一种β-葡萄糖苷酶突变体、其重组表达质粒及转化的工程菌株

摘要

本发明通过基因定点突变的方法获乙醇耐受浓度提高的β-葡萄糖苷酶的基因、突变质粒、工程菌，并可在将工程菌诱导表达后，获得乙醇耐受浓度提高的β-葡萄糖苷酶。本发明以来自海洋未培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶为基础，通过PCR定点突变，获得突变基因。在35℃条件下，相对野生型β-葡萄糖苷酶蛋白，获得的突变蛋白的乙醇耐受浓度IC

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及通过基因定点突变的方法获得乙醇耐受浓度 提高的β-葡萄糖苷酶基因、突变质粒、工程菌及突变酶。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(EC 3.1.2.21，β-glucosidase)属于纤维水解酶类，主要水解糖苷或寡糖中 的β-1,4-糖苷键，同时释放出末端非还原性的葡萄糖以及糖苷配体，在现代工业生物技术如 食品、医药、饲料加工、能源炼制等领域具有重要应用价值。其参与大豆异黄酮苷元制备的 主要流程如下：①以大豆异黄酮粉或脱脂豆粕等为原料制备大豆异黄酮糖苷提取物；②在糖 苷转化体系中添加β-葡萄糖苷酶，于30～60℃保温一定时间，进行酶解反应；③酶解产物经 过固液分离等过程，最终制备获得不同纯度的大豆异黄酮苷元制品。

因糖苷型大豆异黄酮中染料木苷等成分的水溶性差，在酶法制备过程中，通常需要在体 系中添加有机溶剂，如10％～20％(v/v)的乙醇，以增加大豆异黄酮的溶解度，进而提高酶 解效率；另外，在β-葡萄糖苷酶的水解体系中，随着反应的进行，产物葡萄糖会不断累积。 因此，需要参与反应的β-葡萄糖苷酶具有耐有机溶剂、抗产物葡萄糖抑制等优良性质。目前， 在自然界中已发现有少数β-葡萄糖苷酶可耐受较高浓度的葡萄糖，其K_i达到1M以上，具有 抗产物葡萄糖抑制的优点。但是，已知β-葡萄糖苷酶普遍存在有机溶剂不耐受的弱点，有机 溶剂通过破坏酶分子的构象，降低构象柔性，夺取活性中心的必需水等作用而导致酶失活。 因此，通过基因工程手段，改造葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶蛋白，提高其有机溶剂耐受浓度， 可扩大其应用范围，并可用于改进已有大豆异黄酮苷元制备工艺，对于节约生产成本、实现 产品的高效环保生产具有重要意义。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种运用定点突变的方法获得的选择性突变的β-葡萄糖苷酶 突变体。

本发明的第二个目的在于提供一种编码如上述的β-葡萄糖苷酶突变体的DNA序列及其 突变质粒。

本发明的第三个目的在于提供一种转化有上述重组表达质粒的β-葡萄糖苷酶生产菌株。

本发明的第四个目的在于提供一种利用上述β-葡萄糖苷酶生产菌株生产的β-葡萄糖苷酶 的突变体。

本发明的β-葡萄糖苷酶突变体，氨基酸序列如下项所述：

SEQ ID No.1所示的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第24位的丙氨酸突变为丝氨酸，且第 297位的苯丙氨酸突变为酪氨酸。

本发明的一种β-葡萄糖苷酶突变体，所述突变体的氨基酸序列还可以包括序列中的无义 突变或同义突变的组合。

本发明提供一种突变质粒，包含上述编码有所述β-葡萄糖苷酶突变体的DNA序列。

本发明还提供一种具有β-葡萄糖苷酶合成性能的工程菌，所述工程菌含有上面所述的突 变质粒，所述β-葡萄糖苷酶突变体由工程菌发酵获得。

下面介绍下本发明β-葡萄糖苷酶突变体的获得方法：

首先以来自多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的β-葡萄糖苷酶结构为模板，利用 Swiss-Model建模海洋未培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶(Bgl1A)。基于加强酶分子内氢键 作用力的考量，选择底物通道附近的氨基酸残基作为候选位点，将其突变为侧链含氢键供体 或受体的氨基酸。

根据海洋未培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶(Bgl1A)的基因序列，设计并合成突变引 物，再以包含海洋未培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒为模板，以上述的合成 突变引物为引物，基于PCR的方法进行定点突变，从而获得乙醇耐受性提高的β-葡萄糖苷酶 的突变基因。

将突变DNA与pMD18-T质粒连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆， 对突变基因进行DNA序列测定。挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有突变β-葡萄糖苷 酶基因的pMD18-T重组质粒，用Nde I和Xho I双酶切pMD18-T重组质粒和表达质粒载体， 然后用T4DNA连接酶连接酶切后的突变基因与表达质粒载体连接，得到连接产物；连接产 物转化宿主菌，筛选阳性克隆，得到含有本发明突变基因的工程菌株。

上述构建方法中所述表达质粒载体指pCold、pET15、pET22或pET28等。

上述构建方法中所述宿主菌是指E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α、E.coli JM109或E.coli  Rosetta等。

将获得的含有突变基因的工程菌进行发酵培养，并纯化获得β-葡萄糖苷酶突变酶蛋白。

对突变酶蛋白和原始野生型蛋白的乙醇耐受浓度、葡萄糖耐受浓度、最适pH、pH稳定 性、最适温度、温度稳定性，以及动力学等进行了测定和比较。

测定结果显示，35℃条件下，本发明获得的突变酶的乙醇耐受IC₅₀浓度相对野生型Bgl1A 提高了1.8倍，葡萄糖耐受浓度相对野生型Bgl1A提高了2倍。而且，突变体的温度及pH稳 定性均优于野生型。动力学结果表明突变体与底物亲合力增加，催化效率提升至野生酶的3 倍。在相同的反应条件下，突变体对大豆异黄酮糖苷转化效率达到98％以上，相比野生型 Bgl1A提高了2倍，显示出潜在的应用价值。

附图说明

图1、2、3为本发明PCR扩增产物的电泳图谱：图1中1为PCR扩增的片段A24S-S， 2为片段A24S-X，M为DNA marker；图2中1为PCR扩增的片段为F297Y-S，2为片段 F297Y-X，M为DNA marker；图3中1为A24S-S和A24S-X组合为模板PCR扩增产物，2 为F297Y-S和F297Y-X组合为模板PCR扩增产物，M为DNA marker。

图4为纯化的突变蛋白和野生型蛋白的电泳图谱：图4中1为未诱导上清，2为诱导表 达上清，3为A24S/F297Y突变蛋白，4为野生型rBgl1A，M为蛋白marker。

图5为35℃条件下突变蛋白与野生型蛋白的乙醇耐受性能比较。

图6为突变蛋白与野生型蛋白的葡萄糖耐受性能比较。

图7为突变蛋白与野生型蛋白部分酶学性质比较；

图7中A为最适pH，B为最适温度，C为pH稳定性，D为35℃条件下温度稳定性。

具体实施方式

下列实施例中的实施方法，如无特别说明，均为常规方法。

(一)、含有本发明β-葡萄糖苷酶突变基因的表达菌株的构建

1、β-葡萄糖苷酶基因突变位点的选择

基于序列比对，Bgl1A与来自多粘芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa的β-葡萄糖苷酶BglB (PDB code:2O9R)最为相似，氨基酸序列一致性为43％。以BglB的结构作为模板，利用 Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/；Kiefer F,Arnold K,Künzli M,Bordoli L,Schwede T. The SWISS-MODEL Repository and associated resources.Nucleic Acids Research.2009,37, D387-392.)建模海洋未培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶(Bgl1A)的结构。

根据建模的结构信息，确定定点突变的位点为24位点的丙氨酸A和297位点的苯丙氨 酸F，突变方向为24位点的丙氨酸A被丝氨酸S替代，297位点的苯丙氨酸F被酪氨酸Y替 代。

2、突变引物的设计和突变基因的PCR扩增

根据海洋未培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶的基因序列：SEQ ID No:2(其氨基酸序列 如SEQ ID No:1)，以及选定的突变位点24A和297F，设计以下6个定点突变引物：

以包含海洋未培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶(Bgl1A)基因的重组质粒为模板质粒， 将上述的合成突变引物进行配对，分别为：bgl1A-F与A24S-R、A24S-F与bgl1A-R、bgl1A-F 与F297Y-R、F297Y-F与bgl1A-R，作为PCR引物对，扩增产物依次命名为A24S-S和A24S-X、 F297Y-S和F297Y-X；回收4条扩增片段，将A24S-S和A24S-X加入同一反应体系中，F297Y-S 和F297Y-X加入另一反应体系中，作为各自反应体系中的PCR反应模板，并利用bgl1A-F、 bgl1A-R引物对作为扩增引物，扩增bgl1A突变基因全长序列并回收备用。

3、表达载体的构建

将步骤2中得到PCR扩增产物，与pMD18-T质粒连接(TaKaRa)，建立如下酶切体系： 25ng pMD18-T载体，50ng PCR扩增产物，5μL ligation mix，补水至10μL，16℃连接1h。连 接产物热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到的转化子测序验证是否突变；挑选序列正 确的克隆提取质粒，获得含有本发明β-葡萄糖苷酶突变基因的pMD18-T重组质粒；用NdeI 和XhoI双酶切所得的pMD18-T重组质粒和pET22b(+)载体，然后用T4DNA连接酶将酶切 后的突变基因与表达质粒载体连接，建立如下酶切体系：25ng pET22b(+)载体，50ng突变基 因酶切片段，3μL 10×ligation buffer，1μL T4DNA连接酶(TaKaRa)，补水至30μL，16℃连 接8h，得到连接产物；连接产物转化宿主菌，得到的转化子测序验证是否突变，挑选序列正 确的转化子得到含有本发明突变基因的工程菌株Escherichia coli  BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl1A(A24S/F297Y)。

本发明的菌株Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl1A(A24S/F297Y)已送往中国典 型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)保藏。保藏编号为 CCTCC NO：M2015090，保藏时间为2015年3月6日，保藏单位地址：中国武汉大学中国 典型培养物保藏中心。

(二)、含本发明β-葡萄糖苷酶突变基因工程菌的表达与蛋白纯化

将(一)中获得的基因的工程菌株Escherichia coli  BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl1A(A24S/F297Y)接种于含有氨苄青霉素的200ml LB液体培养基 中，放置于37℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.6(UNICO UV2102紫外可见分光光度计， 以培养LB培养基为空白)；加入终浓度为0.75mM的IPTG进行诱导，并于30℃、180rpm条 件下继续培养5小时；4℃、8000g离心收集菌体，加入0.1倍菌液体积的Binding buffer，350W 冰浴条件下超声40min破碎细胞，30000g离心收集上清，得到粗酶液。全菌蛋白SDS-PAGE 显示蛋白表达量占全菌蛋白的30％以上。

粗酶液经过Ni-NTA柱层析进行纯化。洗脱液中咪唑浓度为60mM，洗脱10个柱体积。 得到的蛋白经过检测达到SDS-PAGE纯度。

以pNPG为底物，纯化的β-葡萄糖苷酶突变蛋白的最适pH为6.5，酶在pH5.5-7.5范围 内能够显示70％以上的酶活力。酶在pH6.5-7.5范围内有较高的稳定性，30℃条件下保温3h 仍然能够维持原酶活力的60％以上。突变蛋白在15℃-55℃范围内均能显示催化活性，其最 适温度为45℃。35℃反应条件下，相对野生型β-葡萄糖苷酶蛋白，获得的突变蛋白的乙醇耐 受IC₅₀提高1.8倍，葡萄糖耐受浓度提高了2倍。动力学分析表明，突变体的底物亲和力较 野生型得以提升，催化效率为野生型酶的3倍。