一种稳心颗粒中挥发性成分的检测方法

摘要

本发明提供一种稳心颗粒中挥发性成分的检测方法。本发明采用顶空固相微萃取技术，提取稳心颗粒中挥发性成分。并结合利用气相色谱-质谱联技术，共分离鉴定出挥发性成分74个。对10批稳心颗粒进行了分析，得出了主要挥发性成分的相对含量范围。本发明首次采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用法，对稳心颗粒中挥发性成分进行提取与分析，弥补了以往对稳心颗粒挥发性物质分析的不足，为该药品的质量控制提供更为全面的检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及中成药检测方法领域，尤其是涉及一种稳心颗粒中挥发性成分的 检测方法。

背景技术

稳心颗粒作为常用抗心律失常中成药，主要由党参、黄精、三七和甘松等药 材组成，具有益气养阴，定悸复脉，活血化瘀之功效。国家批准文号为： Z10950026。主治：气阴两虚兼心脉瘀阻所致的心悸不宁，气短乏力，头晕心烦， 胸闷胸痛。适用于各种原因引起的早搏、房颤、窦性心动过速等心律失常。临床 应用疗效显著。除辅料外，方中主要成分为多糖、皂苷和挥发性成分(甘松挥发 油)，2010版《中国药典》收载稳心颗粒项下，规定以党参、三七和黄精进行鉴 别，以三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁和Rb₁的总含量来进行含量测定，对主要来源于 甘松的挥发性成分的规范并未涉及。甘松在方中为“使药”，且近年来在抗心律 失常方面的临床作用和药理机制报道较多，越来越受到关注。本发明在明确甘松 在方中的“地位”、解决面临的资源紧缺问题及对稳心颗粒方进行优化精简等方 面具有十分重要的意义。

顶空固相微萃取(head space-solid phase microextraction,HS-SPME)是20世 纪90年代兴起的一项新颖的样品前处理与富集技术，是在固相萃取(solid phase  extraction，SPE)基础上发展起来的一种具有萃取速度快、操作简单、富集效率 高、所需样品少等特点的萃取分离技术。

发明内容

本发明提供一种稳心颗粒中挥发性成分的检测方法，目的在于，用于稳心颗 粒的质量评价，并且为稳心颗粒中的挥发性成分质量控制有效地途径。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种稳心颗粒中挥发性成分的检测方 法，本发明采用顶空固相微萃取技术提取稳心颗粒中的挥发性成分，并利用气相 色谱-质谱联用分析鉴定。

本发明稳心颗粒中的挥发性成分的检测方法，其中所述顶空固相微萃取技术 步骤为，取稳心颗粒、饱和氯化钠水溶液，进行搅拌，插入萃取头，萃取时间 25～35min，取出，将萃取所得的挥发性成分，注入气相色谱仪进样口，进样口温 度250℃，解吸时间4～6min，进样模式为不分流进样，并利用气相色谱-质谱联 用分析鉴定。

优选的，所述的萃取头的型号为100μm PDMS。

优选的，所述的萃取时间30min。

优选的，所述的解吸时间5min。

优选的，所述气相色谱-质谱联用分析鉴定条件为：色谱条件：HP-5MS，60m ×320μm×0.25μm；载气：He，流量0.8mL/min；汽化温度：250℃；接口温 度：280℃；色谱柱初始温度50℃，保持1min，以10℃/min升温速率升至130 ℃，保持6min，以1℃/min升温速率升至145℃，保持5min，以1℃/min升温 速率升至160℃，保持3min，以3℃/min升温速率升至220℃，保持1min；

质谱条件：电离方式：EI源，能量70eV；离子源温度：230℃；四极杆温 度：150℃；质量扫描范围：35～800amu；电子倍增器电压：1400V。

进一步地，按照上述所建立的测定方法，测定稳心颗粒中挥发性成分得到的 指纹图谱，依照该方法生成的指纹图谱中有19个共有特征指纹峰，依次得到的 保留时间为：1号峰为10.78±0.006min、2号峰为：20.42±0.007min、3号峰为： 21.03±0.007min、4号峰为21.39±0.007min、5号峰为：22.56±0.008min、6号峰 为23.36±0.009min、7号峰为：24.71±0.014min、8号峰为：25.23±0.012min、9 号峰为：26.11±0.037min、10号峰为：27.42±0.022min、11号峰为：34.80±0.014min、 12号峰为：36.09±0.018min、13号峰为：37.25±0.035min、14号峰为： 37.70±0.048min、15号峰为：40.85±0.262min、16号峰为：41.19±0.053min、17 号峰为：44.29±0.012min、18号峰为：44.64±0.014min、19号峰为：60.81±0.008min。

进一步地，按照上述所建立的测定方法，测定稳心颗粒中挥发性成分得到的 指纹图谱，依照该方法生成的指纹图谱中有19个共有特征指纹峰，其中1号峰为： Eucalyptol桉叶素，2号峰为：δ-EIemeneδ-榄香烯，3号峰为：α-Cubebeneα-荜 澄茄油烯，4号峰为：Tetracyclo[4.4.1.1(7,10).0(2,5)]dodec-3-en-11-ol，5号峰为： α-Copaeneα-胡椒烯，6号峰为：β-Patchouleneβ-广藿香烯，7号峰为：Cadinene杜 松烯，8号峰为：(+)-Calarene白菖烯，9号峰为：(-)-Aristolene马兜铃烯，10 号峰为：Caryophyllene丁香烯，11号峰为：Spathulenol匙叶桉油烯醇，12号 峰为：Globulol蓝桉醇，13号峰为：(-)-Spathulenol(-)-匙叶桉油烯醇，14号峰 为：Isoaromadendrene epoxide异香橙烯环氧化物，15号峰为：Humulene epoxide 2葎草烯环氧化物2，16号峰为：1,3a-Ethano(1H)inden-4-ol, octahydro-2,2,4,7a-tetramethyl-，17号峰为：Widdrol韦得醇，18号峰为：Patchouli  alcohol广藿香醇，19号峰为： 4-(3,3-Dimethyl-but-1-ynyl)-4-hydroxy-2,6,6-trimethylcyclohex-2-enone。

本发明采用挥发性成分的定性定量分析，经过化学工作站处理及用面积归一 化法从总离子流图中计算各组分百分含量，并对总离子流图中各色谱峰计算其 KI值，利用各色谱峰对应的质谱图进行NIST08.L标准谱库检所确定各组分。经 过多批次挥发性成分含量测定，采用优选的气相色谱-质谱联用分析条件，对随 机抽取的10批稳心颗粒进行分析，选取代表峰进行统计处理。

顶空固相微萃取(head space-solid phase microextraction,HS-SPME)具有萃 取速度快、操作简单、富集效率高的特点。

本发明技术方案采用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术 (HS-SPME-GC-MS)对稳心颗粒进行了提取与分析，共分离确定了74个组分， 占总峰面积的80.90％。

本发明采用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术，对10批稳心颗粒进 行了提取与分析，选取了19个代表峰进行相对含量统计，19个代表峰的相对面积 之和不低于总面积的40％。

本发明的有益效果：

本发明首次采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用法对稳心颗粒中挥 发性成分进行提取与分析，通过大量的实验研究，优化了气相色谱条件-质谱条 件。并对10个批次的样品进行了含量考察，弥补了以往对稳心颗粒挥发性物质分 析的不足，还构建了稳心颗粒挥发性成分的GC/MS总离子流图。本发明采用顶 空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术对稳心颗粒进行了提取与分析，共分离 鉴定出挥发性成分74个，占总挥发性成分的80.90％。能比较客观反映稳心颗粒主 要挥发性组分的化学成分及其含量，有效地表征稳心颗粒挥发性成分的质量。并 且，对随机抽取的10批稳心颗粒进行分析，选取分离度好、纯度高的19个代表峰 进行统计处理，结果发现，各个峰的保留时间和峰面积都比较稳定。这也说明了 本发明所建立的检测方法，具有良好的重现性和可靠性，为稳心颗粒中挥发性成 分的质量控制提供了可靠的途径。

附图说明

图1是稳心颗粒中挥发性成分的GC-MS总离子流图。

图2是10批次稳心颗粒中挥发性成分的GC-MS总离子流叠放图。

图3是10批次稳心颗粒代表色谱峰相对含量结果。其中图3中19个色谱峰所代 表的化合物名称分别为1-Eucalyptol桉叶素，2-δ-EIemeneδ-榄香烯，3-α-Cubebene α-荜澄茄油烯，4-Tetracyclo[4.4.1.1(7,10).0(2,5)]dodec-3-en-11-ol，5-α-Copaeneα- 胡椒烯，6-β-Patchouleneβ-广藿香烯，7-Cadinene杜松烯，8-(+)-Calarene白菖 烯，9-(-)-Aristolene马兜铃烯，10-Caryophyllene丁香烯，11-Spathulenol匙叶 桉油烯醇，12-Globulol蓝桉醇，13-(-)-Spathulenol(-)-匙叶桉油烯醇， 14-Isoaromadendrene epoxide异香橙烯环氧化物，15-Humulene epoxide 2葎草烯 环氧化物2，16-1,3a-Ethano(1H)inden-4-ol,octahydro-2,2,4,7a-tetramethyl-， 17-Widdrol韦得醇，18-Patchouli alcohol广藿香醇， 19-4-(3,3-Dimethyl-but-1-ynyl)-4-hydroxy-2,6,6-trimethylcyclohex-2-enone。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具 体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

1、稳心颗粒中挥发性成分的检测方法

(a)顶空固相微萃取提取挥发性成分：

将稳心颗粒(山东步长制药股份有限公司，5g/袋，生产批号：1405023)0.51 g、分析纯氯化钠3.6g及水12mL放入150ml顶空瓶，加入搅拌子，加盖密封垫(含 透明蓝色硅胶/PTFE垫)和铝帽，70℃磁力搅拌，插入100μm PDMS萃取头 (Supelco,Bellefonte,Pa)。使萃取头伸出1cm，萃取30min，取出，立即插入气相 色谱仪进样口，进样口温度250℃，解吸5min，进样模式为不分流进样。

(b)气相色谱-质谱联用分析条件：

Agilent 7890A-5975C GC-MS气质联用质谱仪(美国Agilent科技公司)，色谱 数据处理系统(MSD ChemStation E.02.01，美国Agilent科技公司)；色谱柱： HP-5MS(60m×320μm×0.25μm)；载气：He，流量0.8mL/min；汽化温度：250 ℃；接口温度：280℃；色谱柱初始温度50℃(保持1min)，以10℃/min升温速率 升至130℃(保持6min)，以1℃/min升温速率升至145℃(保持5min)，以1℃/min 升温速率升至160℃(保持3min)，以3℃/min升温速率升至220℃，最后保持 1min。电离方式：EI源，能量70eV；离子源温度：230℃；四极杆温度:150℃； 质量范围：(35～800)amu；电子倍增器电压:1400V。

(c)KI值测定：

取正构烷烃混合对照品(C₈-C₂₀，美国FLUKA公司，编号：04070，40mg/L  in hexane)0.8μL，按上述步骤(b)项下气相色谱-质谱联用分析条件，记录各 正构烷烃保留时间，采用线性升温公式计算各组分的KI值

$\mathrm{KI}=100n+\frac{100(t_x-t_n)}{t_{n+1}-t_n}$

式中，tx、tn和tn+1分别为被分析组分和碳原子数处于n和n+1之间的正 构烷烃(tn<tx<tn+1)流出峰保留时间(min)，测定结果见表1。

表1正构烷烃保留时间

(d)挥发性成分的定性定量分析：

稳心颗粒挥发性成分的GC-MS总离子流图见图1。

经过化学工作站处理及用面积归一化法从总离子流图中计算各组分百分含 量，对总离子流图中各色谱峰计算其KI值，利用各色谱峰对应的质谱图进行 NIST08.L标准谱库检所确定各组分，详细结果见表2。

表2稳心颗粒中的挥发性化学成分

注：—：超出正构烷烃最大保留时间

本发明采用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术，(即 HS-SPME-GC-MS)对稳心颗粒进行了提取与分析，共分离鉴定出挥发性成分74 个，占总挥发性成分的80.90％。

从表2看出，稳心颗粒中挥发性成分主要为异香橙烯环氧化物(11.71％)、(-)- 匙叶桉油烯醇(6.01％)、1,3a-Ethano(1H)inden-4-ol,octahydro-2,2,4,7a-tetramethyl- (5.08％)、葎草烯环氧化物2(4.14％)等倍半萜类化合物。

(e)多批次挥发性成分含量测定：

本发明采用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术，对随机抽取的10批 稳心颗粒进行分析，选取分离度好、纯度高的19个代表峰进行统计处理，每批的 相对含量结果见表3。实验结果表明：10批稳心颗粒中的挥发性成分的19个峰面 积和保留时间比较稳定。在剔除异常值后进行统计分析，得出稳心颗粒代表峰的 保留时间和相对含量范围，结果见表4。

GraphPad Prism 5软件分析稳心颗粒代表峰相对含量结果见图3。

表4稳心颗粒代表峰相对含量范围