防治作物储藏期黄曲霉菌及毒素的海藻希瓦氏菌及其应用

摘要

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及防治作物储藏期黄曲霉菌及毒素的海藻希瓦氏菌及其应用。本发明包含了该海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)YM8的鉴定、以及广谱和广温范围内的抑菌作用，同时鉴定了该菌株产生的抑菌气体代谢产物，并进行了抑菌活性分析等。本发明分离的海藻希瓦氏菌YM8保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2015120。本发明还检测了不同水活度的仓储环境下，该菌株YM8在抑制花生与玉米黄曲霉病害与毒素污染中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株防治储藏期黄曲霉菌侵染和毒素产生的海藻希瓦氏菌及其应用，本发明还涉及该海藻希瓦氏菌YM8的筛选、鉴定、广谱抑菌作用、抑菌气体代谢物检测及活性分析等，同时验证了不同水活度的仓储条件下，该菌株在抑制花生与玉米黄曲霉病害与毒素污染中的应用。

背景技术

黄曲霉菌(Aspergillus flavus)是一种广泛分布的腐生真菌。根据有性阶段将其划分到子囊菌门(Ascomycota)、散囊菌目(Eurotiales)、发菌科(Trichocomaceae)、石座菌属(Petromyces)。黄曲霉菌生长的最适水活度为0.86–0.96，最适温度为37℃，且在12℃–48℃的温度范围内均可生长(Hedayati et al.,2007)。在纬度26°–35°的温带气候地区黄曲霉菌是非常普遍的土壤微生物和植物病原菌，对恶劣环境的强适应能力使得黄曲霉菌成为土壤中和植物上的优势微生物。在我国，黄曲霉菌的分布受气候影响明显，我国长江流域和东南沿海地区的土壤中黄曲霉菌的种群数量明显多于黄河流域和东北地区(张初署，2013)。

黄曲霉菌既可以侵染花生、玉米、棉花等多种重要的经济作物，引起花生苗腐、玉米穗腐等田间病害，又可严重为害储藏过程中的粮食，造成重大的经济损失。黄曲霉菌还是人类和动物的致病菌。对于免疫力低下的人群，黄曲霉菌感染会引起侵袭性曲霉病，造成皮肤、角膜、呼吸系统、循环系统和神经系统的疾病。黄曲霉菌还可以引起其他哺乳动物和鸟类的曲霉病。黄曲霉菌在生长过程中还会产生大量的黄曲霉毒素，该毒素是一种剧毒并且具有强烈致癌、致畸作用的微生物毒素，它对粮食、饲料等农产品的污染会严重危害人类和动物的健康。由于食用受黄曲霉污染的花生饲料导致了超过10万只火鸡黄曲霉毒素急性中毒死亡。据统计全世界受黄曲霉毒素危害的人口达50亿，在发展中国家黄曲霉毒素污染尤为严重，人们在日常生活中长期受超过限量标准的黄曲霉毒素威胁(Williams et al.,2004)。由微生物产生的黄曲霉毒素主要有4种分别为黄曲霉毒素B₁(AFB₁)、B₂(AFB₂)、G₁(AFG₁)、G₂(AFG₂)。黄曲霉毒素是一类剧毒化合物并具有强烈的致癌性，AFB₁是最常见的黄曲霉毒素同时也是自然界中致癌性最强的化合物之一。一次性大剂量吸入或摄入黄曲霉毒素可以引起急性中毒导致死亡。黄曲霉毒素污染粮食导致人中毒的现象在发展中国家尤为严重，在肯尼亚就发生过因食用黄曲霉毒素污染的玉米导致数百人死亡的事件。在美国发生过多例宠物狗因黄曲霉毒素中毒死亡的事件。长期接触黄曲霉毒素会诱发癌症(主要是肝癌)、破坏免疫系统，引起畸形等一系列不良影响。黄曲霉毒素已经于1993年被国际癌症研究中心(IARC，InternationalAgency for Research on Cancer)认定为Ⅰ类致癌物。世界上许多国家制定了严格的标准来限制黄曲霉毒素在食品中的残留。美国FDA组织(Food and Drug Administration)规定在食品中黄曲霉毒素含量不得超过20μg/kg，牛奶中不得超过0.5μg/kg，饲料中不得超过300μg/kg。欧盟对食品中黄曲霉毒素的限制标准为4μg/kg。因此黄曲霉毒素的污染将会给农业和畜牧业带来巨大的经济损失，在美国每年因黄曲霉毒素污染造成的经济损失高达数亿美元。

目前黄曲霉及毒素的防治方法有常规育种、化学防治与生物防治三种手段。通过育种手段可以将数量性状抗病基因整合到感病品种，选育新型的抗病新品种。近年来一些重要的黄曲霉抗性相关QTLs陆续被定位，证明了基因的叠加效应能够增强植物对黄曲霉菌的抗性。但总体而言，黄曲霉抗病材料匮乏，抗性基因的筛选与整合以及育种周期较长，使得常规育种进展缓慢。化学防治作为最直接有效的手段被广泛应用于黄曲霉的田间及储藏期的防治，但是长期的应用易引起药害和病原菌的抗药性，甚至污染环境。另外粮食作物上直接喷洒化学农药容易导致残留，影响人体健康，在使用过程中饱受诟病。微生物源生物制剂作为新型无危害的的防治策略，被逐渐开发和应用于黄曲霉和毒素的田间和储藏期防治中。利用黄曲霉弱毒菌株或不产毒素菌株的竞争优势，可以优先占据了生态龛位，防止黄曲霉感病菌株的侵染和毒素的进一步产生，对黄曲霉的田间和储藏期防治效果明显。目前基于此开发的一种生防制剂已经应用到花生黄曲霉病害防治当中(Dorner and Lamb,2006)。近年来利用微生物产生的挥发性气体防治储藏期病害发展迅速，微生物源的挥发性气体因为其使用简单，散布均匀快速，接触广泛等优点被高效应用于储藏期病害的生物防治。但是对黄曲霉及毒素的储藏期防治没有报道，基于此目的我们筛选了微生物菌株，研究其产气特性和抑菌作用，并开展储藏期黄曲霉毒素防治的研究。

发明内容

本发明的目的在于针对花生与玉米等作物仓储期黄曲霉菌和黄曲霉毒素防治困难，污染和经济损失严重的难题开展研究，利用微生物学方法分离鉴定一株高效防治黄曲霉菌和毒素污染的希瓦氏菌株YM8，利用该海藻希瓦氏菌株在培养基上产生的具有抑菌作用的小分子挥发性代谢物质，可有效抑制花生和玉米等作物上黄曲霉病菌的侵染与毒素的产生。

实现本发明的技术方案如下所述：

通过微生物学方法，本发明从中国辽宁省大连市渤海海域采集海洋沉积物，并从中分离得到一株对黄曲霉有高效抑菌作用的海藻希瓦氏菌株。申请人将其命名为海藻希瓦氏菌YM8，Shewanella algae YM8，于2015年3月17日将该菌株送交中国.武汉.武汉大学中国典型微生物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M 2015120。

海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)YM8的菌学特征：

海藻希瓦氏菌YM8革兰氏染色为阴性，杆状细菌，单端极生鞭毛，菌体大小为0.5μm×1.0μm～2.0μm(宽×长)，生长温度范围为4-40℃，最适生长温度为25-35℃。

我们对该菌株的16S rDNA进行了鉴定，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

本发明还对该菌株对黄曲霉菌菌丝和孢子的高效抑制作用，新型挥发性代谢产物鉴定与抑菌作用，对黄曲霉在不同温度下的抑制作用以及对仓储条件下花生、玉米黄曲霉与毒素的抑制作用进行了相关研究。

本发明的有益效果是：

(1)本发明分离的海藻希瓦氏菌YM8为深海细菌，从海底沉积物中分离得到的一种高效新型抑菌微生物，可作为生防菌株应用。

(2)本发明分离的海藻希瓦氏菌YM8首次证明在密闭环境下，可产生气体物质具有抑菌作用，可完全抑制黄曲霉菌丝的生长与孢子的萌发。

(3)本发明分离到的海藻希瓦氏菌YM8密闭空间内可以抑制病原真菌的生长，同时可以抑制花生和玉米籽粒上的黄曲霉发病与毒素的合成。菌株YM8具有培养简单，使用方便，分布广泛等优势，应用前景广泛。

(4)本发明得到的海藻希瓦氏菌YM8产生的挥发性物质具有抑菌作用，气相色谱质谱联用仪检测到15种物质，验证了6种主要物质对黄曲霉的抑制作用，证明两种物质抑菌效果明显，可以作为潜在的杀菌剂开发应用。

(5)本发明得到的海藻希瓦氏菌YM8分离于深海，具有广温度适应性，在10-40℃的温度范围内，可产生抑菌物质并抑制黄曲霉的生长。同时YM8具有广谱抑菌性，可完全抑制筛选的其他8种重要病原真菌的生长。

更详细的描述见《具体实施方式》。

附图说明：

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离的海藻希瓦氏菌YM8的16S rDNA的序列。

图1：海藻希瓦氏菌YM8在NA培养基上培养48h后的菌落形态。

图2：海藻希瓦氏菌YM8的扫描电镜图片。

图3：海藻希瓦氏菌YM8菌株与其他近缘种菌株基于16s rDNA序列的系统发育树。

图4:海藻希瓦氏菌YM8对黄曲霉菌的菌丝生长与孢子萌发的抑制作用。

图5：海藻希瓦氏菌YM8与黄曲霉孢子共培养10h,12h和24h后的孢子萌发形态。图5中的A,B,C图分别为黄曲霉孢子单独培养10,12,24h的形态；D,E,F图分别为黄曲霉孢子与YM8对扣培养10,12,24h后的状态。

图6：添加活性炭对海藻希瓦氏菌YM8抑菌作用的影响。

图7：海藻希瓦氏菌YM8产生气体物质的GC-MS检测结果。图7中标注的物质为购买的丰度和相似度较高的六种物质的保留时间以及化学结构图。

图8：海藻希瓦氏菌YM8对不同水活度条件下玉米与花生黄曲霉与毒素的控制。图8中A图是不同水活度下的花生与玉米接种黄曲霉后培养7天后的发病图片，图8中的B图是7天后检测不同水活度下籽粒中的黄曲霉毒素含量。

图9：水活度为0.934下的花生培养7天后的扫描电镜观察。图9中的“对照”是花生接种黄曲霉孢子培养7天后的电镜照片，图9中的“YM8”是花生接种黄曲霉孢子与YM8共培养7天后的电镜照片。

图10：海藻希瓦氏菌YM8的广谱抑菌作用。

图11：海藻希瓦氏菌YM8广温范围内的抑菌活性检测。

具体实施方式

实施例1候选菌株YM8的分离和菌学鉴定

(1)候选菌株YM8的分离

我们通过微生物学方法，从中国辽宁省大连市渤海海域采集海洋沉积物，并从中分离得到一株对黄曲霉有高效抑菌作用的海藻希瓦氏菌株，我们将该候选菌株YM8编号为。

(1)YM8菌株的形态特征鉴定

YM8菌株于NA培养基(牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，琼脂15.0g/L，补充蒸馏水至1L；调pH至7.2)培养48h后，可见菌落为淡黄色，菌落表面光滑，边缘整齐，不透明，菌液粘稠(见图1)。革兰氏染色为阴性。电子显微镜观察表明，菌体呈短杆状(见图2)。生化反应证明其培养基内可以产气，可水解卵磷脂、凝胶和脂质，不能水解尿素，鼠李糖培养可产酸，柠檬酸培养不产酸，0℃下不生长等。

(2)YM8的分子生物学鉴定

将YM8菌株于NB培养液(牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，补充蒸馏水至1L；调pH至7.2)中摇培48h后收集菌体，采用10mM的tris-HCl(购自Amresco公司产品)和1mM的EDTA提取基因组DNA(de Silva et al.1998)，提取后用苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)抽提和TER溶解。利用特异性引物扩增16s rDNA并送深圳华大公司进行测序。测序序列长度为1508bp，具体序列如SEQ ID NO.：1所示。

测序引物的DNA序列：

16S rDNA(正向引物)：AGAGTTTGATCCTGGCTC

16S rDNA(反向引物)：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA

在Genbank数据库中，将YM8菌株的16s rDNA序列进行BLAST检索，发现其与希瓦氏菌属内不同种的细菌菌株相似度较高，为进一步确定该菌株的遗传特性，选取比对结果中同源性较高的菌株构建系统发育树。

根据其形态和生化特征，以及16S rDNA基因序列系统发育分析(图3)，经鉴定本发明所分离的菌株是一株海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)，申请人将该菌株命名为海藻希瓦氏菌YM8，Shewanella algae YM8，于2015年3月17日将该菌株送交中国.武汉.武汉大学中国典型微生物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M 2015120。

实施例2海藻希瓦氏菌YM8对黄曲霉的抑菌作用

筛选菌株YM8对黄曲霉菌丝生长的抑制作用采用培养皿(直径9cm)对扣的方式中进行。其中黄曲霉于PDB培养基(去皮马铃薯200.0g沸水煮20min后纱布过滤收集滤液，添加葡萄糖20.0g，蒸馏水定容至1L，自然pH，即不调pH)培养三天后，挑取白色的菌丝团，接种于含PDA的培养皿中央。菌株YM8(100μl,10⁸cfu/ml)涂布于另一个含NA培养基的培养皿表面。将接种黄曲霉菌丝块的培养皿对扣于涂布YM8的培养皿之上，透明胶带封口保存。以仅接种黄曲霉菌丝块的处理作为对照，每个处理有3个重复，28℃黑暗条件下培养5天后计算不同处理的菌丝直径并计算抑菌率。

抑菌率的计算公式如下：

菌丝生长抑菌率＝(对照菌丝直径-处理菌丝直径)/对照菌丝直径Ⅹ100％。

菌株YM8对黄曲霉孢子萌发的抑制作用采用培养皿对扣培养法，100μl黄曲霉孢子(5Ⅹ10⁵cfu/ml)涂布于含PDA培养基的平皿表面，菌株YM8(100μl,10⁸cfu/ml)涂布于含NA培养基的培养皿表面。将接种黄曲霉孢子液的培养皿对扣于接种YM8菌液的培养皿之上，以仅接种黄曲霉孢子的处理作为对照，透明胶带封口保存。28℃黑暗条件下培养1天后显微镜观察，记录孢子萌发个数，以萌发产生的菌丝长度大于孢子直径的作为已萌发。计算不同处理的孢子萌发率，并计算YM8对孢子萌发的抑制率。

计算公式如下：

孢子萌发抑制率＝(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率Ⅹ100％。

海藻希瓦氏菌YM8与黄曲霉菌丝在密封培养皿内无接触培养过程中，可以产生挥发性的气体物质，完全抑制黄曲霉菌丝的生长，YM8对菌丝生长抑菌率达100％(图4)。海藻希瓦氏菌YM8在与菌丝的共培养过程中，通过产生抑菌气体物质可完全抑制孢子的萌发，当培养12h后，对照组的孢子已萌发长出菌丝，但YM8处理组的孢子未见萌发(图5)。继续培养48h后，对照组萌发的菌丝形成菌丝团，覆盖培养基的的表面，YM8处理组仍未见孢子萌发。YM8对孢子萌发的抑菌率达100％(图4)。

实施例3活性炭对海藻希瓦氏菌YM8抑菌作用的影响

鉴于活性炭作为一种挥发性物质的吸附剂，我们将活性炭添加到菌株YM8与黄曲霉的共培养试验中。方法是，中间有分隔的9cm培养皿的一端添加5g活性炭，另一端涂布YM8菌液(50μl，10⁸cfu/ml)，黄曲霉的菌丝块接种于另一个含有PDA培养基的培养皿中央。将接种黄曲霉菌丝块的培养皿倒置扣于添加活性炭和YM8的培养皿之上。试验中采用如下所述的四个处理：(1)：黄曲霉菌丝块；(2)黄曲霉菌丝块+活性炭；(3)黄曲霉菌丝块+YM8；(4)黄曲霉菌丝块+活性炭+YM8。每个处理设置3个重复，封口后于28℃黑暗条件下培养5天后，检测菌丝直径并计算抑菌率。

共培养5天后检测，对照组黄曲霉菌丝直径达5.37cm，添加活性炭后菌丝直径为5.35cm，二者无显著差异，说明活性炭对黄曲霉菌丝的生长无抑制作用。黄曲霉与YM8共培养5天后菌丝直径为0cm，但体系中添加活性炭后菌丝直径为3.20cm，表明YM8密闭体系中可以产生挥发性的气体物质，并抑制黄曲霉的生长，当代谢产物达到一定浓度时，抑菌率达到100％，但反应体系中添加活性炭，作为挥发性物质吸附剂，可以减少有效物质的浓度，降低了对黄曲霉的抑制率(图6)。试验表明YM8产生的抑菌气体物质是抑制黄曲霉生长的关键因素，而并非其他生防机制(如竞争空间，氧气等)。

实施例4海藻希瓦氏菌YM8挥发性气体检测

将菌株YM8接种于100ml三角瓶中的NA培养基表面，涂布均匀。瓶口用双层塑料薄膜封闭，以不接种YM8的三角瓶作为对照，所有三角瓶置于28℃黑暗条件下培养48h。培养后的三角瓶转移到40℃的水浴锅中平衡30min。之后依次进行样品的萃取和GC-MS检测。

样品萃取方法：

采用固相微萃取柱(SPME)进行挥发性物质的富集。将SPME的萃取头插入塑料薄膜之内，推出纤维头，使纤维头处于样品瓶上空的中间位置，吸附30min。将纤维头收回萃取头，并拔出样品瓶后转入气相色谱质谱联用仪(GC-MS)进样检测，检测参数设计如下。

GC条件：

进样口温度为250℃；载气为氦气，柱流速1mL/min；不分流进样。程序升温条件：起始温度为40℃，保持3min后，以3℃/min的速度升温至160℃，同样保持2min，再以8℃/min速率升至220℃，保持3min。J&WHP一5MS弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm ID，0.25um thickness film)。

MS条件：

离子源温度为230℃，四极杆温度150℃，电离方式：EI源，能量为70eV，采用全扫描的模式进行检测，检测范围为50-550amu。检测物质自动进行谱库检索National Institure ofStandards and Technology(NIST 08)，对检测的物质进行定性。

GC-MS检测后，YM8培养试剂瓶检测到的物质，扣除NA培养基对照组中检测到的气体物质，即为YM8产生的挥发性气体组分。试验中YM8共计检出15种物质(图7)，如表1所示。15种物质中含有芳香族化合物，烷类化合物，硫化物，烯醇类，噁唑类，蒽类，酯类以及酚类物质等。鉴定出的物质是分子量介于97-342道尔顿(D)之间的小分子物质，易于挥发。其中组分4(二甲基三硫)是丰度最高的产物，相对峰面积达14.195％，其他物质丰度相对较低。为研究15种产物中主要的抑菌成分，我们将相对丰度在0.5％以上，NIST 08谱库比对相似度高于70％的六种物质购买了标准品，以进行后续的抑菌试验。六种物质的编号和名称分别为2(壬烷)，4(二甲基三硫)，5(2-十二烷醇)，10(2，4-二甲基噁唑)，14(丁基羟基甲苯)，15(2,4-二叔丁基苯酚)(图7)。

表1 GC-MS检测YM8代谢产物

实施例5鉴定挥发性物质对黄曲霉的抑制作用：

购买YM8产生的6种挥发性物质纯品进行抑菌作用检测。采用双皿对扣法测定单成分对黄曲霉菌丝生长和孢子萌发的抑制效果。具体操作如下：将各个单成分的纯品用无水乙醇溶解至1000μg/ml，之后依次稀释至500μg/ml,125μg/ml,50μg/ml，空白乙醇试剂为对照。在下层的培养皿中放一片圆形滤纸片(直径5cm)，分别在滤纸片上滴加40μl稀释液(有效物质浓度约为200μg/L,100μg/L,50μg/L,10μg/L，0μg/L)，迅速将接种了黄曲霉菌丝块的PDA培养皿扣在放有滤纸片的培养皿上，用封口膜封口后，放在28℃条件下培养5d后，测量黄曲霉菌丝直径并计算抑菌率。

培养5天后检测，6种物质对黄曲霉菌丝的生长均具有一定的抑制作用，且在高浓度下抑制作用显著，低浓度下抑菌效果较弱(表2)。六种物质中2,4-二叔丁基苯酚的抑制作用最明显，100μl/L(液体体积/空间体积)的浓度下就可完全抑制菌丝的生长，10μl/L浓度下，抑制率仍高达93.36％。二甲基三硫作用稍弱，在200μl/L时可完全抑制菌丝生长，在100μl/L浓度作用下，黄曲霉菌丝稍有生长，抑菌率达95.62％。2，4-二甲基噁唑对菌丝生长的抑制作用较差，在200μl/L浓度下，抑制率为60.82％，其他3种物质抑菌效果很差，在200μl/L抑菌率为31.61％到40.90％，抑菌率均低于50％。

表2 挥发性物质对黄曲霉菌丝生长的抑制作用

*：同样浓度不同物质抑菌作用进行方差分析，相同字母表示在P＝0.05水平无显著差异。

单成分物质对孢子萌发的抑制作用采用双皿对扣法。将各个单成分的纯品用无水乙醇溶解至1000μg/ml，之后依次稀释至500μg/ml,125μg/ml,50μg/ml，空白乙醇试剂为对照。在下层的培养皿中放一片圆形滤纸片(直径5cm)，分别在滤纸片上滴加40μl稀释液(有效物质浓度约为200μg/L,100μg/L,50μg/L,10μg/L，0μg/L)，迅速将涂布了50μl黄曲霉孢子液(5Ⅹ10⁵cfu/ml)的PDA平板扣在放有滤纸片的培养皿上，用封口膜固定封口后，放在28℃条件下培养12h，在显微镜下随机测量40个孢子的萌发数，每个处理测量六组数据，计算孢子萌发率以及各物质对孢子萌发的抑制率。

共培养12h后检测孢子萌发状况(表3)，与对照组相比所有物质均可抑制黄曲霉孢子的萌发，六种物质中2,4-二叔丁基苯酚的抑制作用最强，100μl/L(液体体积/空间体积)的浓度下就可完全抑制黄曲霉孢子的萌发，抑制率为100％，浓度为10μl/L时，抑制率达74.02％。二甲基三硫在200μl/L可完全抑制黄曲霉孢子萌发，抑菌率达100％；在100μl/L作用下，抑制作用减弱，抑菌率达88.98％。随着浓度的降低，所有物质的抑菌作用成减弱趋势。其他四种物质抑菌效果相对较差，在200μl/L抑菌率为37.88％到55.51％。

表3 挥发性物质对黄曲霉孢子萌发的抑制作用

                                                                    *：

说明：*同样浓度不同物质抑菌作用进行方差分析，相同字母表示在P＝0.05水平无显著差异物。

实施例6海藻希瓦氏菌YM8对花生、玉米储藏期黄曲霉的防治：

分别称取100g玉米和花生籽粒并保存于250ml三角瓶中，每个作物称取3个三角瓶。于121℃和1.01MPa下灭菌20min，室温下静置冷却。所有三角瓶接种新鲜收集的黄曲霉孢子液1ml(5Ⅹ10⁵cfu/ml)。双手摇匀10min。花生籽粒的3个三角瓶加灭菌水后调整水活度分别为0.785,0.866和0.934，玉米籽粒的3个三角瓶调整水活度至0.740，0.859和0.923。摇匀后将三角瓶中的籽粒随机倒入6cm培养皿中，每个三角瓶倒4份，每份20-25g，每个水活度下的四份材料各分为两组，一组用于对照培养，一组用于YM8处理。试验于2.5L的干燥器中进行，分三种水活度(0.7，0.8，0.9)，每个水活度设对照和YM8处理。对照组的2份花生与2份玉米材料培养于底部含空白NA培养基(15cm直径，2cm厚)的干燥器隔板上。YM8组的2份花生与2份玉米材料培养于底部NA培养基涂布有YM8菌液(1ml，10⁸cfu/ml的干燥器隔板上。干燥器盖盖封闭保存，培养于28℃黑暗下7天，检查不同籽粒的发病状况并记录每个处理的发病率。所有籽粒于60℃下烘干处理5天，研磨后检测黄曲霉毒素的含量。

黄曲霉毒素的提取：称取研磨的样品1g于5ml的聚丙烯塑料管中。用5ml已腈/水(84/16,v/v)抽提。拧紧管盖后蜗旋处理1min，之后超声处理60min。6000rpm离心10min，取上清1ml转移至新的离心管中，加入相同体积的正己烷混合均匀后静置分层。吸取上层有机相500ul进行毒素定量分析。

黄曲霉毒素的检测：提取的黄曲霉毒素采用高效液相色谱与质谱联用仪(ThermoScientific，加利福尼亚大学，美国)进行检测。液相色谱分析采用C18色谱柱(50mm×2.1mm,3.0μm填充粒径)，温度设置为35℃。流动相为A:甲醇和B:水(超纯水含5mM醋酸铵和0.05％甲酸，v/v)。流速为0.3ml/min，采用梯度进行方式进行洗脱，共计7min，具体进样程序为，0-1min，20％A；1-4min，20％-100％A；4-5min，100％A；5-5.5min，100％-20％A。进样体积为5μl。质谱分析采用电喷雾质谱(ESI+)选择离子监测模式进行，最优雾化器温度为350℃，毛细管温度为350℃，喷雾电压为3.5Kv(ESI+)。碰撞气压力为1.5m Torr，碰撞气体为氩气。黄曲霉毒素B1,B2,G1和G2的检测采用选择离子监测模式，监测离子(定量离子，定性离子)分别为AFB1(m/z 285.1,241.0),AFB2(m/z 287.1,259.0),AFG1(m/z 243.0,200.0),AFG2(m/z 313.1,189.0)。

不同水活度下培养7天后，对照组花生和玉米籽粒发病明显，且随水活度增高，发病越来越严重，对照组随水活度增加花生籽粒的发病率分别为25.3％，96.7％和100％。玉米籽粒的发病率为2.7％，98.4％和100％。YM8处理组花生与玉米籽粒均未发病，处理7天后三种水活度下发病率均为0％，表明YM8产生的气体物质，不同水活度下，可完全抑制黄曲霉侵染花生和玉米籽粒(见图8中的A图)。

培养7天后收集所有样品并研磨后进行黄曲霉毒素检测，检测了AFB1,AFB2,AFG1,AFG2四种毒素的含量，结果显示在花生的对照组处理中，三种水活度下毒素的总量分别为8.47，43.35和54.02μg/g，毒素的含量随水活度的增加而增加。与此相比，YM8处理中三种水活度田间均未检测到毒素，表明YM8产生的气体物质在花生中可高效抑制黄曲霉毒素的产生(图8中的B图)。相似的趋势出现在玉米籽粒的处理中，三种水活度下毒素的总产量分别为0.06，0.79和5.59μg/g。YM8处理中同样未检测到毒素。毒素检测结果与发病率的结果相符，表明在仓储条件下，YM8在广水活度范围内可高效抑制黄曲霉的侵染和毒素的产生。

实施例7海藻希瓦氏菌YM8对黄曲霉抑制作用的显微观察：

黄曲霉孢子接种于花生籽粒培养7天后，高水活度条件下黄曲霉发病严重，但YM8处理组未见明显的发病症状，为检测黄曲霉的侵染状态，选取高水活度(0.934)条件下的花生籽粒进行扫描电镜观察。将对照组与YM8处理组的花生籽粒取出，并分别于1％的锇酸中熏蒸固定1h，取固定后的花生表皮进行表面喷金和电镜观察(型号JSM-6390,日立公司，日本)。

样品进行扫描电镜观察显示，对照组花生表面覆盖大量的黄曲霉菌丝和孢子，分生孢子呈圆形，形状规则，表面有光滑的突起，分生孢子着生于分生孢子梗的小柄上(图9)。YM8处理组花生表面仅见少量孢子，未见菌丝和分生孢子梗形成，且孢子呈现不规则形，表面小球皱缩，有褶皱等(图9)。结果表明YM8产生的气体物质可导致孢子的结构变化，进一步抑制了孢子萌发形成菌丝和孢子梗的形成。

实施例8海藻希瓦氏菌YM8对不同真菌的抑制作用

海藻希瓦氏菌YM8的广谱抑菌作用采用相同的培养皿对扣方法(方法同实施例3)，分别接种不同病原真菌菌丝块的PDA培养皿与涂布YM8菌液的NA培养皿，对扣培养于28℃。以不接YM8的NA培养皿为对照，共培养5天后，测量病原菌的菌丝直径并计算不同温度条件下的抑菌率。供试病原真菌包括寄生曲霉(A.parasiticus),黑曲霉(A.niger),链格孢(Alternariaalternate),灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea),禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),链核盘菌(Monilinia fructicola),和核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)。

海藻希瓦氏菌YM8在密闭的空间内不仅抑制黄曲霉菌的生长，同时可以抑制其他选用的8种病原真菌的生长，包括寄生曲霉、黑曲霉、链格孢、灰葡萄孢菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、链核盘菌和核盘菌等。在对照处理中，8种真菌的菌丝均可生长，但是YM8处理中，8种真菌的菌丝生长均受到抑制，抑制率达100％。结果表明海藻希瓦氏菌YM8对不同属的病原真菌具有广谱抑菌性，且抑菌作用显著(图10)。

实施例9海藻希瓦氏菌YM8广温度范围的抑菌作用：

海藻希瓦氏菌YM8的广温度范围抑菌作用采用培养皿对扣方法(方法同实施例2)，接种黄曲霉菌丝块的PDA培养皿与涂布YM8菌液的NA培养皿，对扣培养于10℃，20℃，30℃和40℃。以不接YM8的NA培养皿为对照，共培养5天后，测量黄曲霉的菌丝直径并计算不同温度条件下的抑菌率。

培养5天后检测黄曲霉的生长状况，结果显示对照组处理中，黄曲霉菌丝在30℃生长最快，5天后菌丝直径达到5.88cm，20℃生长稍差，达到3.56cm，40℃为1.5cm，但是在0℃培养5天后未见菌丝生长。在YM8处理下，四种温度条件下均未见菌丝生长，表明YM8产生的挥发性气体物质可以完全抑制菌丝生长，抑制率达100％，且YM8具有广温适应性，不同温度条件下均可产生挥发性抑菌气体物质(见图11)。

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