禽和猪戊型肝炎病毒共有抗原、单克隆抗体和制备方法及应用

摘要

本发明利用传统的杂交瘤细胞技术制备了两株分泌抗禽和猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)共有抗原表位的单克隆抗体杂交瘤细胞系，命名为3E8和1B5，其细胞保藏号分别为CCTCC No：C201395和CCTCC No：C201396。本发明利用噬菌体随机7肽库试剂盒鉴定了上述两株单抗识别的共有抗原表位的氨基酸序列，分别为V/IPHD(SEQ ID No:1)和VKLYM(SEQ ID No:2)，同时分析了两个表位的模拟肽在禽和猪HEV血清学诊断中的应用。本发明公布的禽和猪HEV衣壳蛋白两个共有抗原表位的模拟肽，可以用于禽和猪HEV的快速诊断以及疾病流行的监控。另外，本发明公布的两株识别上述共有表位的单克隆抗体，也可以快速诊断禽和猪HEV。

说明书

技术领域

本发明涉及两个禽和猪戊型肝炎病毒共有抗原表位的氨基酸序列，及能够识别上述共有抗原表位的单克隆抗体，还涉及该表位的模拟肽和单抗在体外检测中的应用，属于生物学领域。

背景技术

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染所致的急性病毒性肝炎，主要流行于亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家，在发达国家也偶有病例报道。在我国发生的急性病毒性肝炎中戊型肝炎约占20％左右。越来越多的研究发现戊型肝炎是一种人畜共患疾病，因此该病是一个重要的公共卫生问题。

已有研究发现，HEV可以感染猪、鸡、羊、鼠和牛等动物。Meng等于1997年分离鉴定了第一个动物HEV分离株——猪HEV，并且发现其与人HEV的同源性达到了97％左右，而且越来越多的证据证明，猪HEV具有人畜共患性。2001年，Haqshenas等从患有肝炎脾肿大(Hepatitis-splenomegaly，HS)综合症的鸡胆汁中分离出第二个动物分离株——禽HEV。目前虽然还没有直接证据表明禽HEV可以感染人类，但抗禽HEV的特异性抗体在人和猪血清中的检出，说明禽HEV具有感染人类或其它家畜的可能性。

禽与猪HEV在遗传性和抗原性上具有相关性。基因序列分析发现，禽与猪HEV的全基因组均含有3个开放阅读框(ORF)，ORF1、ORF2和ORF3。其中，ORF2编码病毒的衣壳蛋白，是病毒主要的结构蛋白，并含有病毒主要的抗原表位。相关的研究在分析禽HEV的衣壳蛋白抗原性发现，该蛋白C端的268个氨基酸区域能够与人和猪HEV的抗血清发生交叉反应，说明该区域含有禽和猪HEV的共有抗原表位。但是关于共有抗原表位的精确鉴定，及该共有抗原表位的模拟肽在禽和猪HEV的血清学诊断应用却仍没见有相关报道。

发明内容

本发明的目的之一提供两株能够分泌抗禽和猪戊型肝炎病毒共有抗原表位的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

本发明的目的之二在于提供两个禽和猪戊型肝炎病毒共有抗原表位的氨基酸序列。

本发明的目的之三在于依据上述氨基酸序列设计合成了两个用于禽和猪戊型肝炎抗体检测的多肽，并依据该多肽建立禽和猪戊型肝炎病毒感染的血清学诊断方法。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

作为本发明的第一方面，禽和猪HEV衣壳蛋白共有抗原表位的氨基酸序列为V/IPHD(SEQ ID No:1)和VKLYM(SEQ ID No:2)。

作为本发明的二方面，一种蛋白，名称为单克隆抗体3E8(单抗3E8)，是识别共有抗原表位，禽和猪HEV ORF2蛋白的序列I/VPHD(SEQ ID No:1)的特异性抗体，其杂交瘤细胞株细胞保藏号为CCTCC No:C201395。

进一步鉴定发现，所述表位的模拟肽的氨基酸序列为VPHD(SEQ IDNo:1)。其中V和D中的一个或多个氨基酸进行缺失或替换，会影响多肽与单抗的结合力，但是不影响结合，而氨基酸P和H是关键氨基酸，影响单抗与多肽的结合。

作为本发明的第三方面，一种蛋白，名称为单克隆抗体1B5(单抗1B5)，是识别共有抗原表位，禽和猪HEV ORF2蛋白的序列VKLYM(SEQ ID No:2)的特异性抗体，其杂交瘤细胞株的细胞保藏号为CCTCC No:C201396。

进一步，发现每个氨基酸序列均影响着单抗与多肽的结合。

作为本发明的第四方面，制备两株分泌抗禽和猪HEV衣壳蛋白共有抗原表位的单克隆杂交瘤细胞系。

一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

其特征在于，包括以下步骤：

利用禽戊型肝炎病毒中国分离株(Hepatitis E virus,HEV,CaHEV,Genbank number GU954430)的ORF2蛋白为免疫原，免疫BABL/c小鼠，采用杂交瘤细胞技术制备了两株分泌抗禽和猪HEV共有抗原表位单克隆抗体的杂交瘤细胞系，分别命名为3E8和1B5。

进一步，两个共有抗原表位的单抗隆抗体3E8和1B5，重链均为IgG1，轻链均为κ链。

作为本发明的第五方面，一种共有抗原表位制备的多肽，其特征在于，用于制备禽和猪戊型肝炎疫苗。一种上述的共有抗原表位制备的多肽及应用，利用两个表位的氨基酸序列合成多肽为包被抗原，间接ELISA发现其能与禽和猪HEV的阳性血清发生强烈的抗原抗体反应，而与阴性血清不反应。

作为本发明的第六方面，所述单克隆抗体用于制备在禽和猪戊型肝炎病毒诊断中的应用试剂盒。

本发明技术方案的详细描述：

本发明用纯化的原核表达的禽戊型肝炎病毒中国分离株(Hepatitis Evirus,HEV,CaHEV,Genbank number GU954430)ORF2的C端268个氨基酸蛋白为免疫原，免疫BALB/c鼠，制备抗禽戊型肝炎病毒中国分离株(Hepatitis E virus,HEV,CaHEV,Genbank number GU954430)ORF2蛋白的单克隆抗体，成功制备了两株单克隆抗体3E8和1B5。并且通过间接ELISA和Western blotting方法检测发现，该两株单抗除能特异性与禽HEV ORF2蛋白反应外，还能与猪戊型肝炎病毒中国山东分离株(Hepatitis E virus,HEV,CHN-SD-sHEV,Genbank number KF176351)ORF2蛋白发生交叉免疫反应，表明3E8和1B5识别的表位为禽和猪HEV ORF2蛋白共有抗原表位。

利用3E8和1B5两株单抗，包被ELISA反应板，然后利用噬菌体展示随机环7肽库试剂盒(BioLabsinc)分别筛选上述两个单抗识别的模拟表位，发现一个表位基序I/VPHD与单抗3E8具有结合活性，另一个表位基序VLYMSV与单抗1B5具有结合活性。

本发明的有益效果：

本发明的禽和猪戊型肝炎病毒衣壳蛋白两个共有抗原表位的模拟肽。

一种单克隆抗体3E8所识别的共有抗原表位，其氨基酸序列是由禽和猪HEV ORF2蛋白的序列I/VPHD(SEQ ID No:1)组成。

一种单克隆抗体1B5所识别的共有抗原表位，其氨基酸序列是由禽和猪HEV ORF2蛋白的序列VKLYM(SEQ ID No:2)组成。

该共有抗原表位可以用于禽和猪戊肝的快速诊断以及疾病流行的监控。用于制备禽和猪戊型肝炎疫苗，纯度大于98％。

本发明的两株识别上述共有抗原表位的单克隆抗体，可以快速诊断禽和猪戊型肝炎病毒。

附图说明

图1目的基因重组表达质粒的酶切鉴定。

图2A目的蛋白纯化的SDS-PAGE分析(A)。

图2B目的蛋白纯化的Western blot鉴定(B)。

图3纯化的单抗3E8和1B5的抗体效价。

图4两株单抗3E8和1B5与禽和猪HEV ORF2蛋白的ELISA交叉反应结果，Avian HEV是禽戊肝病毒，Swine HEV为猪戊肝病毒。

图5A单抗3E8与禽和猪HEV ORF2蛋白的Western blot的交叉反应结果。

图5B单抗1B5与禽和猪HEV ORF2蛋白的Western blot的交叉反应结果。

图6A单抗3E8筛选阳性噬菌体的ELISA检测验证。

图6B单抗1B5筛选阳性噬菌体的ELISA检测验证。

图7模拟共有抗原表位及突变和缺失的多肽与单抗3E8和1B5的ELISA反应结果。

杂交瘤细胞株3E8【禽戊型肝炎病毒中国分离株(Hepatitis E virus,HEV,CaHEV,Genbank number GU954430)ORF2蛋白的单克隆抗体3E8】

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)

地址：湖北省武汉市武汉大学

保藏日期：2013年7月17日

保藏编号：CCTCC NO:C201395。

杂交瘤细胞株1B5【禽戊型肝炎病毒中国分离株(Hepatitis E virus,HEV,CaHEV,Genbank number GU954430)ORF2蛋白的单克隆抗体1B5】

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)

地址：湖北省武汉市武汉大学

保藏日期：2013年7月17日

保藏编号：CCTCC NO:C201396。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或厂商提供的条件进行。

实施例1 小鼠免疫与单克隆抗体的制备

(1)表达、纯化禽HEV ORF2蛋白C端268个氨基酸

根据禽戊型肝炎病毒中国分离株(Hepatitis E virus,HEV,CaHEV,Genbank number GU954430)，设计带有BamHI和XholI酶切位点的引物ORF2-268-F：CACGGATCCCAGTATATGTACGGC(SEQ ID No:3)；ORF2-268-R：GAACTCGAGTTAGGGTGGTGAGGGGAAT(SEQ ID No:4)，以CaHEV悬液为模板，RT-PCR方法得到目的基因序列，然后将目的基因与pET-28a(+)载体同时用BamHI和XholI进行双酶切，T4连接酶连接，构建重组表达质粒pET-ORF2-268。重组质粒经酶切鉴定后得到了目的基因片段804bp和载体片段5300bp，重组质粒测序后，其与GenBank上CaHEV序列比对同源性100％，说明成功构建了包含目的基因的原核表达载体(图1)。

将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌表达宿主菌Rosetta(DE3)中，挑取阳性单克隆于37℃摇床225rpm加入IPTG 1mM诱导表达6h。菌液5000r/min离心10min，弃上清，重悬沉淀。然后超声破碎菌体，工作时间1s，间隙时间3s，全程时间15min，总共225次。超声后，12000r/min离心10min，收集包涵体沉淀。用5mL4M尿素溶解包涵体，室温孵育1h。将其用0.22μm的滤膜过滤，然后利用Ni柱进行蛋白的纯化。纯化的蛋白经SDS-PAGE分析，在32kDa左右出现了一条带，而无其他杂带(图2A)，说明获得了较纯的目的蛋白。利用禽HEV抗体阳性鸡血清作为一抗，Western blot鉴定得到了目的蛋白的正确表达(图2B)。纯化的样品用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Pierce BCA Protein Assay Kit)测定浓度为19.6mg/ml，然后冻存于-20℃备用。

(2)小鼠的免疫

a)免疫原的乳化(弗氏佐剂)：

将纯化蛋白与佐剂按照1：1(V/V)混合，然后在振荡器上震荡乳化，将乳化好的免疫原滴一滴在预冷的水中，30分钟不扩散为乳化完全。

b)免疫程序

选择6-8周的BABL/c小鼠作为免疫动物。每次免疫前尾部静脉采血，两次免疫间隔为2周。第一次用弗氏完全佐剂，蛋白剂量为75μg/只，腹腔注射，总剂量200μl/只。第二次用弗氏不完全佐剂，蛋白剂量仍为75μg/只。参考第二次相同的剂量和方式进行第三次免疫。融合前加强免疫一次。

(3)细胞融合

免疫好的BALB/c小鼠，无菌取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5:1在1mL50％PEG下融合，然后利用HAT培养基进行选择培养。

(4)阳性细胞的筛选及亚克隆

以纯化的禽HEV ORF2-268蛋白为抗原(200ng/well)包板，吸取细胞培养上清以间接ELISA方法筛选阳性的细胞克隆，对结果显示阳性孔，则继续做亚克隆，同时扩大培养并冻存。采用有限稀释法对所选择的杂交瘤细胞进行2次亚克隆。经两次亚克隆，ELISA筛选后获得两株不同母代分泌抗靶蛋白的特异性杂交瘤细胞株为3E8和1B5，其细胞保藏号分别为：CCTCC No:C201395和CCTCC No:C201396。

(5)单抗腹水的制备及纯化

将培养至生长期的杂交瘤细胞吹下，然后小鼠腹腔接种0.5mL的细胞悬液。接种后大约7-10天，收集腹水。将腹水放入25mL的小烧杯中，逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，慢慢搅拌2h后，10000rpm离心，沉淀用0.01M pH7.2的PBS重悬。然后用Protein G亲和层析柱进一步纯化单抗。成功制备和纯化的单抗3E8和1B5，其与目的蛋白特异性的发生ELISA反应，当单抗与目的蛋白ELISA反应的OD₄₅₀＝1.0时，单抗3E8的抗体滴度为10⁴～10⁵，单抗1B5的抗体滴度为10²～10³(图3)，说明纯化的单抗获得了高的抗体效价。

(6)单抗亚型鉴定

按Sigma公司小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒的说明进行鉴定，经鉴定3E8和1B5重链亚型均为IgG1，轻链均为κ链。

(7)单抗与猪HEV ORF2蛋白的交叉反应

原核表达猪HEV ORF2(Swine Hepatitis E virus,CHN-SD-sHEV，Genbank number KF176351)蛋白C端268个氨基酸(SEQ ID NO.5)，根据序列设计两对引物F15’-CCGGGATCCCAGTTATTTTACTCC-3’(SEQID NO.6)和R15’-ATGCTCGAGTCAATACTCCCGGGT-3’(SEQ IDNO.7)，参考禽HEV ORF2蛋白的表达策略，大量表达后纯化获得蛋白为sHEV-ORF2，将该蛋白以及禽HEV ORF2-268蛋白为抗原，与单抗3E8和1B5进行间接ELISA和Western blot交叉反应，间接ELISA结果发现，单抗3E8和1B5与猪HEV ORF2蛋白的反应结果与禽HEV ORF2蛋白的结果一样，均为阳性，而免疫前小鼠血清为阴性，说明两株单抗可以与禽和猪HEV ORF2蛋白发生特异性的交叉反应(图4)，而Western blot结果进一步证实，两株单抗能与禽和猪HEV ORF2蛋白发生交叉免疫反应(在预期的禽和猪HEV ORF2蛋白大小处出现了棕褐色条带)(图5A和图5B)。上述间接ELISA和Western blot结果共同说明单抗3E8和1B5能够与禽和猪HEV ORF2蛋白发生交叉反应，即该两株单抗识别的抗原表位为禽和猪HEV共有抗原表位。

实施例2 单抗识别抗原表位氨基酸序列的鉴定

为了进一步鉴定单抗3E8和1B5识别的抗原表位的氨基酸序列，本发明利用噬菌体随机环七肽展试剂盒(NEW ENGLAND BioLab，美国)，然后采用生物筛淘的方式，筛淘能与单抗3E8和1B5能够与其特异性结合的噬菌体，将噬菌体浓缩鉴定后测序，将获得的核苷酸序列推到为氨基酸序列，并进行比对，出现几率最高的氨基酸即可能为单抗识别抗原表位的氨基序列，然后通过合成多肽，进一步精确定位抗原表位不同氨基酸序列的作用。

(1)噬菌体滴度测定

对每一轮筛淘的噬菌体进行滴度测定，其方法简述如下：将大肠杆菌ER2738的过夜培养液用LB培养基1:100稀释。将各轮投入、产出的噬菌体液按比例稀释后取10μl加入到200μl上述细菌培养物中，快速混合，室温孵育5min后加入到准备于50℃水浴箱中的LB顶层琼脂，快速混匀后均匀涂布于含有LB/IPTG/Xgal平板上，37℃培养过夜后计数。

(2)生物淘选

利用噬菌体随机环七肽展试剂盒(NEW ENGLAND BioLab，美国)，按说明书进行三轮连续淘选。简述如下：首先用包被缓冲液(0.1mol/LNaHCO₃，pH8.6)分别稀释单抗3E8和1B5包被96孔ELISA反应板(100μg/孔)，4℃孵育过夜；后加入300μl封闭液(0.1M NaHCO₃，5g/L牛血清蛋白，0.2g/L NaN₃，pH8.6)，37℃孵育1h后，洗板后将10μl1×10¹³pfu/ml的原噬菌体1:10稀释加入反应孔中，孵育1h后洗板；然后加入100μl甘氨酸-盐酸缓冲液(0.2mol/L，pH2.2)，室温孵育10min，洗脱结合的噬菌体，转移到微量离心管，加入150μl1M Tris-HCl(pH9.1)中和洗脱液。取2μl洗脱液测定滴度，然后扩增富集特异结合的噬菌体。按上述步骤再进行2、3轮淘选，2、3轮淘选扩增的洗脱物中2×10¹⁰pfu的加入量进行试验，将洗涤液中Tween的浓度增至0.5％。通过测定噬菌体滴度测得三轮淘选中噬菌体的接入量和洗脱量，计算产率＝洗脱量/接入量×100％。数据显示，随着淘选次数增加，产率逐渐提高，证明特异性结合噬菌体的到富集(表1)。

表1 噬菌体随机肽库淘选结果

注：^a生物淘选实验中加入噬菌体数量；^b每轮淘选中洗脱得到特异性结合的噬菌体数量；^c产率表示每轮淘选特异性噬菌体的富集程度

(3)噬菌体亲和捕获ELISA

从两株单抗第3轮淘洗后洗脱物的滴度测定板中各随机挑取10个蓝斑。扩增并纯化后测定滴度。用NaHCO₃缓冲液(pH9.6)制备1×10¹⁰pfu/mL的单个克隆噬菌体液。用单抗3E8和1B5包被微反应板(100μl/孔)，4℃孵育过夜后，洗涤液(PBST含0.5％吐温-20的0.01M pH7.2PBS)洗板，然后封闭液(含2.5％脱脂奶粉PBST)封闭1h，PBST洗板3次，分别加入用包被液1:100稀释单抗3E8和1B5筛淘的10株噬菌体，每孔加入100μl室温孵育1h后，再用PBST洗5次，加入1:4000稀释的HRP-鼠抗M13抗体(Pharmacia，USA)100μl，室温孵育1h后PBST洗5次，显色液3,3’,5,5’-四甲基联苯胺二盐酸(TMB)，100μl/孔孵育15min，测定A490nm的吸光度值，吸光值大于0.5判定为阳性。单抗3E8与其筛淘的10株噬菌体克隆均发生反应(A490nm>0.8)，说明10株噬菌体克隆均与3E8发生特异性结合(图6A和图6B)。而单抗1B5与10株噬菌体克隆中的9株发生反应(A490nm>0.8)，说明9株噬菌体克隆与1B5发生特异性的结合(图6A和图6B)。噬菌体克隆与单抗的特异性结合进一步说明噬菌体表面展示的多肽能够与单抗发生特异性的结合。最后确定10株能与单克隆抗体3E8和9株与单克隆抗体1B5发生结合的噬菌体。

(4)噬菌体单链DNA模板的制备和序列测定

将上述获得的阳性噬菌体克隆测序后，获得了噬菌体展示多肽的单链DNA序列，通过DNAStar软件，推到获得DNA序列编码的氨基酸序列，即获得了单抗识别抗原表位的氨基酸序列。具体实施如下：分别向两株单抗筛淘鉴定获得的10株和9株噬菌体克隆菌液加入200μl PEG/NaCl[20％(w/v)PEG-8000,2.5M NaCl]，混合后，4℃静置10min，10000rpm离心10min，将沉淀溶于100μl碘缓冲液[10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA,4M NaI]于30μl超纯水。然后送由南京金斯瑞生物科技公司测序，测序引物为5’-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG–3’(SEQ ID No:8)。测序后获得的核苷酸序列推导相应外源氨基酸序列，并将其与已知的禽和猪HEVORF2蛋白的氨基酸序列进行同源性比对。出现几率最高的氨基酸序列即可能为单抗识别抗原表位的氨基酸序列。由此获得单抗3E8识别的氨基酸序列可能为V/IPHD，而1B5识别的氨基酸序列可能为VKLYMS(表2)。

表2 阳性噬菌体展示的外源氨基酸序列

注：虚线里的为出现几率最高的氨基酸，其可能为单抗识别抗原表位的氨基酸序列

(5)单抗3E8和1B5识别抗原表位的氨基酸序列的精确定位

根据单抗3E8结合的噬菌体展示的多肽序列比对分析，设计合成6段可能识别的多肽(突变不同的氨基酸序列)(表3)；同时根据1B5结合的噬菌体展示的多肽序列比对分析，设计合成2段1B5可能识别的多肽(表3)。多肽送由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并偶联血蓝蛋白(KLH)，分析鉴定纯度≥98％。然后将上述合成的多肽分别与对应的单抗进行间接ELISA反应，分析抗原表位中不同氨基酸在其与单抗结合中发挥的作用。间接ELISA反应实施的步骤如下：将8个多肽100μl/孔(2ng/μl)分别包被ELISA板，4℃孵育过夜。PBST洗3次，加入200μl封闭液，室温孵育1h，再PBST洗3次，加入100μl(10ng/μl)单抗3E8和1B5，室温孵育1h，PBST洗5次后，加入100μl(1:4000)HRP标记的羊抗鼠IgG(JackonImmunResearch,West Grove,PA)，室温孵育1h洗涤后，加入100μlTMB，室温避光静置15min，加入50μl3M H₂SO₄终止反应，于分光光度计读A450值。结果发现突变的P和H的多肽不能与3E8发生反应，而突变I和D的多肽仍能与3E8反应，但结合力减弱。说明单抗3E8识别的抗原表位的氨基酸序列为I/VPHD，其中氨基酸PH其关键作用。而对于1B5，缺失氨基酸MSV的多肽不与1B5反应，说明单抗1B5识别的抗原表位的氨基酸序列为KLYMSV，氨基酸序列不能再缩短。

表3 人工合成多肽序列

实施例3 禽和猪HEV共有抗原表位模拟肽的应用

为了分析上述鉴定的单抗3E8和1B5识别共有抗原表位的氨基序列的应用，本专利通过南京金斯瑞生物科技有限公司合成并偶联血蓝蛋白(KLH)的共有抗原表位的模拟肽IPHD(3E8)和KLYMSV(1B5)，然后将模拟肽用0.01M PBS(pH7.2)缓冲液包被96孔ELISA板(100ng/孔)，4℃孵育过夜后用含有0.5％吐温-20的PBS洗涤液(PBST)洗板5次(300μl/孔)，然后封闭液(含2.5％脱脂奶粉的PBST)封闭1h，PBST洗5次后，加入100μl禽和猪HEV抗体阳性和阴性鸡和猪血清(1:100)，室温孵育1h，PBST洗5次后分别对应加入100μl(1:4000)HRP标记的羊抗鸡和猪IgG(Jackon ImmunResearch,West Grove,PA)，室温孵育1h洗涤后，加入100μl TMB，室温避光静置15min，加入50μl3M H₂SO₄终止反应，于分光光度计读A450值。结果发现两个模拟肽与禽和猪HEV抗体阳性鸡和猪血清发生反应，而与阴性血清不反应(表4)，说明合成的单抗3E8和1B5识别的抗原表位的模拟肽IPHD(3E8)和KLYMSV(1B5)能够很好的应用于禽和猪HEV抗体的检测及禽和猪HEV感染的血清学诊断(图7)。

表4不同的禽和猪HEV抗体阳性和阴性血清与3E8和1B5识别的共有表位模拟肽的间接ELISA反应

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。