一种左卡尼汀及其盐类产品中右卡尼汀含量的高效液相检测方法

摘要

一种应用于药物检测领域中的一种左卡尼汀及其盐类产品中右卡尼汀含量的高效液相检测方法，该方法采用手性固定相高效液相色谱法,手性固定相选用环糊精及其衍生物键合硅胶填料，使得左卡尼汀、右卡尼汀、左卡尼汀杂质A三种成分的分离效果好、方法重复性及耐用性好；流动相选用三乙胺-醋酸水溶液与乙腈体系,该流动相对手性色谱柱基本无损伤，色谱峰保留时间重复性好，峰型对称。

说明书

    技术领域

本发明涉及药物分析领域中的一种左卡尼汀及其盐类产品中右卡尼汀含量的高效液相检测方法。

背景技术

左卡尼汀(Levocarnitine)，又名左旋肉碱，其化学名为(R)-3-羧基-2-羟基-N，N，N-三甲基-1-丙胺氢氧化物，内盐，是一种国际公认安全无害的营养剂。其盐类常用的有左卡尼汀盐酸盐、左卡尼汀酒石酸盐等。左卡尼汀是哺乳动物能量代谢中必需的体内天然物质，其主要功能是促进脂类代谢。它既能将长链脂肪酸带进线粒体基质，并促进其氧化分解，为细胞提供能量，又能将线粒体内产生的短链脂酰基输出。本品的补充可缓解因其体内缺乏引起的脂肪代谢紊乱、骨骼肌和心肌等组织的功能障碍。卡尼汀有一个手性中心，有两种光学异构体，即左旋体和右旋体，具有生物活性为左旋体，即左卡尼汀，右旋体为右卡尼汀。为保证本品的质量及其安全性，需建立检测方法对右卡尼汀的含量进行控制。目前，关于左卡尼汀及其盐类中右卡尼汀的含量的高效液相检测方法，为将本品衍生后，用C18柱进行色谱分离，检测器为荧光检测器，方法比较复杂且耗时长。因此，研制开发一种简单、省时、适于实时监测左卡尼汀及其盐类产品中右卡尼汀含量的高效液相检测方法一直是亟待解决的新课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种左卡尼汀及其盐类产品中右卡尼汀含量的高效液相检测方法，该方法采用环糊精及其衍生物键合硅胶手性固定相作为色谱柱的填充剂分离左卡尼汀、右卡尼汀及左卡尼汀杂质A，用紫外检测器进行检测。通过该方法检测左卡尼汀及其盐类产品中右卡尼汀含量，右卡尼汀与左卡尼汀之间、左卡尼汀与左卡尼汀杂质A之间均能达良好分离，方法重复性、灵敏度、耐用性等均能符合要求，且操作简单、省时快速，适用于左卡尼汀及其盐类产品中右卡尼汀的含量控制。

本发明的目的是这样实现的：一种左卡尼汀及其盐类产品中右卡尼汀含量的高效液相检测方法，该检测方法包括如下步骤：

   （1）色谱条件：

色谱柱：环糊精及其衍生物为填充剂的手性色谱柱；

检测器：紫外检测器；

流动相：由三乙胺-醋酸水溶液和乙腈配制的混合溶液；

（2）系统适用性溶液的制备：

精密称取左卡尼汀对照品、右卡尼汀对照品、左卡尼汀杂质A对照品各适量，加水溶解并稀释；

   （3）供试品溶液及对照溶液的制备：

精密称取样品适量，加水溶解并稀释，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用水稀释，作为对照溶液；

   （4）测定方法：

取系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录图谱，色谱峰按右卡尼汀、左卡尼汀、左卡尼汀杂质A次序依次流出，上述三种成分色谱峰之间分离度均应大于1.5；精密量取供试品溶液与对照溶液，注入液相色谱仪，记录图谱，分别计算供试品液中右卡尼汀的峰面积和对照溶液中左卡尼汀的峰面积，

右卡尼汀%=                                                × 0.5%

   其中：A_右卡尼汀=供试品溶液中右卡尼汀的峰面积；

A_左卡尼汀=对照溶液中左卡尼汀的峰面积。

所述色谱柱的填充剂选自β-环糊精键合硅胶、β-环糊精衍生物键合硅胶，所述β-环糊精衍生物键合硅胶选自乙酰化的β-环糊精键合硅胶、二甲基化的β-环糊精键合硅胶、3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯衍生化的的β-环糊精键合硅胶、2,6-二硝基-4-三氟甲基苯甲醚衍生化的的β-环糊精键合硅胶、（S）-羟丙基醚衍生化的的β-环糊精键合硅胶、（R,S）-羟丙基醚衍生化的的β-环糊精键合硅胶、高效（R,S）-羟丙基醚衍生化的的β-环糊精键合硅胶；所述填充剂的粒径为3.5-10μm；所述三乙胺-醋酸水溶液中三乙胺的体积浓度为0.05-0.6%，pH为4.0-6.5；所述三乙胺-醋酸水溶液的配制方法为量取三乙胺试剂，加水稀释制成体积浓度为0.05-0.6%的溶液，用醋酸水溶液调节pH为4.0-6.5；所述流动相中三乙胺-醋酸水溶液与乙腈的体积比为15-35: 85-65；所述流动相的流速为0.8-1.2ml/分钟,所述系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液的进样量为10-100μl，所述紫外检测器的检测波长为205nm，所述色谱柱的柱温为10-30℃；所述盐类选自盐酸盐、酒石酸盐、富马酸盐，所述左卡尼汀及其盐类产品选自左卡尼汀及其盐类原料药、左卡尼汀及其盐类药物组合物，所述药物组合物选自口服剂型、注射剂型，所述口服剂型选自片剂、胶囊剂、口服溶液剂，所述注射剂型选自注射液、注射用无菌粉末；所述系统适用性溶液详细制备方法为精密称取左卡尼汀对照品约200mg，右卡尼汀对照品约2mg，置同一10ml容量瓶中；另取左卡尼汀杂质A对照品约2mg，精密称定，置200ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为左卡尼汀杂质A对照品溶液；精密量取左卡尼汀杂质A对照品溶液1.0ml置上述10ml容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度；所述左卡尼汀杂质A的英文化学名称为(E)-or(Z)-4-(trimethylammonio)but-2-enoate，结构式如下：

和 (z)-异构体。

本发明的要点在于它的检测方法,该方法采用手性固定相高效液相色谱法, 手性固定相选用环糊精及其衍生物键合硅胶填料，使得左卡尼汀、右卡尼汀、左卡尼汀杂质A三种成分的分离效果好、方法重复性及耐用性好；流动相选用三乙胺-醋酸水溶液与乙腈体系, 该流动相对手性色谱柱基本无损伤，色谱峰保留时间重复性好，峰型对称。

一种左卡尼汀及其盐类产品中右卡尼汀含量的检测方法与现有技术相比，通过该方法检测左卡尼汀及其盐类产品中右卡尼汀的含量，右卡尼汀与左卡尼汀之间、左卡尼汀与左卡尼汀杂质A之间均能达良好分离，方法灵敏度高，可检测出质量含量0.05%的右旋异构体，方法重复性、耐用性等均能符合要求，将广泛的应用于药物分析领域中。

附图说明

图1是系统适用性溶液检测高效液相色谱图

图2是左卡尼汀原料药中右卡尼汀含量检测的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。

实施例一

色谱条件的选择

1检测波长的选择

取左卡尼汀、右卡尼汀、左卡尼汀杂质A适量，加水溶解并稀释制成浓度分别为2mg/ml、2mg/ml及0.02mg/ml的溶液。UV图谱显示，左卡尼汀、右卡尼汀、左卡尼汀杂质A均为末端吸收，为保证检测灵敏度及系统稳定性，考虑到所用溶剂的截止波长，故选择205nm为检测波长。

2 色谱柱的选择

选择正相、反相两种手性色谱柱。用正相手性色谱柱时，三种成分出峰时间都很快且重合在一起无法分离；反相手性色谱柱中β环糊精及其衍生物作为填充剂时效果最好，三种成分的分离、方法重复性及耐用性等最佳。

3 柱温的选择

选择环糊精及其衍生物手性色谱柱最佳的温度使用范围10-30℃。

4流动相的选择

选择磷酸盐--乙腈、三乙胺-醋酸水溶液--乙腈两种流动相体系。用磷酸盐--乙腈体系时，对手性色谱柱损伤较大，各成分保留时间不断提前，且峰产生拖尾；三乙胺-醋酸水溶液--乙腈因无缓冲盐类，对手性色谱柱基本无损伤，色谱峰保留时间重复性好，峰型对称。选择三乙胺-醋酸水溶液--乙腈体系作为流动相。

实施例二

方法学的建立

1专属性试验

精密量取溶剂水及系统适用性试验溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，谱图显示溶剂水无干扰，右卡尼汀与左卡尼汀、左卡尼汀与左卡尼汀杂质A之间分离度均大于1.5。

2 线性范围

精密称取左卡尼汀对照品约0.2114g，置10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液0.1、0.25、0.5、0.75、1.0ml分别置于5个100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标进行线性回归，得回归方程A=403548C-4086.8  r²=0.9994（n=5），结果表明左卡尼汀在0.0211-0.2114mg/ml范围内具有良好的线性关系。

3 耐用性试验

3.1 溶液的稳定性考察

取左卡尼汀原料药样品溶液1份，在室温下放置，分别在0-12小时进行测定，记录右卡尼汀峰面积，结果表明室温放置12小时样品溶液稳定，右卡尼汀峰面积无变化。

3.2不同色谱柱

选择三根不同批号的手性色谱柱进行系统适用性试验并对左卡尼汀原料药样品进行测定，系统适用性试验均符合要求，右卡尼汀测定结果基本一致，结果见表1，从考察结果可知，不同批号的手性色谱柱均满足测定要求。

表1 左卡尼汀中右卡尼汀含量测定不同色谱柱考察结果

Astec CYCLOBONDTMI 2000手性柱为美国SUPELCO公司产品，填充剂为β环糊精。

3.3不同色谱条件考察

适当改变左卡尼汀中右卡尼汀测定时色谱条件，进行系统适用性试验并对左卡尼汀原料药样品进行测定，系统适用性试验均符合要求，右卡尼汀测定结果基本一致，确认的色谱条件的耐用性范围及右卡尼汀测定结果见表2、表3

表2 右卡尼汀检查色谱条件的耐用性

表3 左卡尼汀中右卡尼汀不同色谱条件的测定结果

4 检测限

取左卡尼汀对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释成一系列浓度，精密量取10μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，当信噪比S/N≈3时的进样浓度即为主成分左卡尼汀检测限，此时进样浓度为11μg/ml（相当于主成分左卡尼汀质量含量为0.05%），满足右卡尼汀检测要求。

结果显示，采用环糊精及其衍生物为填充剂的手性色谱柱按上述条件测定左卡尼汀及其盐类产品中右卡尼汀的含量，经验证方法准确可行。

实施例三

样品中右卡尼汀含量的测定

1．色谱条件：

色谱柱：Astec CYCLOBOND^TMI 2000手性柱（250mm×4.6 mm，5μm）；检测波长：205nm ；流动相：三乙胺-醋酸水溶液--乙腈（体积比25∶75）；流速：1.0 ml/分；柱温：10-30℃ ，进样量10μl。

2．相关溶液及流动相的配制：

2.1 相关溶液的配制

2.1.1三乙胺-醋酸水溶液的制备：

   精密量取1.5ml三乙胺试剂，加水900ml，用体积含量50%冰醋酸水溶液调节pH至6.0，再加水至1000 ml；

2.1.2系统适用性溶液的制备

精密称取左卡尼汀对照品0.2056g，右卡尼汀对照品2.45mg，置同一10ml容量瓶中；另取左卡尼汀杂质A对照品2.31mg，精密称定，置200ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为左卡尼汀杂质A对照品溶液。精密量取左卡尼汀杂质A对照品溶液1.0ml置上述10ml容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度；

    2.1.3供试品溶液的制备

精密称取左卡尼汀原料药0.2024g，置10ml容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀；精密称取左卡尼汀片细粉0.4316g，置10ml容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过；精密称取盐酸左卡尼汀原料药0.2443g，置10ml容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀；

2.1.4对照溶液的制备：              

精密量取供试品溶液0.5ml，置100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；

2.2流动相的配制

将上述三乙胺-醋酸水溶液和乙腈按照25:75的体积比例配制，作为流动相。

3．测定方法：

3.1系统性试验

取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，记录图谱，按右卡尼汀、左卡尼汀、左卡尼汀杂质A次序依次流出，右卡尼汀与左卡尼汀色谱峰之间分离度为6.56, 左卡尼汀与左卡尼汀杂质A色谱峰之间分离度为4.00；

右卡尼汀保留时间=10.102分；左卡尼汀保留时间=14.270分；左卡尼汀杂质A保留时间=17.979分

3.2供试样品试验

取上述供试品溶液及对照溶液各10μl分别注入液相色谱仪，记录图谱。

4．计算结果：

      右卡尼汀%= × 0.5%

其中：A_右卡尼汀=供试品溶液中右卡尼汀的峰面积；

A_左卡尼汀=对照溶液中左卡尼汀的峰面积；

左卡尼汀原料药中：右卡尼汀%= × 0.5%= 未检出

左卡尼汀片中：右卡尼汀%=× 0.5%= 未检出

盐酸左卡尼汀原料药中：右卡尼汀%= × 0.5%= 未检出