评价内体运输的测定

摘要

本发明提供了用于评价分子递送到真核细胞之中的效率的测定和相应试剂盒(基础测定)。本发明还提供了用于评价测试分子有关上述基础测定的抑制效应的测定和相应试剂盒。

说明书

本发明涉及用于评价分子递送到真核细胞内的效率的测定和相应试 剂盒。

任何潜在治疗分子发挥功效的关键要求是其必须能够表现出良好的 效能。本发明涉及经由熟知的内吞过程进入真核细胞胞质的分子。鉴于 此，重要的是理解该细胞进入模式所涉及的步骤。因而，为了帮助例示 与该细胞进入模式相关的关键步骤，可参考图1。在步骤1中，分子与 细胞表面上存在的结合位点(例如受体或接受体)结合。在步骤2中， 受体(加上结合的分子)变成内化到细胞中-该步骤通称为“内吞”或 “内体形成”。在步骤3中，在内化之后，分子插入内体膜，并实现所 述分子(或其一部分)从内体内、穿过内体膜和进入真核细胞胞质的释 放。一旦在胞质中(步骤4)，所述分子能够作用于其胞内靶(例如抑 制靶分子，如蛋白水解切割细胞靶蛋白)。

因此良好效能测试有赖于准确评价一个或多个上述步骤。

迄今为止，对能够经由“受体介导的内吞”进入真核细胞的分子的 效能测试集中在毒性分子如梭菌神经毒素。举例而言，以下测定已被用 于市售的梭菌神经毒素(例如肉毒杆菌神经毒素，其市售名诸如 Dysport^TM,Neurobloc^TM和Botox^TM)。

小鼠LD₅₀测定是目前唯一经FDA批准用于发布肉毒杆菌毒素的测定。 该测定同时测试肉毒杆菌神经毒素的所有三个结构域的作用(即结合、 易位和蛋白酶)。更具体而言，其限定该毒素在限定时间点(通常在给 药后2-4天)的半数致死腹膜内剂量(活性以小鼠LD₅₀单位表示)。然 而令人遗憾的是，LD₅₀测定使用大量动物。而且，LD₅₀单位不是绝对测 量值，因为其不是生物学常数-由此其高度取决于测定条件。特别是， 伴随该测定的误差在不同测试设施间可以高至60％(Sesardic et al. 2003；Biologicals 31(4):265-276)。

小鼠弛缓性麻痹测定，也称为“小鼠腹下垂测定”，将肉毒杆菌毒 素的活性与将毒素皮下注射到小鼠左腹股沟下肢区域后看到的腹部凸出 程度相关联-麻痹大小程度是剂量依赖性的。该方法被提出作为小鼠 LD₅₀测试的改进，因为其建立在人道的终点上。该测定比LD₅₀测定更敏 感约10倍，使用亚致死剂量的毒素，且比LD₅₀测试更迅速-其在24-48 小时提供结果，相比于典型LD₅₀测定的72-96小时。来自该测定的结果 显示出与LD₅₀值优异的一致性(Sesardic et al.,1996)。尽管该测 定使用LD₅₀测定中所用动物的20％，其仍然必需使用动物。

诸如小鼠/大鼠膈神经半膈测定(其基于使用离体神经肌肉制备物) 的测定将肉毒杆菌神经毒素的活性与将其应用于维持培养基后所述制备 物抽动反应幅度的下降相关联。该测定的通常终点是观察到幅度下降 50％前所需的时间。但是遗憾的是，半膈测定(象LD₅₀测定)导致使用 大量动物。此外，该测定需要培训过使用复杂且昂贵设备的高技能人员。

使用培养脊髓神经元的底物切割测定将肉毒杆菌神经毒素的活性与 对所述神经元中存在的特异性蛋白质的切割相关联。尽管该测定比体内 (LD₅₀，小鼠弛缓性麻痹)和离体测定(半膈)使用较少的动物，所述 测定需要高技能人员来进行解剖和培养-解剖和培养技术是耗时的且必 须在需要进行前～3周计划。另一个缺陷是底物切割测量值可以是高度 可变的。

所有上述测定都具有特定的缺点，尤其是动物福祉问题和/或限制 于测试与神经肌肉接头(NMJ)结合的分子-后者是天然梭菌神经毒素结合 的靶细胞。

WO95/33850描述了一种无细胞底物切割测定，其中通过表位特异性 抗体来检测切割产物。由于所述抗体能够区分经切割的底物和未切割底 物蛋白，有可能定量梭菌神经毒素的效能。尽管该测定没有上述动物福 祉或NMJ特异性不足，其实际上是“无细胞”测定且由此仅仅能够评价 在蛋白质切割方面的效力。相应地，WO95/33850不能评价在任何一个 或多个同等重要的步骤方面的效能，尤其是：细胞结合；内体形成；或 穿过内体膜易位。换言之，(根据WO95/33850)鉴别为有效的底物切 割分子的分子可能具有极少或没有有用的治疗效能-例如由于其缺乏以 下任何一种或多种：最佳的细胞结合；最佳的内体形成；和/或最佳的 易位功能。

因此本领域需要替代和/或改进的效能测定，其解决一个或多个上 述问题。例如，需要解决现存的动物福祉问题的人道性测定。类似地， 不限于测试特异性结合NMJ和/或神经元细胞的分子的测定。类似地， 需要提供可靠的分子效能结果的测定，特别是提供反映体内效能的效能 结果的测定。

本发明通过提供一种测定解决了上述问题，其包括：

i)使真核细胞与有待评价内体释放能力的测试分子接触，其中所述 真核细胞包含细胞膜，其包括存在于所述细胞细胞膜外表面上的结合位 点；

ii)使测试分子与所述真核细胞温育，并由此允许

a)测试分子与存在于真核细胞上的结合位点结合并形成结合复合物， 从而允许所述结合复合物通过内吞进入真核细胞；

b)一个或多个内体在所述细胞之内形成，其中所述一个或多个内体 含有测试分子；和

c)所述测试分子通过穿越所述一个或多个内体的内体膜进入所述真 核细胞的胞质；

iii)除去未与存在于真核细胞上的结合位点结合的过量测试分子；

iv)在预定时间段后，检测存在于所述一个或多个内体中的测试分 子的量，或者检测存在于所述真核细胞的胞质中的测试分子的量；

v)将步骤iv)中检测到的测试分子的量与对照值相比较，其中所述 对照值代表在步骤iv)之前存在于所述一个或多个内体中的测试分子的 量或存在于胞质中的测试分子的量；

vi)通过确定存在于所述一个或多个内体之中的测试分子的量的相 对变化，或者通过确定存在于所述真核细胞胞质中的测试分子的量的相 对变化，计算测试分子的内体释放值。

所述真核细胞可选自酵母细胞、昆虫细胞、脊椎动物细胞、哺乳动 物细胞、植物细胞和真菌细胞。这类动物细胞的实例包括人类、啮齿类、 小鼠和仓鼠细胞。

在一个实施方案中，所述真核细胞结合位点能够实现受体介导的内 吞或者非受体介导的内吞。所述结合位点可以是受体或接受体。经由非 受体结合位点内吞的肽序列的实例包括具有富含精氨酸的序列(例如 RRRRRRRR,RRRRRRRW)的肽，和诸如以下的肽：PHLIP,Pep-1,SAPE, PFVYLI,和Kaposi FGF衍生AAVALIPAVILALLAP。这些肽据信经由非特 异性离子相互作用被内吞如细胞。所述结合位点可以是在真核细胞细胞 表面上天然存在的结合位点。或者，真核细胞可以是经修饰以表达不会 天然存在于所述真核细胞细胞表面上的结合位点的重组真核细胞。

温育步骤ii)可以进行任意给定时间段，例如从5分钟到5天的时 间段。典型的时间段是1-12小时，例如2-10小时，4-8小时，或6-8 小时。在此期间，真核细胞(即细胞膜的外表面)暴露于测试分子(典 型地是过量的测试分子)，结果实现“稳态”，其中测试分子以大致相 同的速率进入并离开胞内的内体。这一时间点代表进行步骤iii和/或 iv)的最佳时间点。

步骤iii)涉及减少或去除真核细胞外的测试分子来源，从而减少进 入细胞的测试分子的量(或实质上防止测试分子进入细胞)。所述进入 真核细胞的测试分子的量的减少继而提供进入内体的测试分子的量的改 变，其继而导致离开内体和/或进入真核细胞胞质的测试分子的量(或 速率)的改变。正是离开内体结构的测试分子的量(或速率)提供了本 发明测定的基础-所述测试分子离开内体结构的量(或速率)可以通过 存在于内体中的测试分子的量的变化和/或通过存在于胞质中的测试分 子的量的变化来衡量。当测量存在于内体中的测试分子的量时，通常观 察到存在的测试分子的量的减少。当测量存在于胞质中的测试分子的量 时，可观察到存在于胞质之中的测试分子的量的增加或减少。举例而言， 当在建立测试分子的稳态内体运输之前启动步骤iii)时，可观察到胞 质中的测试分子的量的增加。或者，当测试分子从真核细胞的细胞分泌 速率超过测试分子内体运输从内体进入胞质中的速率时，可观察到胞质 中的测试分子的量的减少。

测定中所用的真核细胞可固定在表面上。细胞的固定可作为测定前 步骤进行(即预固定)，或者可以作为测定规程的一部分来进行。因此， 在一个实施方案中，对测定的细胞进行预固定。真核细胞的固定可通过 任何常规方式来进行。举例而言，将细胞以高密度接种到测定板中并使 其粘附，然后进行测定。或者，将细胞接种到测定板中并在用前培养数 天以提供汇合单层。通过使用常规涂层如多聚D赖氨酸包被的板可增强 细胞贴壁。

在一个实施方案中，真核细胞的固定可在步骤iii)之前或期间进行， 从而提供将所述细胞与游离(例如未结合或外源)测试分子分离的简单 方式。或者，固定可在步骤iii)之后进行，例如以有助于检测步骤iv)。

步骤iii)可包括过滤步骤或亲和配体步骤，在此期间将真核细胞与 过量(例如未结合或外源)测试分子分离。步骤iii)可包括清洗步骤， 在其中将过量(例如未结合或外源)测试分子从真核细胞洗去，例如使 用常规缓冲液。过量测试分子意指存在于测定培养基中的测试分子，在 真核细胞以外，并且尚未与真核细胞表面上存在的结合位点结合。

步骤iv)中对测试分子的检测通常在步骤iii)后不久进行。举例而 言，步骤iv)的典型时间表为在步骤iii)后5分钟到5小时之间。在一 个实施方案中，步骤iv)在步骤iii)后15-240分钟，或者30-180分钟， 或者45-150分钟进行。检测步骤iv)可以在若干时间点重复，例如以 10分钟或15分钟或30分钟的间隔-这将允许计算内体释放的速率。

检测步骤iv)可以通过任何常规方式进行。举例而言，不依赖于透 化作用的检测可通过监测测试分子本身来实现。这可以通过用荧光团标 记测试分子来实现。可附着到测试分子的适宜荧光团包括荧光素、若丹 明、绿色荧光蛋白、单壁碳纳米管和

对测试分子的检测可以基于所述测试分子的胞内定位-在胞质中这 类定位的一个实例是定位到细胞核。在该实施方案中，测试分子被标记 (例如用荧光团)并且还具备核定位信号。由此，标记可在内体中检测 到，且内体逃逸通过监测标记(例如荧光)在细胞核中的积聚来确定。 在这方面，核本身可用染料标记-常规的核染料是本领域广为人知的 (例如Hoescht染色)。

任何常规检测手段都可用于监测测试分子，如荧光共振能量转移 (FRET)。举例而言，供体/受体对可以是青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光 蛋白(YFP)。用于FRET的其它供体/受体对是本领域广为人知的。在一 个实施方案中，可以检测用CFP和YFP标记的测试分子，并可以确定存 在于内体和/或胞质中的测试分子的量。在一个实施方案中，可以监测 FRET信号的丧失。例如，如果仅仅部分测试分子从内体易位到细胞质 中，如果供体/受体对(例如CFP和YFP)分开的话这可导致FRET信号 的丧失。由此，例如，测试分子可包含梭菌神经毒素(或其衍生物或功 能等同体，例如TSI)的L-链和H_N结构域(或由其组成)。供体/受体 标记(例如CFP和YFP)可置于所述两个组分上，例如L-链可用CFP标 记而H_N组分可用YFP标记。在一个实施方案中，当包含LH_N的测试分子 存在于细胞内体中时可检测到FRET信号。H_N组分的易位功能随后将治 疗部分(即L链)释放到胞质中，随着CFP和YFP标记彼此分开，FRET 信号消失。

生物发光共振能量转移(BRET)也可用于监测/检测测试分子。在 BRET中，FRET对的供体荧光团被荧光素酶所替换。适宜的BRET方法是 本领域技术人员已知的。

在一个实施方案中，对测试分子的检测可基于同胞质pH相比内体 之内存在的天然pH差异。在该实施方案中，测试分子可用pH敏感标记 如pH敏感染料来标记。可选择标记以在特异性pH范围中可检测到/可 见(例如以增加的强度)。由此，可选择标记使得仅仅当存在于内体中 时可检测到/可见(例如以更高强度)，而当存在于胞质中时不可见/检 测不到(例如以较低强度)。或者，可选择标记使得仅仅在测试分子易 位到胞质中后变得可检测到/可见。合适的标记(例如染料)是本领域 技术人员已知的，例如基于荧光素的pH指示剂(例如BCECF，BCPCF) 及其衍生物，苯并氧杂蒽染料，花青基染料，和其它小分子pH指示剂 (例如铕复合物，芴衍生物，1,4-二羟基酞腈(1,4-DHPN)，8-羟基芘- 1,3,6-三磺酸(HPTS))，酸性pH指示剂如吡啶基噁唑探针 Yellow/Blue DND-160 PDMPO 59，蒽基传感器DND-167 60,DND-189  61,DND-153 62和DND 192 63,BODIPY-基染料(例如BODIPYs 68, NH2BDP 68a,DiMeNBDP 68b,EtMeNBDP 68c和DiEtNBDP 68d)以及 pHrodo指示剂。

取决于所采用的检测手段类型，可能期望透化真核靶细胞。举例而 言，可将蛋白质或非蛋白标记(如myc标记或生物素)连到测试分子， 或者测试分子本身可内在地包括可检测组分(如表位)，且随后的检测 可使用经标记的一抗或者未经标记的一抗联合经标记的二抗来实现。抗 体检测试剂和方法对本领域技术人员而言是熟知且常规的。类似地，结 合配偶也是本领域熟知的，例如经标记的链霉抗生物素可用于检测生物 素化对照分子。透化典型地包括初始固定步骤(例如用甲醛、多聚甲醛、 乙醇或甲醇)然后用适宜试剂进行透化-常规透化试剂是本领域熟知的 (例如triton X-100，洋地黄皂苷，吐温20和/或皂苷)。

比较步骤v)采用对照值，其代表在检测步骤iv)之前存在于内体和 /或胞质中的测试分子的量。对照值通常通过与在检测步骤iv)中测定 测试分子量相同的手段/方法来测定。对照值通常代表在步骤iii)期间 或之前存在于内体和/或胞质中的测试分子的量。举例而言，对照值可 代表在步骤ii)期间或结束时存在于内体和/或胞质中的测试分子的量- 在一个实施方案中，对照值代表当建立了“稳态”易位速率时(即当测 试分子以大致相同的速率进入和离开胞内的内体时)存在于内体和/或 胞质中的测试分子的量。

测试分子可以是“小分子”治疗剂，诸如芬戈莫德，莫那匹尔，氨 羟二磷酸二钠，甲氨蝶呤，丁螺环酮，奈莫必利，apipipiprazole，联 苯芦诺，SKF82958，奥曲肽，MK-5046，FO38-WE-05，利美尼定， SCH655842，salvinorin，CP55940或纳米颗粒。纳米颗粒已被成功靶 向并显示出通过经抗体靶向而内化到细胞中(参见例如Wartlick et  al.,J.Drug Target.12:461-471)。由此，在一个实施方案中， 测试分子可以是纳米颗粒，其连到尤其是靶向部分组分如测定细胞上存 在的受体的抗体或配体。

或者，测试分子可以是大分子如多肽或蛋白质。特定实例包括毒素 如细胞毒性蛋白质和非细胞毒性蛋白质。在这方面，提及多肽和蛋白质 包括天然存在的和重组制备的多肽和蛋白质。

细胞毒性蛋白质通过杀伤其天然靶细胞而发挥作用。这组毒素尤其 可通过植物毒素如蓖麻毒素和相思豆毒素和细菌毒素如白喉毒素和假单 胞菌外毒素A来例示。细胞毒性毒素通常通过抑制细胞蛋白质合成过程 来杀伤其靶细胞。这类蛋白质包括重靶向的细胞毒性蛋白质，其中所述 蛋白质的天然结合能力通过引入结合配体(也称为结合部分)而修饰， 从而赋予所修饰蛋白以新的靶细胞结合特性。

相比之下，非细胞毒性蛋白质通过使细胞功能失能而作用于靶细胞。 重要的是，非细胞毒性毒素不杀死它们所作用的靶细胞。非细胞毒性蛋 白酶的一些最为熟知的例子包括梭菌神经毒素(例如肉毒杆菌神经毒素， 其市售名诸如Dysport^TM,Neurobloc^TM和Botox^TM)，IgA蛋白酶(参见 例如WO99/032272)和antarease蛋白酶(参见例如WO2011/022357)。 非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割从而灭活称为SNARE蛋白(例如 SNAP-25,VAMP或突触融合蛋白)的胞内转运蛋白而起作用-参见 Gerald K(2002)"Cell and Molecular Biology"(第4版)John  Wiley&Sons,Inc。缩写SNARE源自术语可溶性NSF连接受体，其中 NSF意指N-乙基马来酰亚胺-敏感因子。SNARE蛋白是真核细胞中囊泡 分泌过程的必需组分。因此，非细胞毒性蛋白酶通过遏制细胞分泌而起 作用。这类蛋白质包括重靶向的非细胞毒性蛋白质，其中所述蛋白质的 天然结合能力通过引入结合配体(也称为靶向部分)而修饰，从而赋予 所修饰蛋白以新的靶细胞结合特性。申请人已开创了涉及非细胞毒性蛋 白酶重靶向的技术，其追溯至1990年代(参见例如WO 94/21300,WO  96/33273和WO 98/07864)。所述重靶向蛋白质称为(在整个文献和科 学界)靶向分泌抑制剂(TSI)-提及TSI包括结构等同体如 WO2011/018665中所述的那些。

本发明的“测试分子”测定方面可进一步包括检测测试分子的原位 活性的步骤。例如，在梭菌神经毒素或TSI的情形中，测定可进一步包 括检测SNARE蛋白切割的步骤。可采用任何这类检测手段，例如 WO95/33850中所述的方法或通过FRET测定。

本发明的测定可单独分开采用以评价阻断分子对真核细胞的内体运 输系统的抑制效应。由此，在相关方面，本发明提供一种测定，其包括：

i)使真核细胞与结合所述真核细胞表面上存在的结合位点的对照分 子接触，其中所述对照分子与结合位点形成结合复合物，通过内吞进入 真核细胞，在此期间形成含有对照分子的内体，并且其中所述对照分子 通过穿越内体的内体膜进入所述真核细胞的胞质；

ii)使对照分子与所述真核细胞温育，并由此允许

a)对照分子与存在于真核细胞上的结合位点结合并形成结合复合物， 从而允许所述结合复合物通过内吞进入真核细胞；

b)一个或多个内体在所述细胞之内形成，其中所述一个或多个内体 含有对照分子；和

c)所述对照分子通过穿越所述一个或多个内体的内体膜进入所述真 核细胞的胞质；

iii)使真核细胞与有待评价其遏制从一个或多个内体释放对照分子 的能力的测试抑制剂分子接触。所述真核细胞与测试抑制剂分子的接触 可以在步骤i)之前、期间或之后和/或步骤ii)期间或之后进行；

iv)在预定时间段后，检测存在于所述一个或多个内体中的对照分 子的量，或者检测存在于所述真核细胞的胞质中的对照分子的量；

v)将步骤iv)中检测到的对照分子的量与对照值相比较，其中所述 对照值代表在步骤iii)之前存在于所述一个或多个内体中的对照分子 的量或存在于胞质中的对照分子的量；

vi)通过确定存在于所述一个或多个内体之中的对照分子的量的相 对变化，或者通过确定存在于所述真核细胞胞质中的对照分子的量的相 对变化，对测试抑制剂分子赋予抑制值。

对照分子可以是上述的“小分子”治疗剂，诸如PMSA抑制剂(参 见Liu et al.,2008)或芬戈莫德，莫那匹尔，氨羟二磷酸二钠，甲 氨蝶呤，丁螺环酮，奈莫必利，apipipiprazole，联苯芦诺，SKF82958， 奥曲肽，MK-5046，FO38-WE-05，利美尼定，SCH655842，salvinorin， CP55940或纳米颗粒。

或者，对照分子可以是较大分子如多肽或蛋白质。特定实例包括毒 素如细胞毒性蛋白质和非细胞毒性蛋白质。在这方面，提及多肽和蛋白 质包括天然存在的和重组制备的多肽和蛋白质。合适的细胞毒性和非细 胞毒性蛋白质的实例在此之前已描述过。有关非细胞毒性蛋白质，优选 的实例包括梭菌神经毒素(如破伤风毒素，BoNT/A,BoNT/B,BoNT/C- i,BoNT/D,BoNT/E,BoNT/F,BoNT/G,丁酸梭菌(C.butyricum)，包 括其天然和修饰形式，以及其组合)，TSI(如在此之前所述的那些)， antarease蛋白酶和IgA蛋白酶。

测试抑制剂分子的实例包括孔道阻断剂如川楝素-参见Fischer,A. et al.(2009)PNAS,Vol.106,No.5,pp.1330-1335；质子-ATP 酶阻断剂如巴佛洛霉素A-参见Bartz et al.(2011)Biochem J 435  pp.475-487，伴刀豆球蛋白A(Tscherne et al.(2006)J Virol, Vol.80,No.4,pp.1234-1741)和灵杆菌素-参见Ohkuma et al. (1998)J Biochem Vol.334,pp.731-741。

如上所述涉及本发明基础测定的所有步骤同样适用于上述测试抑制 剂分子测定。

上述测试抑制剂分子测定中的接触步骤iii)可进行任意给定时间段， 例如在开始温育步骤ii)之前5分钟到5天的时间段，如在开始温育步 骤ii)后30分钟到12小时之间，或者30分钟到10小时之间，或者30 分钟到8小时之间，或者1-8小时之间。或者，步骤iii)可进行与步 骤ii)相同长度的时间，或者其开始可延迟5分钟到5天，如1-12小 时或2-10小时或4-8小时或6-8小时。典型地，一旦达到“稳态” (经由步骤ii))后进行接触步骤iii)，在所述稳态中对照分子以大致 相同的速率进入和离开胞内的内体。

本发明的抑制剂方面还可包括除去过量的对照分子和/或测试抑制 剂分子的步骤。所述“去除步骤”在抑制剂方面测定上下文中指定为 “步骤iiia)”。在本发明“测试分子”测定方面上下文中所有上述 “去除步骤iii)”的实施方案同样适用于本发明“抑制剂分子”测定 方面的“去除步骤iiia)”。

附图列表

图1

内吞相关的关键步骤。4个关键步骤标为1-4。

图2

靶向于表达GHRHR的GH3细胞的TSI的内化。图2A：细胞在不存在 TSI条件下温育。图2B：细胞在3μΜ含GHRH靶向部分的TSI存在下 温育60分钟。

图3

靶向于表达GHRHR的GH3细胞的TSI的浓度依赖性内化。

图4

靶向于大鼠垂体细胞的TSI的内化。图4A：细胞在不存在TSI条件 下温育。图4B：细胞在1μΜ含GHRH靶向部分的TSI存在下温育60分 钟。

图5

含GHRH靶向部分的TSI浓度依赖性内化到大鼠垂体细胞中。细胞 与以下物质温育60分钟：(·)具有GHRH靶向部分的TSI；(o)相应的 未配体化TSI。

图6

靶向于表达大鼠GHRHR的GH3细胞的TSI的内化和内体逃逸。将连 续处理方案与脉冲追踪处理方式作比较。

图7

靶向于HT-1080细胞的TSI的内化。图7A：细胞在不存在TSI条件 下温育；图7B：细胞在2μΜ含EGFR靶向部分的TSI存在下温育60分 钟。

图8

靶向于表达GHRHR的CHO-K1细胞的TSI的浓度依赖性内化。

实施例

实施例1

将A549细胞接种到96孔板中并培养2天以达到～90％汇合。将 标记的表皮生长因子(EGF)与细胞温育60分钟。洗细 胞，增加温育时间后，使用高内涵筛选测定总细胞荧光，内体斑点计数 和内体荧光。

实施例2

将表达大鼠生长激素-释放激素(GHRH)受体的GH3细胞接种到多聚D 赖氨酸包被的96孔板中。24小时后，将包含GHRH靶向结构域(1-44) 以及血清型C肉毒杆菌神经毒素的易位和轻链结构域的TSI与细胞温育 30分钟。洗细胞，在增加温育时间通过酸洗除去与细胞表面结合的TSI。 将细胞用多聚甲醛固定并用洋地黄皂苷透化。肉毒杆菌神经毒素C的 TSI轻链用兔抗LC肉毒杆菌神经毒素C一抗和山羊抗兔标记二抗来检测。使用高内涵筛选监测内体内的积聚和内体 逃逸。

实施例3

制备胚胎脊髓神经元并培养在基质胶包被的96孔板中。将肉毒杆 菌神经毒素A与神经元温育10分钟，然后洗细胞。在增加温育时间后 用皂苷透化细胞，并用抗肉毒杆菌神经毒素A的LC的抗体检测肉毒杆 菌神经毒素的LC。使用高内涵筛选监测内体内的积聚和内体逃逸。

实施例4

将表达人甲状旁腺激素受体PTH1的HEK293细胞接种到多聚D赖氨 酸包被的96孔板中。过夜温育后，将细胞与myc标记的PTH(1-34)温 育45分钟。洗细胞，增加温育时间后，将细胞固定并用吐温20透化。 用若丹明标记的抗myc抗体检测myc-标记的PTH(1-34)。使用高内涵筛 选监测内体内的积聚和内体逃逸。

实施例5

将表达血管活性肠肽1受体的CHO-K1细胞接种到96孔板中并温育 过夜。将细胞单独或与增加浓度的内体逃逸抑制剂温育60分钟，然后 将生物素化TSI与细胞共温育20分钟。清洗除去TSI，在增加温育时 间后使用多聚甲醛固定细胞。将细胞用洋地黄皂苷透化并生物素化。使 用链霉抗生物素和488标记的抗链霉抗生物素抗体检测 TSI。通过高内涵筛选监测TSI向内体内的积聚和内体逃逸。抑制剂的 效应通过与不与抑制剂温育的对照细胞相比内体逃逸速率下降来评价。

实施例6

将表达大鼠GHRH-R的GH3细胞接种到96孔板中并温育过夜。将细 胞在以下条件下温育60分钟:(B)存在和(A)不存在3μΜ含GHRH靶向 部分的TSI。将细胞固定并用针对TSI的轻链的兔抗体和山羊抗兔 Alexa488探测。使用Hoescht染色对核进行染色。

(A)核显示为浅灰色，没有检测到点状白斑。

(B)核显示染成浅灰色(图2)。

实施例7

将表达大鼠GHRH-R的GH3细胞接种到96孔板中并温育过夜。将细 胞与增加浓度的含GHRH靶向部分的TSI温育60分钟。将细胞固定并用 针对TSI的轻链的兔抗体和山羊抗兔Alexa488探测。通过高 内涵筛选测量内体斑点计数。数据为均值±s.e.(一式三份进行的三 次试验中获得的均值)(图3)。

实施例8

将分散的大鼠垂体细胞培养5天并在以下条件下温育60分钟：(B) 存在和(A)不存在1μΜ含GHRH靶向部分的TSI。将细胞固定并用针对 TSI的轻链的兔抗体和山羊抗兔Alexa488探测。使用 Hoescht染色进行核染色。A)核显示为浅灰色，没有检测到点状白斑。 B)核显示染成浅灰色。白色点状斑点表明内体中存在TSI的轻链(图 4)。

实施例9

将分散的大鼠垂体细胞培养5天，一式三份与增加浓度的具有GHRH 靶向部分的TSI或相应的未配体化TSI温育60分钟。将细胞固定并用 针对TSI的轻链的兔抗体和山羊抗兔Alexa488探测。内体斑 点计数通过高内涵筛选来测量。显示的数据为均值±s.e.(一次试验 中获得的一式三份的均值)(图5)。

实施例10

将表达大鼠GHRH-R的GH3细胞接种到96孔板中并温育过夜。将细 胞一式三份与1μΜ具有GHRH靶向部分的TSI温育增加的时间段，此 后将细胞固定并用针对TSI的轻链的兔抗体和山羊抗兔Alexa488探测。将细胞与TSI连续温育或用TSI脉冲30分钟，然后清洗， 之后将其温育增加的时间段(30，90，150分钟)。在这些时间点，将 细胞固定并随后用针对D的轻链的抗体探测。内体斑点计数通过高内涵 筛选来测量。数据为均值±s.e.(一式三份进行的三次试验中获得的 均值)(图6)。

实施例11

将表达人EGFR的HT-1080细胞接种在96孔板中并在以下条件下温 育60分钟：(B)存在和(A)不存在2μΜ含EGFR靶向部分的TSI。将细 胞固定并用针对TSI的轻链的兔抗体和山羊抗兔Alexa488探 测。使用Hoescht染色进行核染色。(A)核显示为浅灰色，没有检测到 点状白斑。(B)核显示染成浅灰色。白色点状斑点表明内体中存在TSI 的轻链(图7)。

实施例12

将表达GHRHR的CHO-K1细胞接种到96孔板中并温育过夜。将细胞 一式三份地与增加浓度的具有GHRH靶向部分以及血清型A肉毒杆菌神 经毒素的易位和轻链结构域的TSI温育30分钟。将细胞固定，用洋地 黄皂苷透化，并用针对TSI的轻链的兔抗体和山羊抗兔488探测。通过高内涵筛选测量每个细胞的囊泡计数。显示的数据为均 值±s.e.(一式三份进行的三次试验的均值)(图8)。