抗氧化剂在用于血液样品中靶分子检测的方法和装置中的用途

摘要

本发明涉及用于在血液中至少一种靶分子的检测的方法，其包括至少以下步骤：（a）提供血液样品；（b1）使所述样品与抗氧化剂接触并且将所述样品施加到过滤器以将血细胞从所述样品分离；和/或（b2）将所述样品施加到过滤器以从所述样品分离血细胞，其中所述过滤器包含抗氧化剂；（c）在所述药筒中将所述样品与第一结合分子接触，其中所述第一结合分子连接于磁性颗粒，并且其中所述第一种结合分子能够特异地结合于所述至少一种靶分子；（d）使所述样品与第二结合分子接触，其中所述第二结合分子连接于传感器表面，并且其中所述第二结合分子能够特异地结合于所述至少一种靶分子；并且（e）检测所述传感器上的磁性颗粒。本发明同样涉及抗氧化剂在血液样品中至少一种靶分子的检测方法中的用途以及用于插入测定装置用于血液样品中至少一种靶分子的检测的药筒。

说明书

发明领域

本发明涉及用于在血液样品中检测至少一种靶分子的方法。本发明同样涉及抗氧化剂在血液样品中至少一种靶分子的检测的方法中的用途以及用于插入测定装置用于血液样品中至少一种靶分子的检测的药筒（cartridge）。

发明背景

体外诊断由于对更有效果和更有效率的医疗保健的增加的需求而显得日益重要。在一方面，这样的诊断检验在中央化实验室执行，集中了由专业技术人员操作的很多种仪器，而在另一方面，这样的诊断检验在实验室环境之外的即时检验场景（point-of-care setting）执行，例如在手术室中、在医生办公室、在医院病床边、在救护车中或在患者家中。即时检验，除了快速以外，还需要是敏感的，因为对某一疾病的生物标记物检验需要在皮摩尔浓度的范围内完成检测。已经证明在夹心免疫测定（sandwich immunoassay）中使用磁性颗粒作为标签适合此目的。

为了在实验室环境外检验，检验的简洁和强劲与高易用性搭配是进一步必要的。因此，对提供具有尽可能少的用户辅助步骤（user-aided step）的即时检验场景存在强烈的需求。

发明目标和概述

本发明解决了这些需求并且提供了用于在血液样品中至少一种靶分子的快速和易用的检测的方式和方法。

上述目标具体通过包括至少以下步骤的用于在血液样品中检测至少一种靶分子的检测的方法实现：（a）提供血液样品；（b1）将所述样品与抗氧化剂接触并且将所述样品施加到过滤器以从所述样品分离血细胞；和/或（b2）将所述样品施加到过滤器以从所述样品分离血细胞，其中所述过滤器包含抗氧化剂；（c）检测靶分子。在一个实施方案中，靶分子的检测包括步骤（c1）在药筒腔内将所述样品与第一结合分子接触，其中所述第一结合分子连接于磁性颗粒，并且其中所述第一结合分子能够特异地结合于所述至少一种靶分子；（c2）将所述样品与第二结合分子接触，其中所述第二结合分子连接于传感器表面，并且其中所述第二结合分子能够特异地结合于所述至少一种靶分子；并且（c3）在传感器表面上检测磁性颗粒。

一个优势是在血液样品中靶分子的所述检测可以不进行离心步骤执行。样品通过过滤方式将血细胞从血液样品移除。可插入手持测定装置的一次性药筒，从而可以装备有专用过滤器，使得使用者只需要将血液样品添加至药筒中，所述药筒中已经存在全部所述检验所需的预处理和试剂。

然而，已经观察到对靶分子诸如甲状旁腺激素（PTH），血液样品的过滤可以导致相比于通过离心获得的血浆减少的测定应答。已经发现向样品添加抗氧化剂增加了对过滤的血液样品的测定应答。特别地，本申请的实例证明了抗氧化剂的添加导致从血液和血浆中获得的检验结果约为1的相关性。这意味着通过过滤移除血细胞得到的血液与通过离心得到的血浆的测定应答是相同的。

不希望受到理论的限制，对于观察到的过滤的血液样品的测定性能降低的一种可能的解释是靶分子与过滤器和/或在过滤期间浓缩的血细胞接触后，靶分子变得被氧化并且导致更难检测，例如，不再被结合分子识别。这样，靶分子不被在样品容器中发生的测定所识别。将氧化剂添加至血液样品针对氧化作用保护了靶分子。

在本发明优选的实施方案中同时执行如上文描述的方法中的步骤（c1）和（c2）。

在进一步的方面中本发明涉及抗氧化剂在血液样品中的至少一种靶分子的检验方法中的用途，其涉及连接于磁性颗粒的第一结合分子和连接于传感器表面的第二结合分子，其中所述第一结合分子和所述第二结合分子能够特异地结合于所述至少一种靶分子。

在还另一个方面中，本发明涉及用于插入测定装置用于在血液样品中至少一种靶分子的检测的药筒，其包括：（i）抗氧化剂和（ii）用于移除血细胞的过滤器。在一个实施方案中，所述药筒可以进一步包括（iii）连接于磁性颗粒的第一结合分子；和（iv）连接于传感器表面的第二结合分子，其中所述第一结合分子和所述第二结合分子能够特异地结合于所述至少一种靶分子。

在本发明另一个优选的实施方案中，将所述抗氧化剂并入如上文所述药筒的过滤器中。

在本发明的进一步优选的实施方案中，如上文所述药筒进一步包括还原剂。

在本发明的还另一个优选的实施方案中，如上文所述药筒用于手持测定装置中。

在本发明上文提及的方法、用途或药筒的优选的实施方案中，所述一种靶分子是甲状旁腺激素。

在本发明上文提及的方法、用途或药筒的另一个优选的实施方案中，所述抗氧化剂是酚类抗氧化剂。

在本发明上文提及的方法、用途或药筒的还另一个优选的实施方案中，所述抗氧化剂选自抗坏血酸、焦亚硫酸钠、柠檬酸钠、Trolox?、5-溴基-5-硝基-1,3-二噁烷、乙氧基苯酚、苯基水杨酸、维生素A、维生素E、BSA、褪黑素、α-胡萝卜素、β-胡罗卜素、Aspirin?、Topanol? OC、Irganox? 1076、Ionox? 220、Ethanox? 330、Cyanox? 2246和Irganox? 1010。

在本发明上文提及的方法、用途或药筒的进一步优选的实施方案中，所述第一结合分子是抗体或其片段。

在本发明上文提及的方法、用途或药筒的还另一个优选的实施方案中，所述第二结合分子是抗体或其片段。

在本发明上文提及的方法、用途或药筒的进一步优选的实施方案中，所述磁性颗粒具有10至1000 nm的大小。

在本发明在上文提及的方法、用途或药筒的另一个优选的实施方案中，所述磁性颗粒是超顺磁性颗粒。

在本发明在上文提及的方法、用途或药筒的还另一个优选的实施方案中，所述检测使用受抑全内反射（frustrated total internal reflection）实施。

附图简述

图1显示了合适用于在血液样品中检测至少一种靶分子的示例性光磁装置的示意图（侧视图）。这样的装置典型地包括发射输入光束的光源（LED）、用于检测和测量输出光束的光检测器（光电探测器）和连接其上的评价单元。发射输入光束进入包括由玻璃或透明塑料制成的传感器表面的样品容器中（其典型地位于药筒中）。进一步地，所述样品容器包括用于检验的流体样品和磁性颗粒，例如，超顺磁珠，其使用结合分子功能化，用于靶分子的检测并且其可以通过上部（洗涤磁体（washing magnet））或下部磁体（结合磁体（binding magnet））进行磁驱动。在传感器表面存在的磁珠“阻止了”光束的全内反射，导致反射光对位于样品容器传感器表面上或邻近的磁性颗粒数量成比例的减少。

图2显示了由如在实施例1中描述的实验导致的信号变化（%）。抗氧化剂焦亚硫酸钠的添加导致了对过滤的血液样品测定应答的显著增加，导致了约为1的血液-血浆相关性。参照样品显示在没有抗氧化剂的情况下血液-血浆相关性只有约0.5。

图3显示了由如在实施例2中描述的实验导致的信号变化（%）。抗氧化剂抗坏血酸的添加导致了对过滤的血液样品测定应答的显著增加，导致了约为1的血液-血浆相关性。参照样品显示在没有抗氧化剂的情况下血液-血浆相关性只有约0.5。

实施方案详述

本发明涉及直接使用血液样品用于至少一种靶分子的检测的方法和方式。

虽然本发明将关于特定的实施方案描述，但是该描述不应解释为限制性意义。

在详述本发明示例性实施方案前，给出了对理解本发明重要的定义。

如该说明书和附加的权利要求中使用的，单数形式“一”和“一个”同样包括相应的复数，除非在上下文中有另外的明确规定。

在本发明的背景下，术语“约（about）”和“大约（approximately）”表示本领域技术人员会理解的仍保证所考虑特征的技术效果的准确性的区间。所述术语典型地指±20 %、优选地 ±15 %、更优选地±10 %和甚至更优选地±5 %指示数值的偏差。

应当理解术语“包括（comprising）”是非限制性的。对于本发明的目的，将术语“由…组成（consisting of）”认为是术语“包含（comprising of）”的优选的实施方案。如果下文中将组定义为包括至少某一数量的实施方案，这意味着还涵盖优选地只由这些实施方案组成的组。

此外，在说明书和权利要求中的术语“第一”、“第二”、“第三”或“（a）”、“（b）”、“（c）”、“（d）”或“（i）”、“（ii）”、“（iii）”、“（iv）”等，是用于在相似的元素之间进行区分，并且不是必需描述先后和时间顺序。应当理解所述术语的使用在合适的环境下可以互换，并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或说明的顺序操作。

在术语“第一”、“第二”、“第三”或“（a）”、“（b）”、“（c）”、“（d）”或“（i）”、“（ii）”、“（iii）”、“（iv）”等涉及方法或用途或实验的情况下，步骤间没有时间或时间间隔一致性，即所述步骤可以同时实施或在这样的步骤之间可以有秒、分钟、小时、天、周、月或甚至年的时间间隔，除非在本申请中如本文上下文所述另有说明。

应当理解本发明不限于本文描述的特定的方法学、方案、试剂等，因为这些可以变化。同样应当理解的是本文使用的术语只是用于描述特定实施方案的目的，并且没有限制本发明范围的意图，其将只能通过附加的权利要求进行限制。除非另有定义，在此使用的全部技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义。

理想地，对于在实验室环境外的检验，使用者只需将样品添加至一次性药筒中并且全部所述检验需要的预处理和试剂已经存在于药筒中。因此，为了能够执行简单、可靠的基于血液的即时检验，所述血细胞需要在没有离心步骤的情况下分离。为了该目的，所述药筒装备了专用的过滤器。对这样的即时检验场景的要求是血液-血浆相关性约为1。这意味着通过借助于过滤的方法将血细胞移除获得的血液与通过离心获得的血浆的测定应答是相同的。

然而，发明人发现对于甲状旁腺激素的检测，血液和血浆之间的相关性约为0.5，其对于定量的、基于血液的应用是不足的。发明人发现添加抗氧化剂导致在对血液的测定信号的大大加强，导致对血液和血浆相似的测定性能并且由此导致血液-血浆相关性约为1。

如已经在上文陈述，本发明在一个方面关注包括至少以下步骤的用于在血液中检测至少一种靶分子的方法：（a）提供血液样品；（b1）将所述样品与抗氧化剂接触并且将所述样品施加到过滤器以从所述样品分离血细胞；和/或（b2）将所述样品施加到过滤器以从所述样品分离血细胞，其中所述过滤器包含抗氧化剂；（c）检测靶分子。检测可以通过不同的方法进行。例如，检测可以通过直接测定、竞争性测定、夹心测定等实现，其全部可以使用不同的结合分子。例如，诸如标记抗体或标记配体的结合分子，其对所述靶分子是特异的，可以用于直接地检测所述靶分子。标记可以是例如荧光标记、放射性标记、用于发光检测的化学标记、亲和标签标记等。在另一个方法中，所述靶分子可以与未标记的结合分子诸如抗体或配体接触。在所述靶分子和所述未标记结合分子之间建立的相互作用可以在随后通过与例如已知与所述靶分子和所述未标记结合分子的相互作用竞争的标记化合物竞争检测。这样的标记化合物可以是标记抗体、配体、小分子等，其全部以比未标记结合分子更高的亲和力结合至靶分子。所述标记物可以与上文描述的相同。在进一步的实施方案中，使用识别所述靶分子不同位点的两种结合分子的夹心测定可以用于测定所述靶分子。可以利用这样的使用例如两种不同抗体的夹心测定通过例如磁珠来促进检测。在一个实施方案中，靶分子的检测因此包括至少以下步骤（c1）将第一结合分子与所述样品接触，其中所述第一结合分子连接于磁性颗粒，并且所述第一结合分子能够特异地结合至所述至少一种靶分子；（c2）将第二结合分子与所述样品接触，其中所述第二结合分子连接于检测表面，并且其中所述第二结合分子能够特异地结合于所述至少一种靶分子；和（c3）在传感器表面检测所述磁性颗粒。

如本文使用的“靶分子”可以是可以被结合分子结合的任何分子并且可以是例如生物物质，诸如生物分子、复合体、细胞片段或细胞。优选地，本发明背景下的靶分子是核酸，例如DNA或RNA分子或寡核苷酸，诸如DNA或RNA寡核苷酸。甚至更优选的是诸如肽、蛋白质、药物分子、小分子或维生素的靶分子。在本发明特定的优选的实施方案中“靶分子”可以是生物标记物。

在本文中使用的术语“生物标记物”可以定义为作为指示物客观地测量和评估正常生物过程、致病过程或对治疗性干预的药物应答的表征。通过本发明设想的生物标记物分子可以是本领域已知的任何生物标记物，诸如疾病相关生物标记物或药物相关生物标记物。疾病相关生物标记物提供了对患者的治疗的可能效果（风险指示物或预测生物标记物）、是否疾病已经存在（诊断生物标记物）、或在个体病例中不管治疗的类型这样的疾病可以如何发展（预后生物标记物）的指示。预测生物标记物通常帮助评估对特定治疗最可能的应答，而预后标记物用于监视治疗或不治疗的疾病的进程。与之相比，药物相关生物标记物指示了药物是否将在特定患者中有效和患者身体将如何处理它。本领域技术人员会意识到在多种和高度特定的医学领域中使用的大量新型生物标记物。

在本发明另一个优选的实施方案中，所述生物标记物选自核酸、蛋白质和代谢物。生物标记物可以因此指的是在血液样品中测量的分子，优选地蛋白质，其浓度反应了一些疾病状态的严重性和存在。因此，生物标记物可以用作生物的特定疾病阶段或生理状态的指示物。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述靶分子是激素。激素优选的实例是褪黑素、血清素、甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、缪氏管抑制激素（antimullerian hormone）、促肾上腺皮质激素、脂联素、血管紧张肽、血管紧张肽原、抗利尿激素、心房钠尿肽、降钙素、缩胆囊素、促肾上腺皮质激素释放激素、红细胞生成素、卵泡刺激素、胃泌素、胃饥饿素、胰高血糖素、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素、人体绒毛膜促性腺激素、生长激素、人胎盘催乳素、抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子、瘦素、促黄体激素、促黑素细胞激素、食欲肽、催产素、甲状旁腺激素、促乳素、松弛素、分泌素、生长激素抑制素、促甲状腺激素、促甲状腺素释放激素、皮质醇、醛固酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、双氢睾酮、雌二醇、雌激素酮、雌三醇、黄体酮、骨化三醇、骨化二醇、前列腺素、白细胞三烯、环前列腺素、凝血噁烷、催乳素释放激素、促脂素、脑钠肽、神经肽Y、组胺、内皮素、胰多肽、凝乳酶和脑啡肽。原则上，如本文描述的方法、用途和药筒适合用于检测易受氧化影响的靶分子。甲状旁腺激素可以优选的作为靶分子。

在本发明特定的优选的实施方案中，经历本发明的检测方法或用途或使用如本文描述的药筒的帮助检测的所述靶分子是甲状旁腺激素。

如本文使用的“血液样品”指的是包括如本文定义的靶分子的血液样品。这样的血液样品可以，例如，包括从个体或患者获得的样品。所述血液样品可以是全血，所述全血样品可以是未处理或处理的，例如，可以含有抗凝血剂。通过血液样品离心获得的血浆不能理解为血液样品。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述血液样品取自个体，其中所述血液样品是未处理的全血样品。

在一些实施方案中，诸如生物标记物的靶分子从血液样品中直接获得。在其它情况中样品可以首先经历样品制备技术，例如，基于标准方案，包括例如，部分纯化，其使得所述靶分子更容易接近结合配偶体，即，本文定义的第一和第二结合分子。在另一个优选的实施方案中将使得所述靶分子更容易接近结合配偶体或是测定应答的定量所需要的添加剂添加至血液样品。

如本文使用的术语“提供血液样品”意为血液样品在人或动物体外提供。

如本文使用的“抗氧化剂”指的是能够减缓或防止其它分子氧化的分子。在本发明优选的实施方案中所述抗氧化剂是酚类抗氧化剂。酚类抗氧化剂的实例是Topanol? OC、Irganox? 1076、Ionox? 220、Ethanox? 330、 Cyanox? 2246、Irganox? 1010。在本发明另一个优选的实施方案中所述抗氧化剂是抗坏血酸、焦亚硫酸钠、Trolox?、5-溴基-5-硝基-1,3-二噁烷、乙氧基苯酚、苯基水杨酸、维生素A、维生素E、BSA、褪黑素、α-胡萝卜素、β-胡罗卜素、Aspirin?、Topanol? OC、Irganox? 1076、Ionox? 220、Ethanox? 330、Cyanox? 2246或Irganox? 1010。本发明同样设想了进一步的抗氧化剂，其将是本领域技术人员已知的或可以衍生自合适的文献资源。本发明同样设想了还未知的或本领域技术人员在将来会知晓的抗氧化剂。

如在本文中使用的“过滤器”指的是能够从所述血液样品中分离血细胞的过滤器。典型地这样的过滤器显示了在过滤器中血细胞的良好分离、低溶血、所述靶分子无保留和所述靶分子无修饰。在优选的实施方案中所述过滤器是来自PALL的Vivid ? Plasma Separation GF Membrane。所述过滤器可以是处理的或未处理的。在优选的实施方案中所述过滤器使用过滤器处理缓冲液处理。用于处理的合适的缓冲液是本领域技术人员已知的并且包括糖、盐、缓冲剂、蛋白质和表面活性剂。在特定地优选的实施方案中所述处理缓冲液在另一个优选的实施方案中所述过滤器可以进一步包括用于改善测定性能的试剂。

在本发明优选的实施方案中在将所述血液样品施加到过滤器前将所述抗氧化剂与所述血液样品接触。在可选的实施方案中所述过滤器可以已经包括所述抗氧化剂。在样品中的所述抗氧化剂的终浓度可以在如下范围内，所述范围导致对目标靶分子的血液-血浆回收率为1 ±20 %、优选地±15 %、更优选地±10 %和甚至更优选地±5 %。

在本文中使用的术语“血液-血浆回收率”指的是描述一方面来自血液另一方面来自血浆的两种测定应答之间关系程度的单一数字。如本文使用的术语“血浆”指的是通过血液样品离心获得的血浆样品。如本文使用的术语“血液”指的是在所述血液样品已经施加到过滤器以分离血细胞后获得的血液样品的液体部分。所述血液-血浆回收率通过来自血液的定量测定应答除以来自血浆的定量测定应答进行确定。示例性地，定量测定应答可以是在来自传感器邻近或表面的磁性颗粒的位置的光信号的变化或可以是所述靶分子的计算的浓度。如果两个测定应答在相同范围内，所述血液-血浆回收率约为1。如果来自血浆的测定应答是来自血液的测定应答的两倍，则所述血液-血浆回收率约为0.5。所述靶分子可以优选的是激素，诸如甲状旁腺激素。

在优选的实施方案中，在血液样品中的抗氧化剂的终浓度约为0.01 M至约 5 M、优选地在约 0.05 M至约 2 M的范围内，例如浓度为约 0.05 M、约 0.1 M、约 0.2 M、约 0.3 M、约 0.4 M、约 0.5 M、约 0.7 M、约 1.0 M、约 1.2 M、约 1.5 M、约 1.7 M或约 2.0 M。在特定的优选的实施方案中所述抗氧化剂在样品中的浓度为0.12M。

在优选的实施方案中在将所述样品施加到所述药筒之前，示例性地在专用的血液试管或移液管中将所述抗氧化剂与所述血液样品接触。

在另一个优选的实施方案中所述抗氧化剂整合于所述药筒中。

在本发明特定的实施方案中可以通过添加所述抗氧化剂至过滤器处理缓冲液将所述抗氧化剂并入过滤器中。

在进一步优选的实施方案中可以通过将过滤器在非氧化环境（例如，在N₂流下）下处理将所述抗氧化剂并入过滤器中。

在另一个优选地实施方案中将所述抗氧化剂添以干燥形式添加至过滤器。

在本发明还另一个实施方案中将所述抗氧化剂添加至所述药筒中的另一位置。示例性地，可以将所述抗氧化剂添加至珠干燥缓冲液（bead drying buffer）。

在本发明特定的实施方案中所述抗坏血酸和所述血液样品的接触导致1 ±20 %、优选地 ±15 %、更优选地±10 %和甚至更优选地 ±5 %的血液-血浆回收率。

在本发明另一个特定的实施方案中所述抗氧化剂是焦亚硫酸钠或抗坏血酸。

在本发明另一个优选的实施方案中将焦亚硫酸钠以0.12 M的终浓度添加至血液样品中。

在本发明还另一个实施方案中将抗坏血酸以0.12 M的终浓度添加至血液样品中。

如本文使用的“还原剂”指的是能够还原其它分子的分子。例如，可以通过还原剂使氧化的靶分子还原。在本发明优选的实施方案中所述还原剂是焦亚硫酸钠、抗坏血酸和L-半胱氨酸。本发明同样设想了进一步的还原剂，其将是本领域技术人员已知的或可以衍生自合适的文献资源。本发明同样设想了还未知或本领域技术人员将来可以知晓的还原剂。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明的所述药筒进一步包括还原剂。

在本发明的优选的实施方案中，所述还原剂并入所述药筒的任何部分中，例如，所述还原剂结合在所述过滤器中。

如本文使用的“磁性颗粒”意指可以赋予其诸如体积或质量的物理特性的小的、局部的对象。术语“磁性颗粒”应当包括永久磁性颗粒和可磁化粒子。此外，颗粒在其运输和特性中基本上表现为整体单位。磁性颗粒可以相应地为对称的、球形的、基本球形的或球状的，或不规则的、非对称的形状或形式。

由本发明设想的磁性颗粒大小典型地在3 nm和50 μm范围之间。优选的是在纳米和微米直到数微米的磁性颗粒。甚至更优选的是大小在10至1000 nm的颗粒。特别地优选的是磁纳米颗粒，例如具有直径约10至700 纳米的颗粒。特别地优选的是可以具有直径约10 至 600 nm，例如10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm、90 nm、100 nm、120 nm、150 nm、170 nm、200 nm、220 nm、250 nm、270 nm、300 nm、320 nm、350 nm、370 nm、400 nm、420 nm、450 nm、470 nm、500 nm、520 nm、550 nm、570 nm、600 nm、620 nm或在此之间的任何值的纳米颗粒。甚至更优选的是具有直径约500 nm的纳米颗粒。

在优选的实施方案中，所述磁性颗粒是超顺磁性颗粒。在特定的优选的实施方案中，所述磁性颗粒是超顺磁珠。

如本文使用的术语“超顺磁性”描述的是在小铁磁或铁磁纳米颗粒中表现的磁性的形式。在本领域中已知在足够小的纳米颗粒中，磁化强度可以在温度的影响下随机翻转方向。将两次翻转之间的时间称为Néel弛豫时间（Néel relaxation time）。在不存在外部磁场的情况下，当用于测量纳米颗粒的磁化强度的时间比Néel弛豫时间更长时，磁化强度表现为平均为0（即在顺磁状态中）。在这样的状态中外部磁场能够将纳米颗粒磁化为类似顺磁体。然而，其磁化率比那些顺磁体要大得多。

根据本发明的所述磁性颗粒与第一结合分子功能化，所述第一结合分子可以直接地或间接地（即通过间隔物或接头）连接至所述磁性颗粒。

如本文使用的“传感器表面”，定义了用于检测并且可以典型地位于样品容器中的区域。所述样品容器可以位于药筒中。所述传感器表面可以用于检测血液样品中的至少一种靶分子并且其典型地由玻璃或透明塑料制成。对于这样的至少一种靶分子的检测，所述传感器表面使用可以直接地或间接地（即通过间隔物或接头）连接至所述磁性颗粒的第二结合分子功能化。位于传感器表面附近或之上的磁性颗粒导致了光信号的改变。

如本文使用的，术语“光信号的改变”意为通过光学方式检测的由磁性颗粒反射的光的差异。例如，这样的方式可以包括诸如散射光检测或基于全内反射（TIR）或受抑全内反射（FTIR）检测的方法。优选地，光信号的改变指的是只有那些接近或在传感器表面的磁性颗粒。这样的测量典型地要求限制位于检测区域内的磁性颗粒的移动，即已经变得基本上固定化或已经完全失去移动性。不存在磁性颗粒时没有折射发生并且来自光源的光束是完全反射的。如果磁性颗粒接近传感器表面或与传感器表面接触，则光线将被颗粒抑制并且在这一点上的反射不再是全部的。

可以计算可定义为全内反射信号的减少的所述信号。所述信号或多或少是线性地，取决于颗粒在传感器表面上的浓度（表面密度?）。所述信号可以表达为：

S = β ?,

其中S是以百分比变化的测量信号并且β是从表面密度至信号变化的转换因子。

由本发明设想的是单一样品经历不同的同时的或适时分开的检测测定。为了该目的，所述样品容器可以包含统一功能化的磁性颗粒，即将全部磁性颗粒使用用于捕获所述靶的相同的第一结合分子包被。可选地，所述样品容器还可以包含至少两种、至少三种或数种不同功能化的颗粒。因此，所述传感器表面必需调整以实施这样的多检测平台。

如本文使用的术语“结合分子”指的是对第二分子（即相互作用配偶体）具有高结合亲和力的任何分子。在本发明意义中的结合分子典型地包含结合或捕获部分，其能够结合特定靶分子，优选地生物标记物，或能够结合含有目标实体的分子，诸如例如病毒，或细胞或细胞碎片，或源自组织的材料。

在特定地优选的实施方案中，所述结合分子选自适配体、肽、蛋白质、寡核苷酸和分子印迹聚合物，其中所述结合分子优选地为抗体或其片段。

如在结合分子背景下使用的“适配体”可以是短核酸分子，例如，RNA、DNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA分子或本领域技术人员已知的任何其它合适的核酸形式，其能够结合于如本文定义的靶分子。此外，本发明设想的肽适配体，即能够特异地结合至包含一种或多种特定氨基酸序列的一种或多种蛋白质、一种或多种多肽或一种或多种肽的适配体。典型地，一种或多种肽适配体是一种或多种可变的肽环，包含例如10至20个氨基酸。在本发明的背景下所述一种或多种肽适配体可以在特定的实施方案中连接至框架结构的一端或两端。所述框架结构可以是任何分子，优选地蛋白质，例如具有良好溶解特性的蛋白质。合适的框架结构将是本领域技术人员已知的。在本发明情况下使用的合适的框架分子的实例是细菌蛋白质硫氧还原蛋白-A。所述适配体肽环可以优选地插入所述框架分子的还原活性位点。可选地，葡萄球菌A蛋白和其结构域和这些结构域的衍生物，诸如蛋白质Z或脂质运载蛋白在本发明背景下可以用作框架结构。核酸或肽适配体可以根据本领域技术人员已知的任何合适的方法产生，例如，经由PCR或分子合成方法或酵母双杂交方法。

如在结合分子背景下使用的“肽”可以包含2至35个氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的一段序列。所述肽可以是线性的、支化的、环形的或其混合。肽结合可以同样如上文定义的连接至框架结构。

如在结合分子背景下使用的“蛋白质”可以包含多于约35个氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的一段序列。所述蛋白质可以具有线性的、支化的、环形的形式或包含这些形式的混合。蛋白质结合分子可以同样如上文定义的连接至框架结构。

如在结合分子背景下使用的“寡核苷酸”可以包含约5至120个核苷酸的一段序列，例如10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸的一段序列，优选地约15至60个核苷酸。寡核苷酸亲和分子可以优选地是RNA分子或DNA分子或两者的混合。

如本文使用的术语“分子印迹聚合物”指的是在后来提取的分子的存在下形成的聚合物，留下了互补的空腔。典型地，分子印迹聚合物显示了对原始分子的特定化学亲和性。分子印迹聚合物可以由本领域技术人员已知的任何合适的聚合单元构成。用于它们的生产的技术包括聚合技术，诸如本体聚合、沉淀聚合、乳化聚合、悬浮聚合、分散聚合、凝胶聚合和多步溶胀聚合。特别优选的是分层印迹方法。

如在结合分子背景下使用的“抗体”指的是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异地结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、亚类（例如IgG1、IgG2、IgG3、lgG4、lgA1和IgA2）或亚型。本发明的抗体可以根据它们识别的或特异结合的本发明的多肽的一个或多个表位或部分进行描述或限定。特定表位和它们与抗体的相互作用会是本领域技术人员已知的。如在本文中使用的术语“特异地结合”指的是抗体对抗原表位的免疫特异检测和结合。术语“特异地结合”排除了非特异结合但是不需要排除与其它抗原的交叉反应，特别是含有与通过本抗体检测的相同抗原表位的抗原。

抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、多特异抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体或构成Fab片段、Fab'片段、由Fab表达文库产生的片段、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、微抗体、双特异抗体、scFv、sc（Fv）2、全免疫球蛋白分子、小模块免疫药物（SMIP）、结合域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼源抗体、含V_HH的抗体、抗独特性（anti-Id）抗体、上文任何的一条或多条任何表位结合片段。最优选地，所述抗体是本发明的人抗原结合抗体片段，并且包括Fab、Fab'和F(ab’)2、Fv、单链Fvs (scFv)、sc(Fv)2、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。

根据本发明的抗体可以是任何动物来源，包括鸟类和哺乳类。优选地，抗体是人、鼠（例如小鼠和大鼠）、驴、猴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。

根据本发明的抗体可以是单特异的、双特异的、三特异的或更多的多特异的。多特异抗体可以对本发明的多肽的不同表位特异或可以对本发明的多肽以及诸如异源多肽或固体支持材料的异源表位均特异。优选的是单特异抗体。

如本文使用的“样品容器”指的是样品在其中测量的容器。如本文描述的磁性颗粒可以已经存在于样品容器中。所述样品容器进一步包括典型地由玻璃或透明塑料制成的传感器表面。所述样品容器可以进一步位于可交换的药筒中，即在从传感器装置分离的单独组件中。由于可能污染样品，这样的药筒将通常是一次性使用制品，通过例如注射模塑由塑料制成。

将生物传感器测定用于“至少一种靶分子的检测”。这样的测定可以用于快速的、灵敏的并且易用的分子诊断，特别地对生物目标的检测。这样的测定可以涉及作用在用能够在样品中识别并结合生物靶的第一结合分子功能化的磁性颗粒上的磁场力。

在这样的测定的第一阶段中，为了有效的靶分子捕获，使用第一结合分子包被的磁性颗粒移动穿过样品溶液。随后，使驱动的磁体移动并且以高速将磁性颗粒运输至传感器表面用于结合。典型地，连接至传感器表面的第二结合分子同样能够结合生物靶。其后，应用一系列经过细致调整的磁脉冲以促进已捕获靶分子的磁性颗粒最优的结合和混合。在颗粒已经结合至传感器表面后，通过施加朝向远离传感器表面的磁场将游离的和非特异的结合颗粒快速移除，本文也称作洗涤磁体。可以光学地检测结合于传感器表面的磁性颗粒的存在和/或量，其中结合的磁性颗粒的数量直接地或相反地与存在于样品中的靶分子的量相关，优选地所述光学检测是基于受抑全内反射（FTIR）。由本发明设想的优选地检测测定是基于抗体的免疫测定，诸如竞争性和非竞争性免疫测定。

术语“竞争性免疫测定”指的是其中在样品中的靶分子与标记靶分子竞争与抗体或结合分子结合的免疫测定。随后测量标记靶分子结合于抗体或结合分子的量。在该方法中，应答将对样品中的靶分子浓度成反比。这意味着应答越强，在样品中能够与标记靶分子竞争的靶分子越少。

术语“非竞争性免疫测定”同样指的是“夹心免疫测定”，指的是其中在样品中待检验的靶分子结合第一抗体或结合分子并进一步结合第二抗体或结合分子的免疫测定。使用如在本文描述的检测原理，结合于第二抗体或结合分子的磁性颗粒的量是用于确定靶分子的量的合适量度。相比于竞争性方法，非竞争性方法的结果会对靶分子浓度成正比。

在本发明另一个优选的实施方案中，所述第一结合分子是如上文定义的抗体或其片段。

在本发明进一步优选的实施方案中，第二结合分子是抗体或其片段。第二结合分子优选的实例是如上文定义的抗体或抗体片段或变体，其特异地结合靶分子，优选地是通过第一结合分子捕获的生物标记物分子。在第一结合分子是抗体的情况中，所述抗体可以结合至不同于第一结合分子的靶分子的不同表位，或者可以检测由靶分子与第一结合分子特异结合产生的表位。

在本发明另一个优选实施方案中，至少一种靶分子的检测使用夹心免疫测定执行。

在本发明还进一步优选的实施方案中，至少一种靶分子的检测使用1步夹心免疫测定执行。

如本文使用的“测定装置”典型地是光磁生物传感器设备。用于根据本发明检测方法的合适的装置此前已经公开，例如，在WO 2008/155716中。在优选的实施方案中，所述测定设备是手持测定设备。在本发明特定的优选的实施方案中，使用了Magnotech?生物传感器系统。然而应当理解本发明的基本检测原理不限制于Magnotech?系统。原则上，同样可以使用满足如图1描述的最低标准的任何其它光磁检测系统。典型地，合适的光磁系统可以包括发射输入光束的光源（LED），用于检测和测量输出光束的光检测器（光电探测器），和连接其上的评价单元。所述设备进一步包括用于导入和测量样品的药筒。所述药筒进一步包括样品容器，所述样品容器可以进一步包括可以用结合分子功能化的磁性颗粒，所述结合分子诸如抗体用于在血液样品中检测一种或多种靶分子。典型地，光磁装置包括用于珠的磁驱动的至少两个磁体。在示例性的布置中，生物传感器设备可以包括磁场发生器，其优选地包括上部磁体（洗涤磁体）和下部磁体（结合磁体）。在样品容器中的传感器表面存在磁珠可以使用这样的光磁传感器系统检测。

以下的实施例和附图以说明性目的提供。因此理解实施例和附图不解释为限制性的。本领域技术人员将清楚地能够设想本文陈述的原理的进一步修饰。

实施例

实施例1-焦亚硫酸钠对血液-血浆相关性影响的确定。

根据本发明在血液样品中靶分子的示例性检测在Magnotech?-生物传感器系统上使用基于受抑全内反射（FTIR）的检测实施。所述系统由手持分析仪器和一次性的自成一体的药筒组成。靶分子检测必需的全部测定试剂包含在药筒中。一旦应用样品液滴，样品将通过毛细作用力自动抽入药筒中。在那里，用抗体功能化的磁纳米颗粒结合于靶分子并且充当用于检测的标记。磁力用于将磁纳米颗粒运至传感器表面，所述表面同样用抗体功能化使靶分子可以结合其上。实验性设置在图1中描述。磁性颗粒的磁驱动通过两个磁体的交替作用发生，即上部磁体（洗涤磁体）和下部磁体（结合磁体）。光以比临界角稍小的角度投射至药筒的表面，导致在相机传感器上成像的反射。当纳米颗粒结合于传感器表面上时，一些光的反射和散射导致了相比不存在磁性颗粒的情况下的测量减少的强度。

超顺磁珠具有500 nm的直径并且用抗N-端PTH抗体功能化，并且传感器表面用抗C-端PTH抗体功能化。

来自健康捐献者的血液样品掺入400 pg/ml PTH并且以0.0125 M至多0.2 M的浓度（0.0125 M、0.025 M、0.05 M、0.1 M和0.2 M）添加焦亚硫酸钠。将这些样品添加至包括血液分离过滤器的药筒中。不具有焦亚硫酸钠的血液样品作为参照使用。参照进一步以两种途径处理：“血浆”通过血液样品的离心产生，以及“血液”指的是通过血液样品的过滤获得的液体部分。使用来自PALL的Vivid ? Plasma Separation GF 膜作为过滤器。在将血液样品施加到所述膜前，将膜使用缓冲液预处理。接下来，将通过离心或过滤产生的每个样品施加到上文描述的药筒并且在上文描述的手持分析仪中测量。在样品抽入至药筒后立即开始驱动并且在8分钟后在药筒表面上检测标记靶分子。由结合至传感器表面的磁性颗粒产生的信号变化与靶分子的量成正比并且用于确定血液-血浆回收率。

图2示例性地显示了以0.12M的浓度添加焦亚硫酸钠的血液样品的测量。此外，测量了没有焦亚硫酸钠的参照。对于每个样品类型（具有焦亚硫酸钠的血浆、不具有焦亚硫酸钠的血浆、具有焦亚硫酸钠的血液和不具有焦亚硫酸钠的血液），靶分子PTH的测量按照一式三份执行。血液-血浆相关性通过来自血液的平均信号变化除以来自血浆的平均信号变化进行确定。对于参照（即不具有焦亚硫酸钠的血液和血浆）相关性为约0.5。然而，当将焦亚硫酸钠添加至样品时，观察到对血液的测定信号大大加强。因此，对血液和血浆的测定性能是相似的并且可以实现约为1的相关性。

不但以0.12M的浓度，而且以0.05M和0.1M的浓度的焦亚硫酸钠的添加导致约1的血液-血浆相关性。

实施例2-抗坏血酸对血液-血浆相关性的影响的确定。

可以使用抗坏血酸替代焦亚硫酸钠实施如实施例1示例的相同测量。

图3示例性地显示了向其中添加以0.12M的浓度的抗坏血酸的血液样品的测量。此外，测量了没有抗坏血酸的参照。对于每个样品类型（具有抗坏血酸的血浆、不具有抗坏血酸的血浆、具有抗坏血酸的血液和不具有抗坏血酸的血液），靶分子PTH的测量按照一式三份执行。血液-血浆相关性按上文描述的进行确定。再一次，对于参照（即不具有抗坏血酸的血液和血浆）相关性为约0.5。当将抗坏血酸添加至样品时，观察到对血液的测定信号大大加强。因此，对血液和血浆的测定性能是相似的并且可以实现约1的相关性。

不但以0.12M的浓度，而且以0.05M和0.1M的浓度的抗环血酸的添加导致约1的血液-血浆相关性。