一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法，该方法包括：（1）用胰蛋白酶消化法消化鸭胚肝脏，培养该消化液，得到原代培养的鸭胚肝细胞；（2）采用脂质体转染法，将编码hTERT和Marker基因的真核表达质粒导入该原代培养的鸭胚肝细胞；（3）培养该转染的鸭胚肝细胞，用G418筛选该hTERT阳性克隆；（4）培养筛选的该hTERT阳性克隆，连续培养超过50代次，得到永生化的细胞系。该细胞系在体外传代50代以上仍有较好的活力，保持分裂增殖，不发生衰老和凋亡，是一种永生化的细胞系。该永生化的鸭胚肝细胞形态规则，培养条件简单、容易控制，使用方便，为研究鸭病，特别是研究鸭肝炎病毒提供了很好的载体。

说明书

技术领域

本发明涉及一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法和应用。

背景技术

鸭肝脏是鸭子的主要消化器官，鸭肝细胞是鸭肝脏的主要功能细 胞，许多鸭病原都能引起鸭肝细胞产生病变，所以建立鸭胚肝细胞系能 为研究鸭病提供一种载体，在细胞水平研究鸭病。

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种传播迅速和高度致 死性传染病，鸭病毒性肝炎卵黄抗体可以有效预防和治疗此疾病，目前 国内是用鸭胚繁殖鸭病毒性肝炎病毒，然后制成抗原，免疫产蛋鸭，用 鸭胚繁殖鸭病毒性肝炎病毒成本高，操作过程繁琐。

目前测定鸭病毒性肝炎卵黄抗体采用的方法是中和试验，即将卵黄 抗体倍比稀释后，用标准抗原中和，然后接种鸭（鸡）胚，计算半数致 死量（LD₅₀），该方法存在成本高，误差较大等弊端，不能准确测定鸭 病毒性肝炎抗体的水平。所以有人尝试将利用原代鸭肝细胞建立中和试 验的方法，如《鸭胚肝细胞培养的研究》（甘肃农业大学学报，1994年 02期）、《鸭肝细胞原代培养方法的建立》（天津医科大学学报，1996 年02期）公开了鸭胚肝细胞的分离培养方法。但是原代鸭胚肝细胞的 分离培养每次必须用到鸭胚，制作程序繁琐，成本高，容易污染，细胞 状态不容易控制。此外，且含有杂细胞，批次之间差异大，细胞病变不 明显，所以该方法难以推广。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明采用基因重组技术，将端粒酶逆转 录酶基因（hTERT）转染原代鸭胚肝细胞，首次建立制备永生化的鸭胚 肝细胞系的方法，制备出永生化的鸭胚肝细胞，且鸭病毒性肝炎病毒可 以在细胞上繁殖，有明显病变，用来繁殖的病毒效价高于鸭胚繁殖病毒 效价，使用方便，可以用来生产鸭病毒性肝炎抗原。

本发明的主要目的在于提供一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方 法，所述方法包括：（1）用胰蛋白酶消化法消化鸭胚肝脏，培养所述 消化液，得到原代培养的鸭胚肝细胞；（2）采用脂质体转染法，将编 码hTERT和Marker基因的真核表达质粒导入所述原代培养的鸭胚肝细 胞；（3）培养所述转染的鸭胚肝细胞，用G418筛选所述hTERT阳性 克隆；（4）培养筛选的所述hTERT阳性克隆，连续培养超过50代次， 得到永生化的细胞系。

优选地，所述Marker基因为neo基因。

具体地，所述方法包括：①用胰蛋白酶消化法消化鸭胚肝脏，M199 培养基培养48小时后，细胞长满单层，建立鸭胚肝细胞原代培养的方 法；

②采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒 pCI-neo-hTERT导入原代培养的鸭胚肝细胞；

③细胞转染pCI-neo-hTERT真核表达质粒48小时，细胞贴壁且状 态良好，加450μg/ml G418筛选，第4天细胞开始死亡，后每3天换一 次培养基且加入450μg/ml G418继续筛选，10天后大量细胞空泡化，第 18天，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组仍有较多细胞， 且已有G418抗性细胞开始生长，筛选4周后，G418浓度降至100μg/ml 维持筛选，待镜下可见较大阳性克隆，使用滤纸片法将阳性克隆消化后， 并将其种植于48孔板中，得到抗G418阳性细胞。

④将筛选的细胞在CO2培养箱中培养，每隔2～3天传代一次，连 续培养超过50代次，即得永生化的细胞系。

本发明的另一目的在于提供所述方法制备的一种永生化的鸭胚肝 细胞系。

永生化的鸭胚肝细胞形态规则，培养条件简单、容易控制，使用方 便，为研究鸭病，特别是研究鸭肝炎病毒提供了很好的载体。

本发明的再一目的在于提供一种制备鸭病毒性肝炎疫苗的方法，所 述方法包括：（1）培养增殖所述永生化的鸭胚肝细胞系；（2）在培养 的所述永生化的鸭胚肝细胞系中接种鸭病毒性肝炎病毒，培养增殖所述 鸭病毒性肝炎病毒；（3）收获所述培养的鸭病毒性肝炎病毒，灭活。

本发明建立的鸭胚肝细胞系接种鸭病毒性肝炎病毒能产生明显病 变，可以用来测定鸭病毒性肝炎卵黄抗体，此方法成本低，使用方便， 且准确度高，可以大规模的推广。

优选地，所述鸭病毒性肝炎病毒为DHV-1-LY株。

本发明的又一目的在于提供所述方法制备的鸭病毒性肝炎疫苗。

本发明的还一目的在于提供一种测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价的 方法，所述方法包括：

（1）将所述的鸭胚肝细胞系接种于细胞瓶中，待长满单层后，传 代于96孔板中，每孔1.5～2.0×10⁵个细胞，继续培养；

（2）将鸭病毒性肝炎病毒稀释成100TCID₅₀/1.0ml，与等量的2倍 系列稀释的被检卵黄抗体混合，反应；

（3）反应结束后，每一稀释度接种1列（8个孔）长满所述的鸭胚 肝细胞的96孔板，置于37℃CO₂培养箱中继续培养，同时设阴性和阳 性对照；

（4）接种后3～4天，记录每个稀释度出现细胞病变（CPE）的孔数， 计算所述卵黄抗体的中和效价。

优选地，步骤（2）中所述鸭病毒性肝炎病毒为DHV-1-LY株。

目前检验鸭肝炎病毒效价的方法是接种活胚或琼脂扩散法，此方法 误差较大，许多机构都在用鸭胚肝细胞研究鸭肝炎效价的测定方法，利 用建立的鸭胚肝细胞系极大的方便了鸭肝炎病毒生产、检验等研究。

本发明的目的还在于提供所述永生化的鸭胚肝细胞系在制备鸭病 毒性肝炎疫苗、测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价中的应用。

本发明提供的一种永生化的鸭胚肝细胞系，是以鸭胚肝原代细胞作 为宿主细胞，转染pCI-neo-hTERT真核表达载体，经过G418抗性筛选 得到的表达人端粒酶逆转录酶且具高滴度增殖病毒的细胞系。该细胞系 在体外传代50代以上仍有较好的活力，保持分裂增殖，不发生衰老和 凋亡，是一种永生化的细胞系。

附图说明

图1为永生化的鸭胚肝细胞系细胞生长曲线。

图2为使用RT-PCR检测转染细胞中外源性hTERT，第1、2、3泳 道分别为对转染后第30代和第65代细胞，转染前第2代细胞进行 RT-PCR测定基因组中hTERT的存在情况。

图3为转染后第30代和第65代细胞，转染前第2代细胞细胞内部 端粒酶活性的检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点 将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明 的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发 明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或 替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

以下通过对永生化的鸭胚肝细胞系的构建、细胞形态特征、标志物 的基因及病毒增殖鉴定，以及在病毒效价测定及应用来做详细说明，所 述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1鸭胚肝细胞系的构建

1.pCI-neo-hTERT真核表达系统

pCI-neo-hTERT可以通过载体连接构建或者商购，本发明具体用到 的pCI-neo-hTERT载体购自Addgene公司。

2.鸭胚肝细胞的分离与培养

无菌采取15日龄的鸭胚肝脏，剪成约1mm³的组织块，用37℃预 热的PBS溶液清洗3次，出去血污。加入适量的EDTA-胰蛋白酶溶液 （含胰酶0.05%，含EDTA0.02%，10ml/胚），37℃消化5min，弃去上 清。再次加入EDTA-胰蛋白酶溶液，加入磁力搅拌子，放于磁力搅拌器 上，120转/min，搅拌消化10min。收集上清液，2～8℃下，600g离心10min， 用含适量15%血清的M199培养基重悬，8层纱布过滤后，细胞计数， 调整为1.0～1.5×10⁶个/ml，加入25T细胞瓶中，放于CO₂培养箱中，37℃ 培养2～3天，可长成单层。

3.pCI-neo-hTERT真核表达系统的转染与筛选

转染前48小时，利用ATV溶液消化原代鸭胚肝细胞传代至第2代， 并接种到12孔板中，1.0×10⁶/孔，转染当天达到80～90%细胞汇合度。 转染前2小时，将培养基更换成无血清的M199培养基，每孔400μl。用 无血清的M199溶液将pCI-neo-hTERT质粒稀释成50μl，0.02μg/μl，轻 轻混匀，室温作用5min。将4μl的脂质体（Lipofectamine2000，invitrogen 公司）加入46μl的无血清M199培养基中，轻轻混匀，室温作用5min。 将混合的质粒与脂质体稀释液混合，轻轻摇匀，室温作用20min。

将混合的质粒脂质体溶液逐滴的加入到12孔板中，边加边轻轻混 匀，10μl/孔，留2孔做对照。置于37℃、5％CO₂培养箱中培养5～6小 时，然后更换含15%血清的M199溶液，继续培养。

转染后48小时，加入(450μg/ml)G418进行筛选4周，未转染的细 胞大量死亡，存活的细胞开始生长，4周后，将G418浓度降为100μg/ml， 当有大片阳性细胞克隆时，将单克隆细胞挑选出来传代至48孔板中， 加入含100μg/ml的培养基继续培养，每隔2～3天传代一次。培养超过 50代后，即为永生化的鸭胚肝细胞系。

4.永生化的鸭胚肝细胞系的鉴定

4.1细胞形态学特征及生长曲线的测定

鸭胚肝细胞系与原代分离的细胞相比，细胞为多边形，均匀规则的 鹅卵石铺路石状排列，细胞核明显，细胞间存在接触抑制。

将转染后的65代鸭胚肝细胞以1.0×10⁴个细胞/孔接种于24孔培养 板，3d换液1次，每天用0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，血细胞计数 板计数。每个时间点设3个平行孔，每个孔计数3次，取其平均值绘制 细胞生长曲线，如图1。图1说明该细胞第2天开始增殖，第3～5天为 对数增长期，可见该细胞系有很强的繁殖能力。

4.2RT-PCR检测转染细胞中外源性hTERT

（1）根据GenBank中发表的hTERT基因序列，设计出一对引物： 上游：5’-TATGCCGTGGTCCAGAAG-3’，下游： 5’-TATGCCGTGGTCCAGAAG-3’，扩增片段大小为416bp。

（2）细胞总RNA的提取：取转染前第2代和转染后第30代、 65代的鸭胚肝细胞，弃去培养基，PBS洗涤2～3次，加入1mL Trizol 混匀，室温静置5min进行裂解，将裂解物转移到离心管，并向离心管 中加入0.2mL氯仿，震荡，室温静置10min，4℃，10000r/min离心 15min；离心后取上层部分移入另一支离心管，加入0.2mL异丙醇，上 下颠倒，轻轻混匀，室温下静置30min，4℃，10000r/min离心15min； 弃上清，加入1mL75％乙醇振荡，7500r/min离心5min；将沉淀室温下 放置10min左右自然干燥，用30μL DEPC水重悬，即得细胞总RNA。

（3）第一链cDNA的合成：反应体系为，5×AMV buffer4.0μl，dNTP 5.0μl，随机引物1.0μl，RNA模板1.0μl，RNase Inhibitor0.5μl，反转录 酶1.0μl，42℃作用90min。

（4）PCR扩增：扩增程序为94℃5min，94℃变性30s，56℃退火 45s，72℃延伸45s，共30个循环，72℃再延伸10min，4℃保存。

（5）凝胶电泳：取得到的PCR产物10μl于0.1％的琼脂糖凝胶中 电泳，结果如图2。第1、2泳道为转染后第30代和第65代细胞，第3 泳道为转染前第2代细胞，可见转染的hTERT基因存在第30代和第65 代的细胞中，而未转染的细胞中没有hTERT基因。

4.3端粒酶活性检测

按照购买Roche公司的TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA试剂盒 中的操作说明进行。首先收集转染前第2代和转染后第30代、65代的 鸭胚肝细胞各约2.0×10⁵个细胞，用Lysis buffer在冰上裂解30min。 12000rpm/min离心20min，取上1μl裂解上清液作为端粒酶模板，按照 试剂盒的PCR扩增反应条件进行扩增，阴性对照用RNAase处理。扩 增结束后，按ELISA要求进行显色，在450nm和690nm处进行吸光度 测定，结果如图3。可见，端粒酶在转染后的第30代和第65代细胞中 有非常高的活性，而在转染前的第2代细胞中活性非常低，说明hTERT 基因在转染后第30代和第65代的细胞中高效表达，而转染前第2代细 胞hTERT基因几乎不表达。

实施例2用鸭胚肝细胞测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价

1.鸭病毒性肝炎精制卵黄抗体的制备

按照常规方法，制备鸭病毒性肝炎精制卵黄抗体，基本步骤如下：

(1)采用鸭病毒性肝炎DHAV-1型毒株接种10日龄易感鸡胚，然后 收获尿囊液，甲醛灭活并制备疫苗；

(2)使用所述制备的疫苗免疫产蛋鸡，免疫后抽样测定鸡高免蛋黄 中抗DHAV-1型抗原抗体中和效价≥1∶8192，之后收集所述鸡的高免 蛋；

(3)将所述高免蛋蛋壳消毒，收集蛋黄，所述蛋黄加入等体积蒸馏 水，搅拌混匀，低温巴氏灭活；酸化蒸馏水法提纯、辛酸法提纯；微滤， 超滤。制备三批鸭病毒性肝炎精制卵黄抗体（1301、1302、1303）

2.传统接种鸭胚测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价

将DHV-1-LY株稀释成每0.1ml含200ELD₅₀，与等量2倍系列稀 释的待检抗体混合，37℃作用1小时，期间摇晃数次。每个稀释度接种 5枚10日龄易感鸭胚，每胚0.2ml，另设病毒液与等量灭菌PBS混合的 病毒对照组和PBS空白对照组各5枚，置37℃培养168小时，记录48～ 168小时的鸭胚死亡数，判定结果。空白对照组应全部健活，病毒对照 组应全部死亡。

能使50%鸡（鸭）胚不发生死亡的最高抗体稀释倍数即为该抗体的 中和效价。

3.接种鸭胚肝细胞测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价

（1）将建立的鸭肝细胞系接种于25T细胞瓶中，待长满单层后， 传代于96孔板中，每孔1.5～2.0×10⁵个细胞，继续培养。

（2）将DHV-1-LY株稀释成100TCID₅₀/1.0ml，与等量的2倍系列 稀释的被检卵黄抗体混合，37℃反应60min。

（3）反应结束后，每一稀释度接种1列（8个孔）长满鸭肝细胞的 96孔板，置于37℃CO₂培养箱中继续培养，设阴性和阳性对照。

（4）接种后3～4天，记录每个稀释度出现细胞病变（CPE）的孔数， 按Reed Muench法计算卵黄抗体的中和效价。

4.接种鸭胚和接种鸭胚肝细胞测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价的比 较

将制备的三批鸭病毒性肝炎精制卵黄抗体（1301、1302、1303）， 参考《中国兽药典（三）》附录中和试验的方法，将中和后的鸭病毒性 肝炎精制卵黄抗体分别接种鸭胚和鸭胚肝细胞，均设3组平行对照，结 果如表1。因为建立的鸭胚肝细胞系形态和活力稳定，且对鸭病毒性肝 炎十分敏感，病变典型，所以用鸭胚肝细胞测定的卵黄抗体效价，比用 鸭胚测定的卵黄抗体效价高，并且稳定，误差小。

表1

实施例3鸭病毒性肝炎疫苗的制备

将转染的鸭胚肝细胞长满单层后，弃掉培养基，接种用灭菌PBS溶 液作1∶100稀释的DHV-1-LY株病毒液，37℃吸附1h后，弃掉病毒液， 加入10%的M199培养基，放入CO₂培养箱中，37℃继续培养，同时设 对照组。接毒后每天观察细胞病变，与对照组相比，接毒后24小时， 细胞出现CPE，72h病变明显，病变细胞出现空泡，有拉网现象，部分 细胞裂解。收毒，测毒价。

将鸭肝炎病毒DHV-1-LY株毒种用灭菌PBS溶液作1∶100稀释， 经尿囊腔接种10～12日龄易感鸭胚，每胚0.2ml。置37℃继续孵育，弃 去48小时内的死胚，收获48～96小时死亡鸭胚，置2～8℃冷却12～ 24小时。将检验无菌的鸭胚液混合后，定量分装，冷冻保存，测毒价。

结果传统接种鸭胚制备的病毒液病毒滴度为10^5.21TCID₅₀/ml，而接 种鸭胚肝细胞的病毒滴度为10^6.43TCID₅₀/ml，可见鸭病毒性肝炎I型病 毒DHV-1-LY可以在鸭胚肝细胞上大量增殖，且优于传统接种鸭胚的方 法。

将上述两种方法制备的病毒液分别以0.2%甲醛溶液灭活后，与矿物 油佐剂乳化配制鸭肝炎I型病毒灭活疫苗。使用雏鸭测定，疫苗最小免 疫剂量为0.15ml，确定使用剂量为0.3ml/羽。单剂量、单剂量重复和超 剂量安全试验结果为：细胞制备的疫苗不引起雏鸭的全身不良反应和明 显的局部反应，且能诱导产生90%以上保护；鸭胚制备的疫苗1/10-2/10 不同程度的局部反应，注射部位易形成肿块，能诱导产生90%以上保护。 两种疫苗分别一次免疫3日龄雏鸭后，不同时间诱导产生的HI抗体滴 度（GMT）分别是：细胞苗7天为1:256，14天为1:1024，21天为1:1151； 鸭胚苗7天为1:227，14天为1:896，21天为1:1024；抗体水平均较高， 免后14天使用强毒株LY株攻毒，均可提供≥90%的保护。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。