包含嵌合巨细胞病毒启动子和增强子序列的表达载体

摘要

本发明涉及用于在哺乳动物细胞中异源表达感兴趣的核酸序列的表达载体，所述载体包含可操作地连接至待表达的核酸序列的嵌合启动子调控序列，其中所述嵌合启动子调控序列包含源自鼠巨细胞病毒或人巨细胞病毒的并且可操作地连接至待表达的核酸序列转录起始位点的巨细胞病毒启动子序列；还包含源自人和/或猴巨细胞病毒的巨细胞病毒上游区和/或增强子序列，其中所述上游区和/或增强子序列位于鼠或人启动子序列的5’并且可操作地连接至鼠或人启动子序列，并且其中所述嵌合启动子调控序列包含源自鼠巨细胞病毒、人巨细胞病毒和猴巨细胞病毒中至少两种的序列元件。在具体的实施方式中，所述嵌合启动子调控序列包含源自鼠或人巨细胞病毒IE1启动子和源自人和/或猴巨细胞病毒IE1区的序列元件。本发明还涉及转染有这种表达载体的哺乳动物宿主细胞、一种通过采用这种表达载体用于在哺乳动物宿主细胞中异源表达核酸序列的方法、以及这种表达载体用于异源表达核酸序列的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及哺乳动物表达系统，以及尤其涉及用于在哺乳动物细胞中异源表 达感兴趣的核酸序列的包含嵌合启动子调控序列的表达构建体。嵌合启动子调控 序列由源自鼠或人巨细胞病毒的启动子序列和源自人和/或猴巨细胞病毒的上游区 和/或增强子序列组成，只要该序列元件源自至少两种不同的巨细胞病毒种。

背景技术

使用包括原核和真核细胞的各种遗传工程改造的有机体生产用于基础研究、 诊断和治疗应用的重组(多)肽和蛋白，如抗体分子、疫苗、激素和生长因子。 然而，绝大多数的重组肽或蛋白涉及翻译后修饰，当使用原核宿主细胞时翻译后 修饰不能被模拟或再造。出于这个原因，已证明哺乳动物基因表达系统代表了一 个优选的选择。

基于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的哺乳动物表达系统被广泛地应用在重组蛋 白生产中。除了淋巴细胞系，CHO细胞代表一些细胞类型中的一种，这些细胞类 型允许简单有效的高密度悬浮分批培养动物细胞。此外，使用CHO细胞导致高的 产物产量，而淋巴细胞更难于以工业规模培养。鉴于重组生产多肽和蛋白可观的 成本，将每生物反应器运行的重组蛋白产量最大化同样至关重要。那些对产物产 量有相当大影响的过程参数包括尤其是细胞培养条件、待表达的核酸(基因)的 拷贝数、这些基因被转录和相应的mRNA被翻译的效率、mRNA稳定性等。

因此，控制基因表达的调控遗传元件的强度或转录活性的改进构成了为增加 所生产的重组蛋白产量特别关键的因素。即使是转录活性在单细胞水平上小的增 量增加将最终转化为高密度工业规模分批培养中产物产量相当大的改善。

哺乳动物基因表达系统的绝大多数使用在源自病毒的启动子调控序列控制下 编码待表达的异源核酸序列的表达载体。在这些表达盒中两个最常用的病毒调控 元件是人巨细胞病毒(hCMV)即早期基因1和2(IE1和IE2)的那些。然而，与 使用hCMV IE1和IE2调控元件相关联的一个缺点是它们显著的物种特异性。

美国专利5,866,359公开可通过在弱启动子的控制下共表达腺病毒E1A蛋白改 善来自此类hCMV启动子的基因表达。E1A是一种多功能转录因子，它可以作用 于细胞周期调控，并且具有独立的转录激活和抑制功能结构域二者。E1A表达的 微调对于实现基因反式激活和对细胞周期进展的任何负面影响之间理想平衡是重 要的。然而，E1A表达的过表达可降低细胞合成感兴趣的重组蛋白的能力。

美国专利5,591,639描述了表达载体，其包含待表达的异源核酸序列的上游 (5')、增强子、启动子和含有内含子A(即第一天然内含子)的人巨细胞病毒 (hCMV-MIE)主要即早期基因的完整5'非翻译区。然而，如果存在该序列(约 2100bp的总长度)的前400bp(5'-端)，则在COS7和CHO两种细胞中观察到不 良的基因表达率(Chapman,B.S等人(1991)Nucl.Acids Res.19,3979-3986)。

鼠巨细胞病毒(mCMV)即早期基因调控元件的转录活性高于hCMV对应部 分的转录活性，而不表现出人序列所观察到的明显物种偏好(Addison,C.L等人 (1987)J.Gen.Virol.78,1653-1661)。

然而，试图通过插入mCMV IE启动子下游(3')的鼠主要即早期基因的天然 第一内含子来提高mCMV IE启动子调控元件(类似于hCMV的对应部分)活性 的尝试失败了(尤其参考欧洲专利1 525 320 B1)。然而，产生包含嵌合盒的表达 载体导致和使用完整人序列时不相上下的产物产量，其中嵌合盒由mCMV IE1的 调控元件和人主要即早期基因的天然第一内含子组成(参见，例如WO 2006/111387 A2)。对于包含mCMV IE2调控序列的表达载体也获得了类似的基因表达率(尤 其参见EP专利1 601 776 B1)。

因此，仍然需要产生高产量的所生产的重组多肽或蛋白的改善的哺乳动物基 因表达系统。特别是，需要克服上述局限性的哺乳动物基因表达系统，即这样的 表达系统基于所述mCMV或hCMV启动子序列，但是比现有系统实现更高的表达 率(以及因此，产物产量)。

因此，本发明的一个目的是提供这样的基因表达系统，主要是适合的表达构 建体和相应的哺乳动物宿主细胞。

发明内容

一方面，本发明涉及一种用于在哺乳动物细胞中异源表达感兴趣的核酸序列 的表达载体，所述载体包含可操作地连接至第一待表达的核酸序列的第一嵌合启 动子调控序列，其中所述嵌合启动子调控序列包含：

(i)启动子序列，其源自鼠巨细胞病毒或源自人巨细胞病毒，并且可操作地连 接至待表达的核酸序列的转录起始位点；以及

(ii)上游区和/或增强子序列，其源自人和/或猴巨细胞病毒，其中所述上游区 和/或增强子序列位于鼠或人启动子序列的5’并且可操作地连接至鼠或人启动子序 列；并且

其中所述嵌合启动子调控序列包含源自鼠巨细胞病毒、人巨细胞病毒和猴巨 细胞病毒中至少两种的序列元件。

在具体的实施方式中，启动子序列源自鼠巨细胞病毒IE1启动子；和/或上游 区和/或增强子序列源自人和/或猴巨细胞病毒IE1增强子。

在优选的实施方式中，鼠巨细胞病毒IE1启动子序列具有SEQ ID NO：4的核 苷酸序列。

在其它具体实施方式中，启动子序列源自人巨细胞病毒IE1启动子；和/或上 游区和/或增强子序列源自人和/或猴巨细胞病毒IE1增强子。

在优选的实施方式中，人巨细胞病毒IE1启动子序列具有SEQ ID NO：5的核 苷酸序列。

在其它优选实施方式中，上游区和/或增强子序列包含源自猴巨细胞病毒IE1 区的SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

在尤其优选的实施方式中，嵌合启动子调控序列包含选自SEQ ID NO：7、SEQ  ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12 和SEQ ID NO：13的核苷酸序列。

在其它具体的实施方式中，表达载体还包含可操作地连接至第二待表达的核 酸序列的第二嵌合启动子调控序列，其中第二嵌合启动子调控序列和第一嵌合启 动子调控序列相同。

在替代的具体实施方式中，表达载体还包含可操作地连接至第二待表达的核 酸序列的第二嵌合启动子调控序列，其中第二嵌合启动子调控序列和第一嵌合启 动子调控序列不同。

优选地，所述第一和第二待表达的核酸序列编码不同的多肽。在具体的实施 方式中，不同的多肽代表二聚体或多聚体蛋白的亚基。尤其优选地，所述二聚体 或多聚体蛋白是抗体分子。

另一方面，本发明涉及一种哺乳动物宿主细胞，其转染有本文上述所限定的 表达载体。优选地，所述宿主细胞是CHO细胞。

又一方面，本发明涉及一种用于在哺乳动物宿主细胞中异源表达感兴趣的核 酸序列的方法，其包括：

(i)用本文上述所限定的表达载体转染哺乳动物宿主细胞；以及

(ii)在允许表达所述感兴趣的核酸序列的条件下培养转染的哺乳动物宿主细 胞。

在优选的实施方式中，转染是稳定的转染。

另一方面，本发明涉及本文上述所限定的表达载体用于在哺乳动物宿主细胞 中异源表达感兴趣的核酸序列的用途。

本发明的其它实施方式将通过如下详细的描述变得明显。

附图说明

图1表示用作“亲本载体”用来产生本文所限定的哺乳动物表达载体的表达 载体pRY42(SEQ ID NO：1)。pRY42包含两个用于驱动异源基因表达的调控盒 (分别在“mCMV”和“pA”之间)：位于“Ex2”区3'(即“下游”)的多克隆 位点用于插入待表达的异源核酸序列。调控盒两侧是突变(“F5-mFRT”)和野 生型(“wFRT”)翻转酶识别靶位点。框内起始蛋氨酸密码子已被添加到wFRT 位点的5'端(“ATG+F”)。SV40早期启动子(“SV”)位于ATG+F的5'(“上 游”)。异源核酸序列的转录由鼠巨细胞病毒IE1基因(“mCMV”)的启动子 驱动，鼠巨细胞病毒IE1基因的启动子之后是5'UTR，其中外显子1(“Ex1”) 是鼠(“m”)和人(“h”)CMV衍生序列的杂交体，并且其中外显子2(“Ex2”) 和内含子A序列(“Int A”)源自hCMV序列。β内酰胺酶选择标记基因被表示 为“bla”。pRY42被用作靶载体用于克隆本文所限定的不同嵌合启动子调控序列。

图2表示编码鼠人嵌合单克隆抗体(mAb)cB72.3的轻(“LC”)和重(“HC”) 链的表达载体pRY57(SEQ ID NO：2)(Whittle,N等人(1987)Protein Eng.1, 499-505)，LC和HC分别位于“Ex2”区的3'克隆位点和聚腺苷酸化位点(“pA”) 之间。其他方面，pRY57和pRY42相同。除去pRY57的LC和HC核酸序列并将 其克隆到pRY42变体中，在其中原始的mCMV启动子序列被替换为本文所限定 的不同嵌合启动子调控序列。

图3示意性描绘包含在pRY42(上部)中的原始mCMV启动子序列(SEQ ID  NO：3)以及如本文所限定的5个不同的嵌合启动子调控序列(构建体“1至5”) (分别为SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：11)，其包含位于源自猴(sCMV)和/ 或人(hCMV)CMV的上游区和/或增强子元件3'的鼠CMV(mCMV)启动子序 列。此外，显示了如本文所限定的两个额外的嵌合启动子调控序列(构建体“6和 7”)(SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)，其包含位于源自sCMV和/或人hCMV 的上游区和/或增强子元件3'的hCMV启动子序列。本文所特异性使用的所有 mCMV和hCMV启动子序列在它们的3'-末端包含额外的鸟嘌呤(“G”)核苷酸， 其代表转录起始位点。

图4显示在稳定的CHO系生产的mAb cB72.3的浓度比较，其中所述mAb序 列的基因表达在嵌合构建体1至5的控制下，如图3所示。使用补料分批过生长 (FOG)规程在E250摇瓶培养中的50ml生长介质中生长15天后，通过Protein A  HPLC进行测定。对于每一个嵌合构建体，n＝4，这代表重复补料分批分析用于一 式两份的转染，构建体4例外，其中n＝6(重复FOG分析用于一式三份的转染)， 以及pRY57(原始mCMV)，其中n＝8，组合实验1和2中的数据点。

图5显示在稳定的CHO系生产的mAb cB72.3的浓度比较，其中所述mAb序 列的基因表达在嵌合构建体6和7的控制下，如图3所示。使用分批过生长(BOG) 规程在E125摇瓶培养中的30ml生长介质中生长7天后，通过Protein A HPLC进 行测定。对于mCMV和构建体7，n＝6(重复分批分析用于一式三份的转染)， 以及对于构建体6，n＝4(重复分批分析用于一式两份的转染)。

具体实施方式

本发明是基于意外的发现，即相较于仅仅基于mCMV启动子序列的现有表达 系统，包含嵌合(即杂交体)启动子调控序列的哺乳动物表达载体导致显著改善 的基因表达率，因此还导致所生产的重组蛋白更高的产量(高达几乎3倍的增长)， 其中所述嵌合启动子调控序列由可操作地连接至待表达的核酸序列转录起始位点 的mCMV或hCMV启动子序列(尤其是，mCMV或hCMV IE1启动子序列)、以及 位于mCMV或hCMV启动子序列的5'并且可操作地连接至mCMV或hCMV启动子序 列的hCMV和/或sCMV上游区和/或增强子序列(尤其是，hCMV IE1和/或sCMV IE1 启动子序列)组成。

因此，如本文所限定的哺乳动物表达载体代表了用于尤其是在工业规模的重 组蛋白生产的优越分子工具。

如下示例性描述的本发明可适当地在不存在任何要素或多个要素、一种或多 种限制的情况下得以实施，本文没有具体公开。

当术语“包含”用于本说明书和权利要求中时，它不排除其它要素或步骤。 出于本发明的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包含”的优选实施方式。如 果在下文中，一个组被定义为包含至少一定数量的实施方式，这也可以理解为公 开了这样的一个组，其优选仅由这些实施方式组成。

当涉及单数名词时使用不定或定冠词时，例如“一”、“一个”或“该”，除 非另有声明，否则这包含该名词的复数。

在本发明上下文中指明数值时的情况下，技术人员将理解，在精度区间范围 内可确保所讨论的特征的技术效果，其通常包含给定数值±10％以及优选±5％的 偏差。

此外，在说明书和权利要求中术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c) 等用于区分相似的要素，而不一定用于描述顺序或时间顺序。应当理解，如此使 用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明实施方式能够按照 不同于本文所描述或说明的其它顺序来操作。

术语的进一步定义将在如下术语所使用的上下文中给出。提供以下术语或定 义仅仅是为了帮助理解本发明。这些定义不应当被解释为具有小于本领域普通技 术人员所理解的范围。

一方面，本发明涉及一种用于在哺乳动物细胞中异源表达感兴趣的核酸序列 的表达载体，所述载体包含可操作地连接至第一待表达的核酸序列的第一嵌合启 动子调控序列，其中所述嵌合启动子调控序列包含：

(i)启动子序列，其源自鼠巨细胞病毒或人巨细胞病毒，并且可操作地连接至 待表达的核酸序列转录起始位点；以及

(ii)上游区和/或增强子序列，其源自人和/或猴巨细胞病毒，其中所述上游区 和/或增强子序列位于鼠或人启动子序列的5’并且可操作地连接至鼠或人启动子序 列，并且

其中所述嵌合启动子调控序列包含源自鼠巨细胞病毒、人巨细胞病毒和猴巨 细胞病毒中至少两种的序列元件。

换句话说，提供了如本文所限定的嵌合启动子调控序列，其包含源自鼠巨细 胞病毒、人巨细胞病毒和猴巨细胞病毒中至少两种的序列元件，确保所要求保护 的主题内容不包括任何仅源自人巨细胞病毒的构建体。

如本文所使用的术语“表达载体”是指一种核酸载体(质粒)，其特征在于 存在至少一个“表达盒”。如本文使用的术语“表达盒”是指一种遗传构建体， 其能够允许感兴趣的核酸序列(即“异源”核酸序列)的基因表达。这需要这样 的表达盒包含含有关于转录和/或翻译调控信息的调控序列元件，并且这样的调控 序列被“可操作地连接”到感兴趣的核酸序列。可操作的连接是这样一种连接， 其中所述调控序列元件和待表达的核酸序列以能够进行基因表达的方式连接。

用于控制和驱动基因表达所必需的“表达盒”调控区的确切性质，在不同物 种之间有所不同，但一般来说这些区包含启动子调控序列(即位于感兴趣的核酸 序列的5'(“上游”)的序列区)和3'非翻译调控序列(即位于感兴趣的核酸序列 的3'(“下游”)的序列区)。

如本文所用术语“启动子”(也称为“核心启动子”)是指其本身指导转录 起始的序列元件(例如，转录因子和DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、TATA 盒和CAAT序列、和5'-加帽元件)。只要保留或基本上保留(例如，至少70％、至 少80％、至少90％或至少95％的野生型活性，也就是说全长序列的活性)促进转 录起始的这一功能，(天然存在的)野生型启动子序列的任何截短、突变或其它 修饰变体也在上述定义范围内。如本文所用，术语“核心启动子”是指保留启动 子活性的最短长度的序列。如本文所用，启动子序列可操作地连接至待表达的核 酸序列的转录起始位点。

在具体的实施方式中，本发明的表达载体包含(作为表达盒的部分)第一(嵌 合)启动子调控序列(即至少一个这样的序列)，其反过来又包含源自鼠巨细胞 病毒(mCMV)的(核心)启动子序列。这种mCMV启动子序列可操作地连接至 第一待表达的核酸序列的转录起始位点。通常，任何mCMV启动子序列都可以使 用。优选，采用mCMV即早期(IE)基因，如mCMV IE1和mCMV IE2的启动子序 列(Dorsch-Hasler,K等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,8325-8329；Messerle, M等人(1991)J.Virol.65,1638-1643)，尤其优选采用mCMV IE1启动子。

这些和其它mCMV启动子是本领域众所周知的，并且可以很容易地源自保藏 在NCBI病毒基因组数据库中登录号为U68299.1的mCMV基因组 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesHome；Bao,Y等人(2004)J.Virol. 78,7291-7298)。

在本发明具体的实施方式中，包含在表达载体中的mCMV IE1启动子序列具有 SEQ ID NO：3所示的492bp长度的核酸序列：

在优选的实施方式中，包含在表达载体中的mCMV IE1启动子序列具有SEQ  ID NO：4所示的102bp长度的核酸序列(也称为“核心启动子”)：

SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4均在它们各自的3'末端包含额外的鸟嘌呤(“G”) 核苷酸，它代表了转录起始位点。

在其它具体的实施方式中，本发明的表达载体包含(作为表达盒的部分)第 一(嵌合)启动子调控序列(即至少一个这样的序列)，其反过来又包含源自人 巨细胞病毒(hCMV)的(核心)启动子序列。这种hCMV启动子序列可操作地连 接至所述第一待表达的核酸序列的转录起始位点。通常，任何hCMV启动子序列都 可以使用。优选，采用hCMV即早期(IE)基因，如hCMV IE1和hCMV IE2的启动 子序列(You,C.Y等人(1992)Intervirology 34,94-104；Klucher,K.M等人(1993)Mol. Cell.Biol.13,1238-1250)，尤其优选采用hCMV IE1启动子。

这些和其它hCMV启动子是本领域众所周知的，并且可以很容易地源自保藏在 NCBI病毒基因组数据库中登录号为NC_006273的hCMV基因组 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesHome；同上)。

在优选的实施方式中，包含在表达载体中的hCMV IE1启动子序列具有SEQ ID  NO：5所示的117bp长度的核酸序列(也称为“核心启动子”)：

SEQ ID NO：5在其3'末端包含额外的鸟嘌呤(“G”)核苷酸，它代表了转录 起始位点。

此外，表达盒的启动子调控序列通常包含“增强子”序列。如本文所用，术 语“增强子”是指增进、改进或改善核酸序列转录的序列元件，而无论其相对于 待表达的核酸序列的位置和方向。增强子可以增强来自单一启动子的转录，或者 同时增强来自一个以上的启动子的转录。只要保留或基本上保留(例如，至少70 ％、至少80％、至少90％或至少95％的野生型活性，也就是说全长序列的活性) 改善转录的这个功能，(天然存在的)野生型增强子序列的任何截短、突变或其 它修饰变体也在上述定义范围内。

本发明的表达载体(作为表达盒的部分)在其各自的第一(嵌合)启动子调 控序列中包含源自人巨细胞病毒(hCMV)和/或猴巨细胞病毒(sCMV)的上游区 (序列)和/或增强子序列。换句话说，该启动子调控序列可包含只源自hCMV的 上游区和/或增强子序列，或者只源自sCMV的上游区和/或增强子序列，或者由源 自hCMV和sCMV的序列组成的嵌合上游区和/或增强子序列。启动子调控序列中， 上游区和/或增强子序列位于mCMV或者hCMV(核心)启动子序列的5'(即“上游”)， 并且可操作地连接至鼠或人启动子序列。典型地，所述增强子序列和启动子序列 按相同的方向排布。然而，在具体的实施方式中，上游区和/或增强子序列相对于 启动子序列而言按相反的方向排布。

通常，hCMV和/或sCMV序列可用作上游区和/或增强子序列。优选，采用hCMV 和/或sCMV即早期(IE)基因，如hCMV IE1、hCMV IE2、sCMV IE1和sCMV IE2 的序列(Meier,J.L.和Stinski,M.F.(1996)Intervirology 39,331-342；Kim,G.Y等人 (2011)Biotechnol.Lett.33,1319-1326)，尤其优选hCMV和/或sCMV IE1增强子序 列。

因此，本发明的表达载体包含嵌合的第一启动子调控序列，在第一启动子调 控序列中包含mCMV启动子序列或hCMV启动子序列与hCMV和/或sCMV上游区 和/或增强子序列的组合。在具体的实施方式中，启动子序列源自mCMV IE1启动 子；和/或上游区和/或增强子序列源自hCMV和/或sCMV IE1增强子。在其它具体 的实施方式中，启动子序列源自mCMV IE1启动子；和/或上游区和/或增强子序列 源自hCMV和/或sCMV IE2增强子。在其它具体的实施方式中，启动子序列源自 hCMV IE1启动子；和/或上游区和/或增强子序列源自hCMV和/或sCMV IE1增强 子。在其它具体的实施方式中，启动子序列源自hCMV IE2启动子；和/或上游区和 /或增强子序列源自hCMV和/或sCMV IE2增强子。

这些和其它hCMV和/或sCMV序列是本领域众所周知的，并且可以很容易地源 自保藏在NCBI病毒基因组数据库中登录号分别为X17403.1和U38308.1的hCMV和 sCMV基因组。

在进一步优选的实施方式中，上游区的序列包含源自sCMV IE1增强子区的 SEQ ID NO：6所示452bp长度的核苷酸序列。

在这些优选实施方式的某些中，SEQ ID NO：6的核酸序列是源自sCMV IE1 区的较长序列元件的整合部分(参见，例如SEQ ID NO：11)。在这些优选实施方 式的其它中，源自sCMV IE1区的序列元件具有SEQ ID NO：6的序列，其和源自 hCMV IE1区的其它序列元件组合存在(参见，例如SEQ ID NO：10)。

在特别优选的实施方式中，嵌合启动子调控序列包含选自SEQ ID NO：7、SEQ  ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、 和SEQ ID NO：13的核苷酸序列。

根据SEQ ID NO：7的嵌合启动子调控序列(本文中也称作“构建体1”)具有 1074bp的总长度，并且由582bp的hCMV IE1上游和mCMV IE1增强子序列(斜体 显示)和492bp的mCMV IE1启动子序列(也显示为SEQ ID NO：3)组成。

根据SEQ ID NO：8的嵌合启动子调控序列(本文中也称作“构建体2”)具有 1128pb的总长度，并且由包括hCMV IE1上游序列和hCMV IE1增强子序列的1026 bp序列(斜体显示)和102bp的mCMV IE1“核心”启动子序列(也显示为SEQ ID  NO：4)组成。

根据SEQ ID NO：9的嵌合启动子调控序列(本文中也称作“构建体3”)具有 509pb的总长度，并且由407bp的hCMV IE1增强子序列(斜体显示)和102bp的 mCMV IE1“核心”启动子序列(也显示为SEQ ID NO：4)组成。

根据SEQ ID NO：10的嵌合启动子调控序列(本文中也称作“构建体4”)具 有961pb的总长度，并且由452bp的sCMV IE1上游序列(粗体显示；SEQ ID NO： 6)、407bp的hCMV IE1增强子序列(斜体显示)和102bp的mCMV IE1“核心” 启动子序列(也显示为SEQ ID NO：4)组成。

根据SEQ ID NO：11的嵌合启动子调控序列(本文中也称作“构建体5”)具 有909bp的总长度，并且由包含sCMV IE1上游区的元件和sCMV IE1增强子序列的 807bp序列(粗体显示；下划线为SEQ ID NO：6)和102bp的mCMV IE1“核心” 启动子序列(显示为SEQ ID NO：4)组成。

根据SEQ ID NO：12的嵌合启动子调控序列(本文中也称作“构建体6”)具 有976bp的总长度，并且由452bp的sCMV IE1上游区(粗体显示)、407bp的hCMV  IE1增强子序列(斜体显示)和117bp的hCMV“核心”启动子序列(显示为SEQ ID  NO：5)组成。

根据SEQ ID NO：13的嵌合启动子调控序列(本文中也称作“构建体7”)具 有924bp的总长度，并且由807bp的sCMV IE1上游区和增强子序列(粗体显示；该 部分也包括在“构建体4”中，下划线显示)和117bp的hCMV“核心”启动子(显 示为SEQ ID NO：5)组成。

在具体的实施方式中，嵌合启动子调控序列由hCMV和/或sCMV IE2上游区和/ 或增强子序列和mCMV IE2启动子序列组成。在其它具体的实施方式中，嵌合启动 子调控序列由hCMV和/或sCMV IE2上游区和/或增强子序列和hCMV IE2启动子序 列组成。在其它具体的实施方式中，嵌合启动子调控序列由hCMV和/或sCMV IE1 上游区和/或增强子序列和mCMV IE2启动子序列组成。在其它具体的实施方式中， 嵌合启动子调控序列由hCMV和/或sCMV IE1上游区和/或增强子序列和hCMV IE2 启动子序列组成。在其它具体的实施方式中，嵌合启动子调控序列由hCMV和/或 sCMV IE2上游区和/或增强子序列和mCMV IE1启动子序列组成。在其它具体的实 施方式中，嵌合启动子调控序列由hCMV和/或sCMV IE2上游区和/或增强子序列和 hCMV IE1启动子序列组成。

如本文所限定的“表达盒”的3'-调控序列通常包含参与转录终止、聚腺苷酸 化等的调控元件。然而，如果这些终止序列在特定宿主细胞中的功能不令人满意， 那么它们可能会被细胞内的信号功能所替代。

包含在这样的“表达盒”中其它调控元件尤其包含内部核糖体进入位点(IRES； 允许“多顺反子”核酸序列的表达)、以及用于将天然多肽靶向至宿主细胞的特 定区室的翻译信号序列。适合于CHO细胞的示例性信号序列已被公开，例如在 WO2008/148519A2中。技术人员也很清楚所有这些调控元件，以及如何选择适合 于在特定细胞环境中表达核酸序列的这样的元件。

本发明的表达载体可以是，例如质粒、粘粒、噬菌粒、人工染色体、或其他 遗传工程常用的载体。

除了一个或多个包含上述调控序列的“表达盒”以外，这种表达载体通常包 含一个或多个为了便于插入和/或去除核酸序列的多个克隆位点。多克隆位点可位 于上述表达盒的上游和下游，因此允许置换整个盒。多克隆位点也可以位于这样 的表达盒之内，在启动子调控序列的下游和3'-调控序列的上游，从而允许待表达 的核酸序列的插入或置换。对于稳定转染(参见下面)，表达载体可以进一步包 含位点特异性的整合酶或重组酶的识别序列以便于在宿主细胞基因组中的重组和 稳定整合。

此外，如本文所限定的表达载体通常包含至少一个复制原点以及源自和所用 宿主细胞相兼容的物种的控制序列，以确保表达载体的自主复制/附加体(episomal) 维持(尤其为了用于瞬时转染时；参见下文)。哺乳动物中示例性复制原点包括 SV40或和EBV复制原点。包含多于一个复制原点的专门设计的表达载体(即穿梭 载体)允许在不同宿主之间穿梭，比如细菌和动物细胞之间穿梭。对于原核细胞 适合的复制原点包括例如ColE1和M13复制原点。

此外，如本文所限定的表达载体可包含一个或多个赋予被转染细胞可选择表 型的选择标记。合适的选择标记尤其包含潮霉素B磷酸酶基因、胸苷激酶基因、鸟 氨酸脱羧酶基因、二氢叶酸还原酶基因和谷氨酰胺合酶基因。优选，采用谷氨酰 胺合酶(GS)基因(Cockett,D.K等人(1990)Bio/Technology 8,662-667；Bebbington, C.R等人(1992)Bio/Technology 10:169-175)。

在本领域中已经充分建立了可用于设计和/或改变重组表达载体的许多方法 (参见例如Sambrook,J.,和Russel,D.W.(2001),Molecular cloning:A laboratory  manual(第三版)Cold Spring Harbor,NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press； Ausubel,F.M等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Wiley&Sons, Hoboken,NJ,USA)。大量适合的哺乳动物表达载体也可以市售获得，并且是技术 人员熟知的，技术人员还能够确定哪种载体适于在给定的设置下表达感兴趣的核 酸分子。这种载体的实例尤其包括pcDNA3、pFRT、pTARGET、pSV2-dhfr以及载 体pRY42(SEQ ID NO：1)和pRY57(SEQ ID NO：2)的衍生物，如下文描述。

通过采用本发明的表达载体表达的核酸序列可以是单顺反子(即编码包括融 合蛋白的单个多肽或蛋白)或多顺反子(即编码两个或更多个单独的多肽或蛋白)。

在具体的实施方式中，表达载体包含可操作地连接至(第一)待表达的核酸 序列的单个(即第一)嵌合启动子调控序列。

在其它具体的实施方式中，表达载体还包含可操作地连接至第二待表达的核 酸序列的第二嵌合启动子调控序列，其中所述第二嵌合启动子调控序列与第一嵌 合启动子调控序列相同。例如，第一和第二嵌合启动子调控序列由hCMV/sCMV IE1 上游区和/或增强子序列组合mCMV IE1或hCMV IE1启动子序列而组成。

在替代的具体实施方式中，表达载体还包含可操作地连接至第二待表达的核 酸序列的第二嵌合启动子调控序列，其中第二嵌合启动子调控序列与第一嵌合启 动子调控序列不同。例如，第一嵌合启动子调控序列由hCMV和/或sCMV IE2上游 区和/或增强子序列和mCMV IE2或hCMV IE2启动子序列组成，而第二嵌合启动子 调控序列由hCMV和/或sCMV IE1上游区和/或增强子序列和mCMV IE1或hCMV  IE1启动子序列组成。

在具体的实施方式中，表达载体包含可操作地连接至第三待表达的核酸序列 的第三嵌合启动子调控序列，其中第三嵌合启动子调控序列可以与第一和/或第二 启动子调控序列相同，或者可以不同于第一和第二嵌合启动子调控序列。在其它 具体实施方式中，表达载体包含多于三个的嵌合启动子调控序列。

通过采用本发明的表达载体所表达的核酸序列可编码任何感兴趣的多肽或蛋 白，尤其是具有诊断或治疗应用性的多肽或蛋白，尤其例如生长因子、细胞因子 (干扰素、白细胞介素)、激素、酪氨酸激酶、受体(GPCR)，整合素、转录因 子、血液凝固因子、单链抗体、抗体片段或抗体样分子(anticalin)等。

本文所限定的表达载体包含两个嵌合启动子调控序列(作为表达盒的一部分) 的情况下，待表达的第一和第二核酸序列编码不同的多肽(或蛋白)。在具体的 实施方式中，不同的多肽代表二聚体或多聚体蛋白的亚基，尤其例如同聚或异聚 受体分子、肽激素、DNA/RNA聚合酶、血红蛋白、疫苗等。

在特别优选的实施方式中，二聚或多聚蛋白是包含作为第一亚基的轻链和作 为第二亚基的重链的“经典”抗体分子。抗体分子可以是天然存在的或经遗传改 造的抗体，无论是全长抗体或其截短的变体(例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段)。尤其优选IgG免疫球蛋白抗体。根据具体的应用，抗体分子可以是嵌合的 (例如，鼠/人)、人源化的或完全人的。

在采用包含两个嵌合启动子调控序列的表达载体的其它实施方式中，第一和 第二待表达的核酸序列编码待分析的“靶蛋白”以及相应的报告蛋白(如绿色荧 光蛋白、萤光素酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、和辣根过氧化物酶)用于监测， 如靶蛋白的细胞定位或功能活性。

当使用表现出不同基因表达率的两个(或更多个)嵌合启动子调控序列时， 可能产生特定摩尔比的相应的兴趣蛋白。

另一方面，本发明涉及一种哺乳动物宿主细胞，其转染有本文上述所限定的 表达载体。

合适的宿主细胞包含任何类型的哺乳动物细胞，该细胞是人或非人来源的。 非人来源的哺乳动物细胞尤其包含源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、猫、狗、猪、 牛、马或猴子的细胞。

合适的哺乳动物宿主细胞包含永生化细胞系，例如人Hela、MRC5成纤维细胞、 983M黑素瘤、HEK293、H9、MCF7、和Jurkat细胞；MDCK狗肾细胞；RF培养的 分离自Sprague-Dawley大鼠的大鼠肺成纤维细胞；小鼠NIH3T3、C127、P815肥大 细胞瘤、MT1A2乳腺腺癌和L细胞；猴COS1和COS7细胞、鹌鹑QC1-3细胞；和中 国仓鼠卵巢(CHO)细胞或细胞系。

在优选的实施方式中，所使用的宿主细胞是CHO细胞或CHO细胞系。

合适的CHO细胞系尤其包括CHO Kl(Tjio,J.T.和Puck,T.T.(1958)J.Exp. Med.108,945-955)、CHO pro3-、CHO DG44、CHO P12、dhfr-阴性DUK-B11(Urlaub, G.和Chasin L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,4216-4220)，并且尤其是 CHOK1SV(瑞士巴塞尔，隆萨有限公司)。CHOK1SV是悬浮液，利用谷氨酰胺 合酶(GS)基因表达系统的适应无蛋白的CHOK1衍生物：在甲硫氨酸亚砜亚胺和 无谷氨酰胺介质的双重选择下获得阳性转染物。

可以从保藏单位比如美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州，马纳萨斯) 或德国微生物菌种保藏中心(德国，不伦瑞克)以及各种商业供应商获得所有这 些宿主细胞或细胞系。同样在本发明范围之内的是原代哺乳动物细胞，即从有机 体(处于任何发育阶段，尤其包括胚细胞、胚胎、幼体阶段和成体)直接获得的 细胞。合适的原代细胞的实例包含心肌细胞、原代肝细胞、成纤维细胞、神经细 胞、以及干细胞。同样在本发明范围之内的是源自原代细胞的永生化的稳定细胞 系。

在一些实施方式中，本发明的宿主细胞构成多细胞有机体的一部分。换句话 说，本发明还涉及包含至少一个本文所限定的宿主细胞的转基因哺乳动物有机体。

本发明内，所引入的表达载体可被繁殖，并作为独立的遗传单位(即附加体) 保持在宿主细胞中(本文中也称为“瞬时转染”)，或载体片段可成为稳定地整 合到宿主细胞的基因组中(本文中也称为“稳定转染”)。这样的重组可通过非 同源重组发生在基因组中的随机位置，或通过同源重组或通过位点特异性整合酶 发生在基因组中的特定位置。优选，载体片段(包含待表达的异源核酸序列)以 单拷贝整合在宿主细胞的基因组中。

为了将本文所限定的表达载体引入哺乳动物宿主细胞，可以采用适合于所使 用的特定细胞类型的任何转染技术。本领域充分建立了许多转染方法，尤其包含 电穿孔、磷酸钙共沉淀法、化学转染(例如，环糊精、DEAE-葡聚糖、聚乙烯亚 胺)、脂质转染、磁转染以及“基因枪”(参见，例如Sambrook,J.,和Russel,D.W. (2001),同上；Ausubel,F.M等人(2001)，同上)。

在另一方面，本发明涉及用于在哺乳动物宿主细胞中异源表达感兴趣的核酸 序列的方法，包括：

(i)用本文上述所限定的表达载体转染哺乳动物宿主细胞；以及

(ii)在允许表达所述感兴趣的核酸序列的条件下培养转染的哺乳动物宿主细 胞。

换句话说，本发明还涉及一种用于在转染有本文所限定的表达载体的哺乳动 物宿主细胞中重组(即异源的)生产感兴趣的多肽或蛋白的方法，其中表达载体 包含编码所述多肽或蛋白的相应核酸序列。可以用单一的表达载体、或者作为共 转染采用两个或更多不同的表达载体进行转染。

正如上面已经概述的，许多方法可用于哺乳动物宿主细胞的瞬时或稳定转染。 在优选的实施方式中，转染是稳定转染以建立连续表达编码兴趣多肽或蛋白的异 源核酸序列的细胞或细胞系。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括收获(和任选纯化)所生产的重组 多肽或蛋白的步骤。根据所述多肽或蛋白的性质，它们会被分泌到细胞培养上清 中、整合在宿主细胞的膜中，或留在胞内区室中。

通常，如果使用单细胞哺乳动物宿主细胞时，本领域技术人员能够恢复到各 种细胞培养条件以允许感兴趣的核酸序列的表达。便利地，通过已建立的技术例 如尤其是用盐或有机溶剂的分级沉淀、离子交换色谱法、凝胶色谱法、尺寸排阻 色谱法、HPLC、亲和色谱法从培养介质、所培养细胞的裂解物或提取物、或从分 离的(生物)膜中收获(和任选纯化)所生产的多肽或蛋白(见，例如，Sambrook, J.,和Russel,D.W.(2001)，同上)。在宿主细胞是多细胞有机体一部分的情况下， 这些细胞的级分可以作为用于分离本发明的肽的来源。

用于上述宿主细胞的适当培养介质和条件，是本领域公知的(参见例如Fresney, R.I.(2000)Culture of Animal cells.A manual(第四版)Wiley-Liss,New York)。根据 使用的宿主细胞的具体生长要求，例如在RPMI 1640介质、Ham氏F12介质或DMEM (Dulbecco氏改良的Eagle介质)中进行哺乳动物细胞培养。作为替代，可以使用 具有降低的血清浓度的生长介质，如OptiMEM。任选地，介质可以补充有10％(v/v) FCS(胎牛血清)、各种生长因子、氨基酸、抗生素、和其它添加剂。特别适于 CHO细胞的细胞培养介质描述于例如EP 0 481 791 B1和EP 1 525 320 B1中。可将转 染的哺乳动物宿主细胞孵育在37℃在5％CO2、水饱和的氛围中。各自的生长介质、 试剂盒和试剂可购自各种供应商。

另一方面，本发明涉及如本文所限定的上述表达载体用于在哺乳动物宿主细 胞中异源表达感兴趣的核酸序列的用途。优选地，感兴趣的核酸序列可以编码用 于诊断或治疗应用的多肽或蛋白。

在优选的实施方式中，表达载体用于两个或更多个感兴趣的核酸序列的共同 表达，其中感兴趣的核酸序列在分开的嵌合启动子调控序列控制下插入到表达载 体中。例如，表达载体可用于表达感兴趣的基因以及用于监测感兴趣的基因的细 胞靶向和/或功能的报告基因。

尤其优选地，表达载体用于两个或更多个感兴趣的核酸序列的共同表达，其 中感兴趣的核酸序列编码二聚或多聚体蛋白的亚基，例如抗体分子的轻链和重链 或疫苗亚基。通过采用产生不同基因表达率的不同嵌合启动子调控序列，本文所 限定的表达载体可用于以特定的(摩尔)比表达两个或更多个感兴趣的核酸序列。

在具体的实施方式中，本文所限定的表达载体用作用于基因治疗的药物(或 作为药物的部分或者试剂盒组件)。

通过附图和以下实施例进一步描述本发明，其完全是为了说明本发明具体实 施方式的目的，并不应当以任何方式解释为限制本发明的范围。

实施例

原理:

基于来自鼠、人和猴巨细胞病毒(mCMV、hCMV和sCMV)基因组的序列， 产生权利要求中所描述的七个不同的嵌合启动子调控序列(参见表1，图3)。分 析这些构建体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中控制单克隆抗体轻链和重链(LC和 HC)异源基因表达的效率。

实施例1:载体的构建

基因合成用于产生本文采用的七个不同的嵌合启动子调控构建体(即构建体 “1-7”)。提供构建体准备用于克隆到“空”靶向载体pRY42中(参见图1，SEQ  ID NO：1)以便取代其中包含的原来的鼠巨细胞病毒(mCMV)启动子(SEQ ID  NO：3)。亲本载体pRY42包含两个表达盒，每个在(最初源自mCMV的)启动子 调控序列的控制下。

合成嵌合构建体(参见表1，图3，SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：13)以便在 启动子调控序列两侧的5'和3'末端纳入额外的DNA序列，从而允许并入内切酶限制 性位点(即也存在于pRY42中)以便于替换核酸片段。

表1说明包括在本文所用的嵌合启动子调控构建体1-7中的各序列元件。显示的 是各个调控序列各自的长度和基因组位置，如NCBI病毒基因组数据库中所示 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesHome；Bao,Y等人(2004)J.Virol. 78,7291-7298)。值得注意的是，本文所用的所有mCMV或hCMV启动子序列在它 们的3'末端包括额外的鸟嘌呤(“G”)核苷酸，它代表了转录起始位点。

包含嵌合构建体1-7的各新载体由根据表2所示草案的四路(a four way)连接反 应构建。用于表达抗体轻链核酸序列的嵌合启动子调控序列插入pRY42的突变FRT (翻转酶识别靶)位点(F5-mFRT)的3’(即“下游”)，其随后是链间片段和用 于表达抗体重链核酸序列的嵌合启动子调控序列。

根据制造商的说明使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim，德国)进行连接反应。将所得质粒载体转化入DH5α大肠杆菌感受态细 胞(Invitrogen/Life Technologies GmbH；Darmstadt，德国)。样本涂布到补充有 50μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂上，并在37℃孵育过夜。单个集落 用于接种含有200ml LB液体介质加50μg/ml氨苄青霉素的500ml摇瓶。在振荡培养 箱中在37℃以200rpm过夜孵育烧瓶。根据制造商的说明使用Nucleobond Maxi试剂 盒(Macherey-Nagel GmbH,Düren，德国)将所得培养物用于制备质粒DNA。通过 诊断限制性消化验证所产生的质粒。

表2显示用于产生嵌合启动子调控序列构建体1-5的克隆草案。

在随后的步骤中，IgG4单克隆抗体cB72.3的LC和HC(Whittle,N等人(1987) Protein Eng.1,499-505)被克隆至包含嵌合构建体1-7的七个载体每一个。编码抗 体链的核酸序列作为EcoRI/HindIII(LC)和BamHI/NruI(HC)的限制性片段源 自载体pRY57(图2，SEQ ID NO：2)，并使用相同的限制性内切酶依次克隆至各 个启动子构建体的载体。使用的方法如上所述。分别通过诊断限制性消化和启动 子区的DNA测序验证所得质粒载体。

实施例2：转染和细胞系的构建

源自适于中国仓鼠卵巢细胞系CHOK1SV的悬浮液的细胞系用于所有实验(瑞 士巴塞尔，隆萨有限公司)。在此细胞系中，通过位点特异性整合(SSI)系统的 方式，核酸表达构建体插入在宿主细胞特定的基因组基因座并且以特定的拷贝数 存在。

通过存在于SSI位点的潮霉素B抗性盒的功能恢复来实现整合的阳性选择。表 达构建体整合入宿主基因组中，还除去一个拷贝的胸苷激酶基因，其将前药更昔 洛韦转化成有毒的磷酸化的核苷酸类似物。因此，在细胞系构建期间添加潮霉素B 和更昔洛韦，为靶基因组基因座处的整合分别提供了阳性和阴性选择压力。

宿主细胞系从冻存小瓶中恢复并进行亚培养。在CD-CHO介质(Invitrogen/Life  Technologies GmbH；Darmstadt，德国)中进行所有的细胞培养。转染前48小时， 将细胞以0.3×10⁶细胞/ml的终浓度接种在30ml的CD-CHO介质中。

在转染的当天，沉淀1.2×10⁷细胞并重新悬浮于1ml的CD-CHO中，之后在0.4cm  Bio-Rad GenePulser Xcell比色皿中(单脉冲300V/900μF，时间常数12-16msec)使 用电穿孔同45μg pOG44质粒(Invitrogen/Life Technologies GmbH；Darmstadt，德国) 和5μg各靶载体(分别包含嵌合构建体1-7)进行共转染。pOG44质粒包括针对酵母 FLP重组酶(翻转酶)的表达盒，需要所述酵母FLP重组酶以便于在存在于靶基因 座的FRT位点处的重组。所有的转染实验进行至少一式两份。

每个电穿孔样本转移至T75烧瓶(德国，海德堡，BD Biosciences)中20ml的 CD-CHO介质中，并以静态模式孵育在36.5℃、潮湿培养箱中(5％(v/v)CO₂在空 气中)。转染后48小时沉淀细胞(150×g，5分钟)，并再悬浮在20ml含200μg/ml 潮霉素B(阳性选择)的CD-CHO介质中。培养物保持在静态模式中，并在72小时 后，用含有200μg/ml潮霉素B的新鲜CD-CHO交换介质。

接着，每72小时确定活细胞浓度并且用含有200μg/ml潮霉素B和3μM更昔洛韦 (阴性选择)的20ml新鲜CD-CHO交换介质。一旦在T75烧瓶中的培养物达到9×10⁶细胞/ml的总细胞浓度，将培养物调节至含有200μg/ml潮霉素B和3μM更昔洛韦的 30ml CD-CHO终体积。然后，将各稀释的培养物转移到E125摇瓶。

实施例3：用于确定用“启动子构建体1-5”所产生的单克隆抗体浓度的补料 分批过生长(FOG)悬浮培养

按照国际专利公开WO2008/148519 A2所描述的，进行补料分批过生长(FOG) 摇瓶分析。针对给定的转染细胞悬浮培养物的所有FOG实验进行至少一式两份。

简言之，以2×10⁵细胞/ml的浓度在250ml摇瓶中接种转染的细胞，各摇瓶含有 50ml CM42/SPE生长介质(瑞士巴塞尔，隆萨有限公司)，并在37℃以140rpm在 潮湿的轨道振摇培养箱(5％(v/v)CO₂在空气中)中进行孵育。在培养的第3天开 始，用氨基酸混合物和微量元素组成的补料供给细胞。使用Cedex自动细胞活力分 析仪(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim，德国)确定每天存活率和存活的细胞 浓度。在培养的第15天(“过生长”培养物的收获)，用蛋白A-HPLC确定介质中 的抗体浓度。

实施例4：通过蛋白A-HPLC的方式确定所生产的单克隆抗体的浓度(使用“启 动子构建体1-5”)

在不同嵌合构建体1-5的控制下的、含有LC/HC基因表达盒的各细胞系所产生 的并且分泌到细胞培养介质中的cB72.3IgG4单克隆抗体(mAb)的浓度，通过蛋 白A-高效液相色谱(HPLC)进行确定。无细胞上清(穿过0.22μm过滤器单元)加 载到POROS蛋白A免疫检测柱上(applied Biosystems Inc.,Foster City,Ca,USA)， 该柱连接到Agilent 1200HPLC。洗涤该柱，并且通过降低溶剂的pH值洗脱结合的 mAb。

通过比较用连续稀释的MabSelect SuRe-纯化的(GE Healthcare GmbH，弗莱堡， 德国)cB72.3IgG4所生成的标准曲线(标准曲线范围：1025ng/μl至200ng/μl)确定 mAb的浓度。

上述实验的结果分别总结在表3和图4中：对于本文采用的每个嵌合构建体， n＝4，代表重复FOG分析用于一式两份的转染，构建体4例外，其中n＝6(重复 FOG分析用于一式三份的转染)，以及pRY57(原始mCMV)，其中n＝8，组 合实验1和2中的数据点。按照先前所述(Porter等人(2010)Biotechnol.Progr.26, 1446-1454)进行细胞培养参数的计算。

根据图4，显而易见的是，在培养物收获之日(即第15天)，使用嵌合构建体 no.2-5中任一个导致比使用原始mCMV启动子序列(即载体pRY57)产生更高的抗 体浓度。即使结果没有达到统计学的显著性，使用嵌合构建体no.1也导致比mCMV 启动子更高的抗体浓度(1.31倍)。

用嵌合构建体no.4获得最好的结果，相较于mCMV启动子产生约2.88倍高的基 因表达，其次是(以降序)嵌合构建体no.5(约2.54倍)，嵌合构建体no.2(约1.80 倍)，和嵌合构建体no.3(约1.45倍)。

表3说明本文所用不同转染宿主细胞系(包含嵌合启动子调控序列/构建体

1-5)产生的生长速度和mAb的量。

注：Max.-最大活细胞浓度(10⁶细胞/ml)；μ-特定生长速度(1/h)；IVC -活细胞浓度的时间积分(10⁶细胞·h/ml)；ρ_P-mAb的特定生产速度(pg/细胞·h)； 和[mAb]-收获时产生的mAb浓度(mg/l)

上述数据表明，使用包含组合有mCMV启动子元件的sCMV和/或hCMV上游区 和/或增强子元件的嵌合启动子调控序列代表了对于哺乳动物细胞而言用于获得高 效异源基因表达系统的优良遗传工具。

实施例5：分批过生长(BOG)悬浮培养用于确定通过使用“启动子构建体6-7” 产生的单克隆抗体的浓度

以悬浮模式在含有30mL CD-CHO的透气E125瓶中进行分批培养(Kühner 4层 培养箱，36.5℃，在空气中5％CO₂(v/v)和85％湿度(v/v))。简言之，以2× 10⁵细胞/ml的浓度接种转染的细胞，整个培养过程中监测活细胞浓度。从第七天的 培养物中取介质样本(高培养物活力)用于通过蛋白A HPLC确定介质中cB72.3的 浓度。针对给定的转染细胞悬浮培养物的所有BOG实验进行至少一式两份。

实施例6：通过蛋白A-HPLC的方式确定所生产的单克隆抗体的浓度(使用“启 动子构建体6-7”)

在不同嵌合构建体6-7的控制下、含有LC/HC基因表达盒的自细胞系所产生的 并且分泌到细胞培养介质中的cB72.3IgG4单克隆抗体(mAb)的浓度，通过蛋白 A-高效液相色谱(HPLC)进行确定。无细胞上清(穿过0.22μm过滤器单元)加载 到POROS蛋白A免疫检测柱上(applied Biosystems Inc.,Foster City,Ca,USA)，该 柱连接到Agilent 1100HPLC。洗涤该柱，并且通过降低溶剂的pH值洗脱结合的 mAb。

通过比较用连续稀释的MabSelect SuRe-纯化的(GE Healthcare GmbH，弗莱堡， 德国)cB72.3IgG4所生成的标准曲线(标准曲线范围：1025ng/μl至64ng/μl)确定 mAb的浓度。

上述实验的结果总结在图5中：对于mCMV和构建体7，n＝6(重复分批分析 用于一式三份的转染)，以及对于构建体6，n＝4(重复分批分析用于一式两份的 转染)。

根据图5，显而易见的是，在培养第7天，使用嵌合构建体6和7中任一个导致 比使用原始mCMV启动子序列(即载体pRY57)产生更高的抗体浓度。

用嵌合启动子构建体6获得最好的结果，相较于mCMV启动子产生约2.27倍高 的mAb生产。

上述数据表明，使用包含组合有hCMV核心启动子元件的sCMV和/或hCMV上 游区和/或增强子元件的嵌合启动子调控序列代表了对于哺乳动物细胞而言用于获 得高效异源基因表达系统的优良遗传工具。

可以在缺少任何一个元素或更多元素、一个或更多限定的情况下实施本文所 说明性描述的本发明，而非本文中所具体公开的。因此，例如术语“包含”、“包 括”、“含有”等应当得以广泛而非限制性的解读。此外，本文所用术语和表达 用作描述性而非限制性的术语，并且没有意图采用这种术语和表达排除任何所示 和所述的等同特征或其部分，但是应当认识到在所要求的本发明范围内各种变化 是可行的。因此，应当理解尽管通过实施方式和可选特征具体公开了本发明，其 中所体现的本发明的变化和改变能够被本领域技术人员所采用，并且这种变化和 改变应被认为属于本发明的范围内。

此处宽泛且概括性地描述了本发明。落入上位公开的每个更窄种类和下位分 组也构成本发明的部分。这包括附带条件的或者从某类别中除去任何主题的否定 式限制的本发明上位描述，而无论被除去的部分是否是本文中所具体陈述的。

其它实施方式属于如下权利要求之内。此外，当以马库什组描述本发明的特 征或方面时，本领域的技术人员将认识到也由此通过马库什组的任何个别成员或 亚组成员描述本发明。