

NF1基因定位于染色体17q11.2,跨距350kb长的基因组DNA,包含60个外显子,可转 录成11～13kb的mRNA,其蛋白产物为神经纤维瘤素。其中8 457bp的读码框架，编码包含 2818个氨基酸的神经纤维蛋白,相对分子质量为327×10³。NF1基因这样大的长度与其很 高的自发突变率及临床表现的复杂性相一致。NF1基因突变类型呈多样化,包括碱基置换、 插入突变、缺失突变、重复突变、无义突变、错义突变、框架漂移等均有报道,大部分突变产 生截短蛋白,仅有10％与氨基酸替代有关，国外研究结果显示,NF1基因并不存在突变热点。

Ι型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 1，NF1)NF1是一种常染色体遗传病，临 床特点为:多系统、多器官损伤，主要特征为皮肤牛奶咖啡斑和多发性皮肤软组织纤维瘤，由 NF1基因突变引起。NF1患儿具有极高的并发髓系肿瘤风险，尤其是，JMML，并且相对未发 生NF1者，JMML患儿年龄偏大，有文献报道，诊断JMML者，约11％伴有NF1，无NF1者约10％～ 15％存在NF1基因缺失。近来Steinemann等研究发现，合并NF1的15例JMML患儿2/3存在 杂合子NF1基因缺失，且绝大多数该基因染色体存在单亲二倍体，少数为染色体中间缺失， 剩余1/3患儿存在复合杂合子突变，进一步证实了NF1功能缺失在NF1发展为JMML中起重 要作用。

幼年型粒单核细胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia，JMML)是一种少见的 儿童慢性髓系白血病，占儿童期白血病的1％～2％。国外文献报道JMML的年发病率为 (0.12～0.30)/(1×10⁴)，美国每年新发JMML为25～50例，我国迄今尚无关于JMML发病率研 究的确切流行病学资料。目前发现RAS信号通路中RAS，PTPN11，NF1，CBL4种基因的突变在JMML 患儿中占有极高的比例，治疗难度大，靶向治疗是目前研究的方向。RAS、PTPN11、NF1及CBL4 种基因突变约占JMML患儿80％～85％，其中PTPN11约占35％，NF约占11％，KRAS、NRAS两者占 17％～30％，CBL占10％～17％。诊断JMML者，约11％伴有NF1，无NF1者约10％～15％存在NF1基因 缺失。

多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验(PTT)、单链构象多态性(SSCP)、异源双链分 析(HA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等均被应用于NF1基因突变的 检测,但所有这些方法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。目前常用的基因突 变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于NF1基因容量大、突变类型多、突变率高、 突变位点散在分布,故而阻止了对NF1基因突变的深入研究，荧光定量PCR法并不适用。

本发明采用Sanger测序法检测NF1基因第31-34号全外显子序列的突变，并且设计的引物 可以扩展整个第31，32,33,34号全外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解NF1 基因第31-34号全外显子的基因突变情况，并不受NF1基因的基因突变多样化以及没有突变热 点的影响，并且很大程度的节省了检测成本。

发明内容

本发明提供检测NF1基因第31-34号全外显子的引物，采用Sanger测序法，可用于快速 检测JMML患者体内检测NF1基因第31-34号全外显子突变的情况。

本发明的目的在于提供检测NF1基因第31-34号全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测 NF1基因第31-34号全外显子突变的3对正、反向引物；其碱基序列为：

NF1_F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT

NF1_R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC

NF1_F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT

NF1_R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG

NF1_F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT

NF1_R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。

进一步地，所述引物还包括3对测序引物，其碱基序列为

NF1_S-F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT

NF1_S-R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC

NF1_S-F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT

NF1_S-R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG

NF1_S-F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT

NF1_S-R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。

进一步地，所述3对正、反向引物的使用浓度比为：NF1_F31:NF1_R31＝1:1； NF1_F32-33：NF1_R32-33＝1:1；NF1_F34：NF1_R34＝1:1。

进一步地，所述3对测序引物的使用浓度比为：

NF1_S-F31:NF1_S-R31＝1:1；NF1_S-F32-33：NF1_S-R32-33＝1:1；NF1_S-F34： NF1_S-R34＝1:1。

本发明的目的还在于提供一种检测NF1基因第31-34号全外显子的方法，其包括如下步 骤：

(1)提取样品DNA；

(2)利用3对扩增引物NF1_F31与NF1_R31，NF1_F32-33与NF1_R32-33，及NF1_F34与 NF1_R34对(1)中的DNA进行扩增，获得覆盖检测NF1基因第31-34号全外显子突变的得扩 增产物；

(3)利用3对测序引物NF1_S-F31与NF1_S-R31，NF1_S-F32-33与NF1_S-R32-33，及 NF1_S-F34与NF1_S-R34对(2)中的扩增产物进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因 序列；

(4)将(3)中的基因序列与野生型RUNX1基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；其 中所述引物序列为：

NF1_F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT

NF1_R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC

NF1_F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT

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NF1_S-F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT

NF1_S-R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC

NF1_S-F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT

NF1_S-R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG

NF1_S-F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT

NF1_S-R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG

本发明的目的还在于提供一种检测NF1基因第31-34号全外显子的试剂盒，其特征在于， 所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、 阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括3对扩增引物NF1_F31 与NF1_R31，NF1_F32-33与NF1_R32-33及NF1_F34与NF1_R34，测序体系包括3对测序 引物NF1_S-F31与NF1_S-R31，NF1_S-F32-33与NF1_S-R32-33，及NF1_S-F34与NF1_S-R34， 包括：

NF1_F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT

NF1_R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC

NF1_F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT

NF1_R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG

NF1_F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT

NF1_R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG

NF1_S-F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT

NF1_S-R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC

NF1_S-F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT

NF1_S-R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG

NF1_S-F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT

NF1_S-R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG

进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2×PCR Buffer；dNTPs；KOD FX DNA  Polymerase。

进一步地，所述测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和 Bigdye Terminator V3.1。

进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。

本发明设计了扩增覆盖检测NF1基因第31-34号全外显子的3对正、反向引物，以及对 所获得的扩增产物进行正反向测序的3对测序引物。对送检样本进行PCR扩增，采用Sanger 测序法，对PCR产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以全面地检测NF1 基因第31-34号全外显子序列的突变情况。通过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条 件，可使扩增效率达到最佳。

有益效果：利用本发明所述扩展引物和测序引物，可以扩展整个第31、32、33、34号全 外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解NF1基因第31-34号全外显子的基因突 变情况，并不受NF1基因突变多样化以及没有突变热点的影响，可覆盖待检测的所有突变位点； 具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵 敏度高，操作简单、成本低等优点。

附图说明

图1样品1的检测结果图。

图2样品2的检测结果图。

图3样品3的检测结果图。

图4样品4的检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常 规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精 编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

检测NF1基因第31-34号全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测NF1基因第31-34号 全外显子的3对正、反向引物；所述扩展引物的碱基序列为：

NF1_F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT

NF1_R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC

NF1_F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT

NF1_R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG

NF1_F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT

NF1_R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。

优选地，所述引物还包括3对测序引物，其碱基序列为

NF1_S-F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT

NF1_S-R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC

NF1_S-F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT

NF1_S-R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG

NF1_S-F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT

NF1_S-R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。

在检测中，先利用上述3对正、反向引物对覆盖检测NF1基因第31-34号全外显子的 DNA片段进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述3对测序引物对扩增产物进行测序，获得 扩增产物的基因序列。

在引物设计上，所设计的每对引物都位于所要扩增的外显子序列两侧，即扩增区域包括 了该外显子的全部序列。因为NF1基因的突变位点很多，突变类型不定。因此本发明所述引 物既能将所述全部外显子序列都扩增出来，也保证无论外显子的何处位置发生突变，都不会 出现漏检的情况。因为第32和33号外显子序列都较短，在基因序列中的位置分别是 168368-168526,169056-169153，中间的内含子序列也只有530bp，因此本发明在检测第32和 33号外显子时，采用同一对扩展引物和测序引物。

检测NF1基因第31-34号全外显子的试剂盒，包括：组织DNA抽提试剂盒(例如使用 天根生物的提取试剂盒)；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、 阴性对照品和空白对照品，其中

检测体系PCR反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)； 检测目的基因用的3对上、下游引物NF1_F31(10μm)与NF1_R31(10μm)，NF1_F32-33(10μm) 与NF1_R32-33(10μm)，及NF1_F34(10μm)与NF1_R34(10μm)。

测序体系包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离 子甲酰胺)、测序引物：NF1_S-F31(3.2μm)与NF1_S-R31(3.2μm)，NF1_S-F32-33(3.2μm)与N  F1_S-R32-33(3.2μm)，及NF1_S-F34(3.2μm)与NF1_S-R34(3.2μm)，以及Bigdye Terminator  V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0. 6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。

检测体系PCR反应液配制如下：

其中，NF1_F31与NF1_R31，NF1_F32-33与NF1_R32-33，及NF1_F34与NF1_R34的 碱基序列为：

NF1_F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT

NF1_R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC

NF1_F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT

NF1_R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG

NF1_F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT

NF1_R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG

阳性对照品：含有NF1序列的溶液。

阴性对照品：无NF1序列的溶液。

空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。

实施例2

血液DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的基因组DNA:

1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒 混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻 底混匀。

2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以 去除管盖内壁的水珠。

4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去 除管盖内壁的水珠。

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000 rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000 rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000 rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。

9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱 CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓 冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：

X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入3个检测体系PCR反应液中各2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳 性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems 公司)等。反应条件如下：

(5)sanger测序：

取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与测序引物：NF1_S-F31(3.2μm)与NF1_S-R31(3.2μm)， NF1_S-F32-33(3.2μm)与NF1_S-R32-33(3.2μm)，及NF1_S-F34(3.2μm)与NF1_S-R34 (3.2μm)按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇， 漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm 离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性 程序：

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。

(7)结果判断：将测序结果与野生型参考序列(GeneBank No.:NG_009018.1)进行比 对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取临床幼年型粒单核细胞白血病患者样本4份，4份样本都不伴有Ι型神经纤维瘤病(NF1) 的症状，检测该4份样本是否存在NF1基因突变。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并 检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用普 通PCR仪检测，时间为160分钟。

样品1的第31号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出NF1 突变。

样品2的第32号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出NF1 突变。

样品3的第33号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出NF1 突变。

样品4的第34号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出NF1 突变。

从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展出NF1 基因第31-34号全外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出NF1基 因第31-34号全外显子，无论是野生型还是突变型。对阳性标本的检测表明本发明所述引物和 方法及试剂盒能够检测出NF1基因突变。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  济南艾迪康医学检验中心有限公司

 

<120>  检测NF1基因第31-34号全外显子的方法和引物

 

<130> 

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cctcaaattc acttggagag agtt                                            24

 

 

<210>  2

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gggataaatc aaaccaaagg aacac                                           25

 

 

<210>  3

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

atgaggactg attgattcag agtt                                            24

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

aacagagcaa ctgagtaagt gg                                              22

 

 

<210>  5

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

gtgtgaacaa gccctccat                                                  19

 

 

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

cttagtccaa gaagatgcaa ag                                              22