四环素类抗生素或其药用盐在制备抗肠病毒药物中的应用

摘要

本发明公开了四环素类抗生素或其药用盐在制备抗肠病毒药物中的应用。实验证明，具有氢化骈四苯母核的四环素类抗生素具有抗肠病毒活性，其中多数具有明显的抑制肠病毒71复制的活性。此外，鉴于肠病毒71是导致手足口病的主要病原体，本发明还公开了可将四环素类抗生素用于手足口病的初期治疗、阻断病毒的传播。

说明书

技术领域

本发明属于医药新用途领域。更具体地，涉及一系列四环素类抗生素或其药用盐在制备抗肠病毒药物中的新用途。

背景技术

肠病毒是一种主要生长于肠道的RNA病毒，在生化特性、流行病学及致病原因上具有许多共同点，主要包括：柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CAV)、伊科病毒(Echovirus)、脊髓灰质炎病毒和肠病毒68-71型。肠病毒具有高度传染性，人类是唯一宿主及唯一感染源。其中肠病毒71型(Enterovirus 71，EV71)，是导致手足口病的主要病原体之一。成人对EV71多具有免疫性，婴幼儿对EV71易感。目前，对于感染EV71且病情严重的病人，主要是采用一般支持疗法和对症治疗，在抗病毒方面还没有特异、高效的抗病毒药物。

四环素类抗生素主要包括四环素、金霉素、土霉素、地美环素、强力霉素、美他环素、米诺环素和替加环素等，基本母核为氢化骈四苯。四环素类抗生素主要作用于细菌的30S rRNA，通过抑制氨酰-tRNA结合到核糖体的A位上而抑制细菌蛋白质合成，临床上主要用来治疗多种细菌和衣原体、支原体、立克次氏体引起的感染。除抑菌作用外，四环素类抗生素还具有广泛的非抗生素活性，如：抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗金属蛋白酶、抗癌等，已作为神经保护剂用于脑卒中、多发性硬化等多种急慢性神经系统疾病的临床治疗(Yrjanheikki J,et al.PNAS,1998,95:15769；Laml Y,et al.Neurology.2007,69:1404；Zabad RK,et al.Mult Scler.2007,13:517)。目前，对四环素类抗生素的抗病毒谱和抗病毒机制还知之甚少。致病性病毒种类众多，受限于抗病毒药物的特异性作用靶位和耐药性问题，目前可用的抗病毒药物种类很少，尤其是广谱抗病毒药物非常缺乏。新药研制耗时长、需要高昂的人力和经济投入，老药新用则为新药研发另辟蹊径。作为一类价格低廉、使用时间较长的老药，研究四环素类抗生素是否具有广谱的抗病毒效果、分析比较不同四环素药物的抗病毒活性强弱以及对其进行结构改造以获得抗病毒效果更好的四环素衍生物新药，对于抗病毒治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种四环素类抗生素或其可药用盐的新用途，即在制备抗肠病毒药物中的应用。尤其是四环素类抗生素或其可药用盐在抗肠病毒复制、保护细胞免受病毒感染的抗病毒药物制备方面的应用。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明涉及的四环素类抗生素包括但不限于，四环素、金霉素、地美环素(去甲金霉素)、土霉素及半合成产物强力霉素(多西环素)、美他环素(甲烯土霉素)、米诺环素(二甲胺四环素)或替加环素。本发明涉及的四环素类抗生素药用盐优选为盐酸盐。根据实验，发明人认为其它含有氢化骈四苯母核的化合物也同样具有抗肠病毒活性。

在本发明的一个实施方案中，本发明所检测的病毒为EV71，在不同药物浓度下，发明人通过观察病毒引起的细胞病变效应、流式分析病毒基因组携带的报告基因GFP的表达情况以及空斑减数法，评价了上述八种四环素类抗生素对EV71复制是否具有抑制作用和对宿主细胞是否具有保护作用；在相同药物摩尔浓度下比较了不同四环素药物之间的抗病毒效应的强弱，并分析了药物的抗病毒活性与化合物结构特点之间的关系。实施方案中所涉及的八种药物在低病毒滴度感染情况下都表现出体外抗病毒活性，空斑减数结果显示IC50≤1.36μM；在高病毒滴度(MOI＝0.1)感染的情况下，八种四环素药物抗病毒活性有些差异，其中四环素和替加环素的抗病毒作用最强、降低细胞病变效应最显著，流式分析结果显示IC50分别为12.69和28.16μM。

因此，本发明要求保护具有氢化骈四苯母核的这一类化合物在制备抗肠病毒药物中的应用。优选的，本发明要求保护具有氢化骈四苯母核的这一类化合物在制备抗肠病毒71药物中的应用。此外，由于EV71感染主要引起婴幼儿手足口病，根据手足口病诊疗指南(2013年版)，目前主要采取隔离和对症治疗，并无有效的针对性抗病毒药物。由于四环素类药物容易沉积于婴幼儿的骨骼和牙齿组织中、影响骨骼正常发育，因此8岁以下儿童禁止口服和注射使用。考虑到手足口病主要症状为手、足、口腔等部位的斑丘疹、疱疹，直接或间接接触是一条重要的传播途径，因此，本发明所述药物优选为皮肤外用的局部施用制剂，例如软膏剂，用于手足口病的初期治疗、阻断病毒的传播。

本发明的有益效果：

本发明表明具有氢化骈四苯母核的四环素类抗生素具有抗肠病毒活性， 其中多数具有明显的抑制EV71复制的活性，尤以四环素和替加环素的抗病毒效果最为显著。此外，我们还发现四环素类抗生素对临床分离的柯萨奇病毒16(CAV16)具有明显的复制抑制作用。EV71和CAV16同属肠病毒，是目前临床上婴幼儿手足口病最为常见的两种病原体，具有与其它肠病毒相同的生化特性和复制特点，因此，本发明提示四环素类药物及其药用盐具有广泛的抗肠病毒活性。此外，鉴于手足口病患者群、临床症状和药物作用特点，本发明提示可将四环素类抗生素用于手足口病的初期治疗、阻断病毒的传播。

附图说明

图1不同种类四环素类药物抑制EV71复制的量效曲线。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1体外实验

1.药品与试剂 

本发明所测试的四环素类药物均为标准品结构式如下，其中四环素、盐酸金霉素、土霉素和米诺环素购自广东食品药品检验所，盐酸地美环素、盐酸强力霉素、美他环素和替加环素购自大连美仑生物技术有限公司；用无菌水配制成浓度为25.6mM的药物贮存液；使用时分别用含10％血清的DMEM培养基依次进行2倍稀释，使用终浓度分别为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25μM。试剂包括：1×PBS(NaCl 8g/L,KCl 0.2g/L,Na₂HPO₄ 2.72g/L,NaH₂PO₄ 24g/L,pH 7.2)，DMEM(Gibco)，胎牛血清(Sigma)，0.05％Trypsin-EDTA(GIbco)，多聚甲醛(生工生物)，结晶紫(珠海贝索生物技术有限公司)，MTT(Sigma)，DMSO(Sigma)。

  R₁R₂R₃R₄R₅四环素 H CH₃OH H H 金霉素 Cl CH₃OH H H 地美环素 Cl H OH H H 土霉素 H CH₃OH OH H 强力霉素 H CH₃H OH H 美他环素 H CH₂- OH H 米诺环素 N(CH₃)₂H H H H 替加环素 N(CH₃)₂H H H NCOCH₂NHC(CH₃)₃

3.细胞及病毒株

293A-SCARB2细胞稳定组成型表达EV71的天然受体SCARB2(human scavenger receptor class B,member 2，清道夫受体B2)；横纹肌肉瘤RD细胞对EV71高度敏感，广泛用来从临床样品中分离、扩增EV71。EV71-GFP为携带报告基因GFP的从北京地区分离的毒株；EV71-MZ是从广东地区重症手足口病患儿分离得到的高致病毒株。

4.仪器

细胞培养箱(Thermo)，倒置显微镜(Leica)，流式细胞仪(BD Accuri^TM C6)

1.1 药物的细胞毒效应：将293A-SCARB2和RD细胞分别接种于96孔中，在5％CO₂、37℃条件下培养过夜，更换含有不同种类和不同浓度四环素药物的培养基；分别培养24、48和72h后，以MTT法检测药物对细胞的毒性，以在相同条件下培养、未加药物的细胞为对照；每组细胞三个重复孔，计算各组细胞的生长抑制率。生长抑制率＝[(对照组平均OD值-实验组平均OD值)/对照组平均0D值]×100％。结果显示，八种所测的四环素类药物在浓度高达512μM、培养时间长达72h时对293A-SCARB2和RD细胞的生长几无影响，因此四环素药物使用浓度低于512μM时细胞毒效应可忽略不计。

1.2 通过显微镜观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)，检测四环素药物抗EV71、保护细胞的效果：病毒介导的CPE指病毒在细胞内增殖引起的细胞退形性病变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、死亡和脱落等，是判断病毒增殖的最常用指标之一。将RD细胞接种于96孔中，在5％CO₂、37℃条件 下培养18-20h后，将1000TCID50的EV71-MZ病毒感染1h，更换含有不同浓度和不同种类四环素药物的培养基，置于37℃,5％CO₂培养箱中培养，每天在显微镜下观察细胞病变状态,当未加药物的对照细胞出现75％以上病变时，终止实验，观察并记录加药组的CPE程度，CPE的记录方法为:无CPE为“-”，25％细胞出现病变为“+”；25％～50％细胞病变为“++”；50％～75％细胞病变为“+++”；75％～100％的细胞病变为“++++”，结果见表1。可以看出：除金霉素和地美环素外，其它六种四环素类药物在同一药物浓度下表现出程度不一的CPE效应减轻，并且随着药物浓度升高CPE效应逐步减轻、细胞状态变好；其中以四环素、美他环素和替加环素抑制CPE的效果最为显著。

表1

  0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 四环素 ++++ ++++ +++ +++ ++ + + - - - - - 金霉素 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ 地美环素 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ 土霉素 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ ++ ++ + + - - 强力霉素 ++++ ++++ ++++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ + - - 美他环素 ++++ ++++ +++ +++ ++ ++ ++ + + - - - 米诺环素 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ +++ ++ ++ + + - 替加环素 ++++ +++ +++ ++ ++ ++ + + - - - -

1.3 流式分析GFP检测四环素药物的抗EV71效果：将293A-SCARB2细胞接种于96孔板中，在5％CO₂、37℃条件下培养16h后，按MOI＝0.3接种EV71-GFP病毒感染1h后更换含有不同浓度和不同种类四环素药物的培养基，置于37℃,5％CO₂培养箱中培养18-20h，经胰酶消化、PBS清洗、多聚甲醛固定，用流式细胞仪分析细胞的GFP荧光表达情况，以未加药物的GFP阳性细胞率作为100％。实验重复3次，计算病毒复制抑制率。病毒复制抑制率(％)＝(病毒对照组GFP阳性细胞百分比-药物处理组GFP阳性细胞百分比)/病毒对照组GFP阳性细胞百分比×100％。以药物浓度为横坐标、病毒复制抑制率为纵坐标作图，根据GFP抑制率结果作出病毒对药物的敏感性曲线(四环素类药物抗病毒的量效曲线)，见图1；利用SPSS 20软件的Probit回归法计算药物的得出药物的半数抑制浓度IC50，结果见表1。可以看出，大部分四环素类药物对小RNA病毒EV71具有良好的抑制作用，其中以四环素和替加环素效果最好，对EV71 的半数抑制浓度IC50分别是12.68和28.16μM，或5.87和16.5μg/ml。

1.4 空斑减数法检测四环素药物的抗EV71效果：将RD细胞接种于6孔板中，在5％CO₂、37℃条件下培养18-20h后，取100TCID50的EV71-MZ病毒感染1h,弃去上清,加入含1.2％甲基纤维素以及不同浓度和不同种类四环素药物的培养基培养4天左右，经多聚甲醛固定、结晶紫染色、清水漂洗、晾干后作空斑计数,实验重复3次，计算空斑抑制率。空斑抑制率(％)＝(病毒对照组空斑数-药物处理组空斑数)/病毒对照组空斑数×100％。以药物浓度的对数值做横坐标，以空斑抑制率做纵坐标作图，根据空斑抑制率结果作出病毒对药物的敏感性曲线，通过SPSS 20软件使用Probit回归法计算药物的IC50，结果见表2。

表2

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。