法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-04-05
授权
授权
2015-08-26
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K16/32 申请日:20130805
实质审查的生效
2015-05-27
公开
公开
发明领域
一般而言，本发明涉及免疫疗法。更特别地，本发明关注靶向抗原的 免疫缀合物和Fc工程化抗体，其作为免疫治疗剂组合使用。另外，本发明 涉及包含所述免疫缀合物和抗体组合的药物组合物及在疾病的治疗中使用 该组合的方法。
发明背景
在多种临床背景中，经常期望选择性破坏个别细胞或特定细胞类型。 例如，癌症治疗的一个主要目的是特异性破坏肿瘤细胞，而使健康细胞和 组织保持完整且未受损。
实现这一点的一种诱人方式诱导针对肿瘤的免疫应答使得免疫效应细 胞诸如天然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击和破坏肿瘤 细胞。效应细胞可通过多种刺激来激活，包括多种细胞因子，它们经由结 合免疫细胞表面上它们的受体来诱导信号传导事件。例如，刺激细胞毒性T 细胞和NK细胞增殖和激活等等的白介素-2(IL-2)已经批准用于治疗转移性 肾细胞癌和恶性黑素瘤。然而，血液清除迅速和缺乏肿瘤特异性要求系统 性施用高剂量的细胞因子以在肿瘤部位实现足够高浓度的细胞因子以激活 免疫应答或具有抗肿瘤效果。这些高系统水平的细胞因子可导致严重的毒 性和不良反应，正如IL-2的情况。为了在癌症治疗中使用，因此想要将细胞 因子特异性投递至肿瘤或肿瘤微环境。这可以通过将细胞因子缀合至靶向 模块，例如对肿瘤抗原特异性的抗体或抗体片段来实现。此类免疫缀合物 的另一个优点是它们与未缀合细胞因子相比延长的血清半衰期。它们在更 低的剂量将肿瘤部位的免疫刺激活性最大化同时保持系统副作用最小的能 力使得细胞因子免疫缀合物成为最佳的免疫治疗剂。
激活效应细胞的另一种方式是经由通过免疫球蛋白的Fc部分或包含Fc 区的重组融合蛋白衔接它们表面上的活化性Fc受体。抗体由其Fc区介导的 所谓效应器功能是基于抗体的癌症免疫疗法中的一种重要作用机制。当结 合至细胞表面的抗体与NK细胞上的Fc受体相互作用时，触发抗体依赖性细 胞介导的细胞毒性，由NK细胞破坏抗体包被的靶细胞(例如肿瘤细胞)。 NK细胞表达FcγRIIIa(CD16a)，其识别IgG1或IgG3亚类的免疫球蛋白。别 的效应器功能包括抗体依赖性细胞介导的吞噬(ADCP)和补体依赖性细胞 毒性(CDC)，而且随抗体的类和亚类而变化，因为不同类型的免疫细胞携 带不同套的Fc受体，它们识别不同型和亚型的免疫球蛋白重链恒定域(例如 α、δ、γ、ε、或μ重链恒定域，分别与IgA、IgD、IgE、IgG、或IgM类抗体 对应)。已经采用多种策略来提高抗体的效应器功能。例如，Shields et al.,J Biol Chem 9(2),6591-6604(2001)显示Fc区位置298、333、和/或334(EU残基 编号方式)处的氨基酸替代改进抗体对FcγIIIa受体的结合和ADCC。例如， 美国专利No.6,737,056；WO 2004/063351；及WO 2004/099249中记载了别的 具有Fc区中的氨基酸修饰且展现改进的Fc受体结合和效应器功能的抗体变 体。或者，可通过改变抗体的糖基化来获得升高的Fc受体结合和效应器功 能。癌症免疫疗法中最常用的抗体，IgGl型抗体具有Fc区每个CH2域中Asn 297处保守的N-连接糖基化位点。两个附着至Asn 297的复合双触角寡糖埋 藏在CH2域之间，形成与多肽骨架的广泛接触，而且它们的存在对于抗体 介导效应器功能(包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))是必须的 (Lifely et al.,Glycobiology 5,813-822(1995)；Jefferis et al.,Immunol Rev 163, 59-76(1998)；Wright and Morrison,Trends Biotechnol 15,26-32(1997))。蛋 白质工程研究显示了FcγR与IgG CH2域的更低铰链区相互作用(Lund et al.,J Immunol 157,4963-69(1996))。然而，FcγR结合也要求存在CH2区中的寡糖 (Lund et al.,J Immunol 157,4963-69(1996)；Wright and Morrison,Trends Biotech 15,26-31(1997))，提示寡糖和多肽二者任一直接促成相互作用位 点，或者维持活性CH2多肽构象需要寡糖。因此可以作为提高IgG1和FcγR 之间相互作用的亲和力，和提高IgG1抗体的ADCC活性的手段来探索对寡 糖结构的修饰。et al.,Nat Biotechnol 17,176-180(1999)及美国专利 No.6,602,684(WO 99/54342)(据此通过提述完整收录其内容)显示催化两 分型寡糖形成的糖基转移酶，β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)在 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过表达显著提高那些细胞中生成的抗体的体 外ADCC活性。生产细胞系中GnTIII的过表达产生两分型寡糖(它们一般也 是非岩藻糖基化且属于杂合型)富集的抗体。如果在GnTIII以外，还在生产 细胞系中过表达甘露糖苷酶II(ManII)，那么获得复合型的两分型、非岩藻 糖基化寡糖富集的抗体(Ferrara et al.,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006))。 两种类型的抗体均显示与具有未修饰聚糖的抗体相比强烈升高的ADCC，但 是只有大多数N-聚糖为复合型的抗体能够诱导显著的补体依赖性细胞毒性 (Ferrara et al.,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006))。ADCC活性升高的关键 因素看来是自寡糖核心最里面的N-乙酰葡糖胺残基消除岩藻糖，这改进IgG Fc域对FcγRIIIa的结合(Shinkawa et al.,J Biol Chem 278,3466-3473(2003))。 别的用于生成具有岩藻糖基化降低的抗体的方法包括例如在α(1,6)-岩藻糖基 转移酶缺陷宿主细胞中表达(Yamane-Ohnuki et al.,Biotech Bioeng 87, 614-622(2004)；Niwa et al.,J Immunol Methods 306,151-160(2006))。
尽管通过使用游离细胞因子、免疫缀合物或工程化抗体在抗癌免疫疗 法中实现了成功，然而癌症疗法持续需要新的有效且安全的治疗选项。
发明概述
本发明人发现，这两种用于局部免疫细胞激活的策略的组合，即细胞 因子免疫缀合物和工程化改造成具有升高的效应器功能的抗体对效应细胞 的同时刺激，大大提高抗癌免疫疗法的功效。
因而，本发明提供(a)包含工程化改造成具有降低的效应器功能的第一 抗体和效应器模块的免疫缀合物，和(b)工程化改造成具有升高的效应器功 能的第二抗体的组合，其用于在有所需要的个体中治疗疾病。在一个实施 方案中，所述效应器模块为细胞因子。在一个实施方案中，所述细胞因子 选自下组：IL-2，GM-CSF，IFN-α，和IL-12。在一个特定实施方案中，所 述效应器模块为IL-2。在另一个实施方案中，所述效应器模块为IL-12。在 另一个特定实施方案中，所述IL-2效应器模块为突变型IL-2效应器模块，其 包含至少一处与非突变型IL-2效应器模块相比降低或消除突变型IL-2效应器 模块对IL-2受体α亚基的亲和力但保留突变型IL-2效应器模块对中间亲和力 IL-2受体的亲和力的氨基酸突变，特别是氨基酸替代。在一个具体实施方案 中，所述突变型IL-2效应器模块在选自与人IL-2(SEQ ID NO：1)残基42、 45、和72对应的位置的一个、两个或三个位置处包含一处、两处或三处氨 基酸替代。在一个更加具体实施方案中，所述突变型IL-2效应器模块在与人 IL-2残基42、45和72对应的位置处包含三处氨基酸替代。在一个甚至更加具 体实施方案中，所述突变型IL-2效应器模块为包含氨基酸替代F42A、Y45A 和L72G的人IL-2。在某些实施方案中，所述突变型IL-2效应器模块在与人 IL-2位置3对应的位置处另外包含氨基酸突变，其消除IL-2的O-糖基化位 点。在一个具体实施方案中，所述突变型IL-2效应器模块包含氨基酸序列 SEQ ID NO：2。在一个实施方案中，所述效应器模块为单链效应器模块。
在一个实施方案中，所述第一抗体是全长IgG类抗体，特别是全长IgG1 亚类抗体。在一个实施方案中，所述效应器模块与所述第一抗体共享氨基 或羧基末端肽键。在一个实施方案中，所述效应器模块与所述第一抗体分 享氨基末端肽键。在一个实施方案中，所述效应器模块在其N末端处融合至 所述第一抗体的重链之一的C末端。在一个特定实施方案中，所述免疫缀合 物包含不多于一个效应器模块。在一个实施方案中，所述免疫缀合物基本 上由通过一个或多个肽接头连接的效应器模块和第一抗体组成。在一个具 体实施方案中，所述免疫缀合物包含效应器模块，特别是单链效应器模 块，和第一抗体，特别是全长IgG类抗体，其中所述效应器模块在其氨基末 端氨基酸处融合至所述第一抗体的重链之一的羧基末端，任选经由肽接 头。在某些实施方案中，所述第一抗体在Fc区中包含促进两条不相同免疫 球蛋白重链异二聚化的修饰。在一个具体实施方案中，所述修饰为节入穴 (knob-into-hole)修饰，包括两条免疫球蛋白重链之一中的节修饰和免疫球 蛋白重链另一中的穴修饰。在一个实施方案中，所述第一抗体包含CH3域 中两条免疫球蛋白重链之间的界面内的修饰，其中i)在一条重链的CH3域 中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一条 重链的CH3域中的界面内生成隆起(protuberance)(“节”(knob))，其可放 置于另一重链的CH3域的界面内的空腔(cavity)(“穴”(hole))中，且ii)在 另一条重链的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残 基替换，由此在第二CH3域中的界面内生成空腔(“穴”)，其内可放置第一 CH3域的界面内的隆起(“节”)。在一个实施方案中，所述第一抗体包含免 疫球蛋白重链之一中的氨基酸替代T366W和任选的氨基酸替代S354C，和免 疫球蛋白重链之另一中的氨基酸替代T366S、L368A、Y407V和任选的 Y349C。在一个特定实施方案中，所述效应器模块融合至包含节修饰的免 疫球蛋白重链的氨基或羧基末端氨基酸。
在一个实施方案中，第一抗体降低的效应器功能选自下组：降低的对 活化性Fc受体的结合，降低的ADCC，降低的ADCP，降低的CDC，和降低 的细胞因子分泌。在一个实施方案中，所述降低的效应器功能为降低的对 活化性Fc受体的结合。在一个实施方案中，所述活化性Fc受体为人受体。 在一个实施方案中，所述活化性Fc受体为Fcγ受体。在一个具体实施方案 中，所述活化性Fc受体选自下组：FcγRIIIa，FcγRI，和FcRγIIa。在一个实 施方案中，所述活化性Fc受体为FcγRIIIa，特别是人FcγRIIIa。在一个实施 方案中，所述降低的效应器功能为降低的ADCC。在一个实施方案中，所述 降低的效应器功能为降低的对活化性Fc受体的结合和降低的ADCC。
在一个实施方案中，通过在Fc区中引入一处或多处氨基酸突变来工程 化改造第一抗体。在一个具体实施方案中，所述氨基酸突变为氨基酸替 代。在一个具体实施方案中，所述第一抗体，特别是人全长IgG1亚类抗 体，在免疫球蛋白重链位置P329处包含氨基酸替代(Kabat编号方式)。在 一个更加具体实施方案中，所述氨基酸替代为P329A或P329G，特别是 P329G。在一个实施方案中，所述抗体在选自免疫球蛋白重链S228、 E233、L234、L235、N297和P331的位置处包含别的氨基酸替代。在一个更 加具体实施方案中，所述别的氨基酸替代为S228P、E233P、L234A、 L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在一个特定实施方案中，所述 抗体在免疫球蛋白重链位置P329，L234和L235处包含氨基酸替代(Kabat编 号方式)。在一个更加特定实施方案中，所述抗体在免疫球蛋白重链中包含 氨基酸替代L234A、L235A和P329G(LALA P329G)。
在某些实施方案中，所述第一抗体针对肿瘤细胞上或肿瘤细胞环境中 存在的抗原。在一个具体实施方案中，所述第一抗体针对选自下组的抗 原：成纤维细胞激活蛋白(FAP)，生腱蛋白-C的A1域(TNC A1)，生腱 蛋白-C的A2域(TNC A2)，纤连蛋白的外域B(EDB)，癌胚抗原(CEA) 和黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。在一个特定实施方案中，所 述第一抗体针对CEA。在另一个特定实施方案中，所述第一抗体针对FAP。
在一个实施方案中，第二抗体升高的效应器功能选自下组：升高的对 活化性Fc受体的结合，升高的ADCC，升高的ADCP，升高的CDC，和升高 的细胞因子分泌。在一个实施方案中，所述升高的效应器功能为升高的对 活化性Fc受体的结合。在一个具体实施方案中，所述活化性Fc受体选自下 组：FcγRIIIa，FcγRI，和FcRγIIa。在一个实施方案中，所述活化性Fc受体 为FcγRIIIa。在一个实施方案中，所述升高的效应器功能为升高的ADCC。 在一个实施方案中，所述升高的效应器功能为升高的对活化性Fc受体的结 合和升高的ADCC。
在一个实施方案中，通过在Fc区中引入一处或多处氨基酸突变来工程 化改造第二抗体。在一个具体实施方案中，所述氨基酸突变为氨基酸替 代。在一个实施方案中，通过在Fc区中修饰糖基化来工程化改造第二抗 体。在一个具体实施方案中，Fc区中的糖基化修饰为与相比非工程化抗 体，Fc区中升高比例的非岩藻糖基化寡糖。在一个甚至更加具体实施方案 中，Fc区中升高比例的非岩藻糖基化寡糖为Fc区中非岩藻糖基化寡糖的至 少20％，优选至少50％，最优选至少70％。在另一个具体实施方案中，Fc区 中的糖基化修饰为与非工程化抗体相比，Fc区中升高比例的两分型寡糖。 在一个甚至更加具体实施方案中，Fc区中升高比例的两分型寡糖为Fc区中 两分型寡糖的至少约20％，优选至少50％，和最优选至少70％。在还有另一 个具体实施方案中，Fc区中的糖基化修饰为与非工程化抗体相比，Fc区中 升高比例的两分型、非岩藻糖基化寡糖。优选地，所述第二抗体在Fc区中 具有至少约25％、至少约35％、或至少约50％的两分型、非岩藻糖基化寡 糖。在一个特定实施方案中，与非工程化抗体相比，所述第二抗体工程化 改造成在Fc区中具有升高比例的非岩藻糖基化寡糖。抗体的Fc区中升高比 例的非岩藻糖基化寡糖导致抗体具有升高的效应器功能，特别是升高的 ADCC。在一个特定实施方案中，所述非岩藻糖基化寡糖为两分型、非岩藻 糖基化寡糖。
在一个实施方案中，所述第二抗体为全长IgG类抗体，特别是全长IgG1 亚类抗体。在某些实施方案中，所述第二抗体针对肿瘤细胞上存在的抗 原。在一个具体实施方案中，所述第二抗体针对选自下组的抗原：CD20， 表皮生长因子受体(EGFR)，HER2，HER3，胰岛素样生长因子1受体 (IGF-1R)，c-Met，含CUB域的蛋白-1(CDCP1)，癌胚抗原(CEA)和 黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。
在一个特定实施方案中，所述第二抗体为工程化改造成与非工程化抗 体相比在Fc区中具有升高比例的非岩藻糖基化寡糖的抗CD20抗体。合适的 抗CD20抗体记载于WO 2005/044859，通过提述将其完整收入本文。在另一 个特定实施方案中，所述第二抗体为工程化改造成与非工程化抗体相比在 Fc区中具有升高比例的非岩藻糖基化寡糖的抗EGFR抗体。合适的抗EGFR 抗体记载于WO 2006/082515和WO 2008/017963，通过提述将其每一篇完整 收入本文。在又一个特定实施方案中，所述第二抗体为工程化改造成与非 工程化抗体相比在Fc区中具有升高比例的非岩藻糖基化寡糖的抗IGF-1R抗 体。合适的抗IGF-1R抗体记载于WO 2008/077546，通过提述将其完整收入 本文。在还有另一个特定实施方案中，所述第二抗体为工程化改造成与非 工程化抗体相比在Fc区中具有升高比例的非岩藻糖基化寡糖的抗CEA抗 体。合适的抗CEA抗体记载于PCT公开文本No.WO 2011/023787，通过提述 将其完整收入本文。在还有另一个特定实施方案中，所述第二抗体为工程 化改造成与非工程化抗体相比在Fc区中具有升高比例的非岩藻糖基化寡糖 的抗HER3抗体。合适的抗HER3抗体记载于PCT公开文本No.WO 2011/076683，通过提述将其完整收入本文。在还有另一个特定实施方案 中，所述第二抗体为工程化改造成与非工程化抗体相比在Fc区中具有升高 比例的非岩藻糖基化寡糖的抗CDCP1抗体。合适的抗CDCP1抗体记载于 PCT公开文本No.WO 2011/023389，通过提述将其完整收入本文。在一个实 施方案中，通过在具有改变的一种或多种糖基转移酶活性的宿主细胞中生 成抗体，将第二抗体工程化改造成与非工程化抗体相比，在Fc区中具有修 饰的糖基化。
在一个实施方案中，通过在具有升高的β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶 III(GnTIII)活性的宿主细胞中生成抗体，将第二抗体工程化改造成与非工 程化抗体相比，在Fc区中具有升高比例的非岩藻糖基化寡糖。在一个特定 实施方案中，所述宿主细胞另外具有升高的α-甘露糖苷酶II(ManII)活性。 在另一个实施方案中，通过在具有降低的α(1,6)-岩藻糖基转移酶活性的宿主 细胞中生成抗体，将第二抗体工程化改造成与非工程化抗体相比，在Fc区 中具有升高比例的非岩藻糖基化寡糖。
在一个实施方案中，所述疾病为通过刺激效应细胞功能能治疗的病 症。在一个实施方案中，所述疾病为细胞增殖病症。在一个特定实施方案 中，所述疾病为癌症。在一个具体实施方案中，所述癌症选自下组：肺 癌，结直肠癌，肾癌，前列腺癌，乳腺癌，头和颈癌，卵巢癌，脑癌，淋 巴瘤，白血病，和皮肤癌。在一个实施方案中，所述个体为哺乳动物。在 一个特定实施方案中，所述个体为人。
在一个特定实施方案中，本发明提供(a)包含通过在Fc区中引入一处或 多处氨基酸突变，工程化改造成具有降低的效应器功能的第一全长IgG类抗 体和细胞因子的免疫缀合物，其中该效应器模块在其氨基末端氨基酸处融 合至该第一抗体的重链之一的羧基末端，任选经由肽接头，和(b)通过Fc区 中的糖基化修饰，工程化改造成具有升高的效应器功能的第二全长IgG类抗 体的组合，其用于在有所需要的个体中治疗疾病。另一方面，本发明提供 一种药物组合物，其在药学可接受载体中包含(a)包含工程化改造成具有降 低的效应器功能的第一抗体和效应器模块的免疫缀合物，和(b)工程化改造 成具有升高的效应器功能的第二抗体。
本发明还涵盖(a)包含工程化改造成具有降低的效应器功能的第一抗体 和效应器模块的免疫缀合物，和(b)工程化改造成具有升高的效应器功能的 第二抗体在制备用于在个体中治疗疾病的药物中的用途。
本发明进一步提供一种在个体中治疗疾病的方法，其包括以治疗有效 量对该个体施用(a)包含工程化改造成具有降低的效应器功能的第一抗体和 效应器模块的免疫缀合物，和(b)工程化改造成具有升高的效应器功能的第 二抗体的组合。
本发明还提供一种在个体中刺激效应细胞功能的方法，其包括以有效 刺激效应细胞功能的量对该个体施用(a)包含工程化改造成具有降低的效应 器功能的第一抗体和效应器模块的免疫缀合物，和(b)工程化改造成具有升 高的效应器功能的第二抗体的组合。
又一方面，本发明提供一种意图用于治疗疾病的试剂盒，其在相同的 容器中或在分开的容器中装有(a)包含工程化改造成具有降低的效应器功能 的第一抗体和效应器模块的免疫缀合物，(b)工程化改造成具有升高的效应 器功能的第二抗体，和(c)任选的包装插页，其包括指导作为治疗疾病的方 法使用该组合治疗的印刷说明书。
要理解，依照本发明的药物组合物中使用的免疫缀合物和第二抗体、 用途、方法和试剂盒可单独地或组合地掺入涉及对本发明有用的第二抗体 和免疫缀合物的前述段落中描述的任何特征。
附图简述
图1。在舌内注射入SCID小鼠的人头和颈癌细胞系FaDu中测试包含不 结合CD25的IL-2四重突变型(qm)的FAP靶向性28H1IgG-IL-2免疫缀合物(a) 或非靶向性DP47GS IgG-IL-2免疫缀合物(b)，和抗EGFR GlycoMab。数据显 示28H1IgG-IL2qm免疫缀合物(而非DP47GS IgG-IL2qm免疫缀合物)和抗 EGFR GlycoMab的组合与单独的相应免疫缀合物或抗EGFR GlycoMab相比 就增强的中值存活而言介导卓越的功效(见实施例1)。
图2。用或不用0.57nM(a)或5.7nM(b)FAP靶向性28H1IgG-IL2qm免疫 缀合物或IL-2(Proleukin)预处理，在不同浓度抗EGFR GlycoMab存在下， PBMC所致总体A549肿瘤细胞杀伤(E:T＝10:1，4小时)(见实施例2)。
图3。在脾内注射入SCID FcγRIII转基因小鼠的人结直肠癌细胞系 LS174T中测试包含不结合CD25的IL-2四重突变型(qm)的CEA靶向性 CH1A1A IgG-IL-2免疫缀合物，和抗EGFR GlycoMab(a)或cetuximab(b)。数 据显示CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab的组合与单独 的相应免疫缀合物、抗EGFR GlycoMab或cetuximab以及CH1A1A IgG-IL2 qm免疫缀合物和cetuximab的组合相比就增强的中值和总体存活而言介导卓 越的功效(见实施例3)。
图4。在静脉内注射入SCID FcγRIII转基因小鼠的人肺癌细胞系A549中 测试包含不结合CD25的IL-2四重突变型(qm)的CEA靶向性CH1A1A IgG-IL-2免疫缀合物，和抗EGFR GlycoMab(a)或cetuximab(b)。数据显示 CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab的组合与单独的相应 免疫缀合物或抗EGFR GlycoMab以及CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和 cetuximab的组合相比就增强的中值和总体存活而言介导卓越的功效(见实施 例4)。
图5。在脾内注射入SCID FcγRIII转基因小鼠的人结直肠癌细胞系 LS174T中测试包含不结合CD25的IL-2四重突变型(qm)的CEA靶向性 CH1A1A IgG-IL-2免疫缀合物，和抗Her3GlycoMab。数据显示CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和抗Her3GlycoMab的组合与单独的相应免疫缀合物 或抗Her3GlycoMab相比就增强的中值存活而言介导卓越的功效(见实施例 5)。
图6。在肾内注射入SCID FcγRIII转基因小鼠的人肾癌细胞系ACHN中 测试包含不结合CD25的IL-2四重突变型(qm)的FAP靶向性28H1IgG-IL-2 免疫缀合物，和抗EGFR GlycoMab。数据显示CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀 合物和抗EGFR GlycoMab的组合与单独的抗EGFR GlycoMab，或与 组合的抗EGFR GlycoMab相比就增强的中值和总体存活而言介导 卓越的功效(见实施例6)。
图7。用单独的抗Her3GlycoMab(左边小图)、单独的CH1A1A IgG-IL-2 qm免疫缀合物(右边小图)或CH1A1A IgG-IL-2qm免疫缀合物与抗Her3 GlycoMab的组合(右边小图)处理后PBMC所致总体LS174T细胞杀伤。
图8。用单独的抗Her3GlycoMab(左边小图)、单独的CH1A1A IgG-IL-2 qm免疫缀合物(右边小图)或CH1A1A IgG-IL-2qm免疫缀合物与抗Her3 GlycoMab的组合(右边小图)处理后NK细胞上的CD25(a)或CD69(b)表达。
发明详述
在第一个方面，本发明提供(a)包含工程化改造成具有降低的效应器功 能的第一抗体和效应器模块的免疫缀合物，和(b)工程化改造成具有升高的 效应器功能的第二抗体的组合，其用于在有所需要的个体中治疗疾病。
本发明进一步提供一种在个体中治疗疾病的方法，其包括以治疗有效 量对该个体施用(a)包含工程化改造成具有降低的效应器功能的第一抗体和 效应器模块的免疫缀合物，和(b)工程化改造成具有升高的效应器功能的第 二抗体的组合。
本发明还提供一种在个体中刺激效应细胞功能的方法，其包括以有效 刺激效应细胞功能的量对该个体施用(a)包含工程化改造成具有降低的效应 器功能的第一抗体和效应器模块的免疫缀合物，和(b)工程化改造成具有升 高的效应器功能的第二抗体的组合。
定义
除非下文另外定义，如本领域中通常使用的那样在本文中使用术语。
如本文中使用的，术语“免疫缀合物”指多肽分子，其包含至少一个效 应器模块和抗体。在某些实施方案中，所述免疫缀合物包含不多于一个效 应器模块。依照本发明的具体免疫缀合物基本由通过一个或多个肽接头连 接的一个效应器模块和抗体组成。依照本发明的具体免疫缀合物是融合蛋 白，即免疫缀合物的组分通过肽键连接。
如本文中使用的，术语“对照抗体”指在没有效应器模块的情况下存在 的抗体。例如，在比较本文所述IgG-IL2免疫缀合物与对照抗体时，对照抗 体为游离IgG，其中IgG-IL2免疫缀合物和游离IgG分子均能特异性结合相同 的抗原性决定簇。
如本文中使用的，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且指多 肽大分子上与抗体结合，从而形成抗体-抗原复合物的位点(例如氨基酸的 连续区段或由不同的非连续氨基酸区构成的构象性构造)。可用的抗原决定 簇可见于例如肿瘤细胞表面上、病毒感染的细胞的表面上、其它患病细胞 的表面上、游离在血液血清中和/或在胞外基质(ECM)中。
“特异性结合”意指结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非 特异性的相互作用区别开来。抗体结合特定抗原决定簇的能力可以经由酶 联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面 等离振子共振技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad et al.,Glyco J 17, 323-329(2000))，以及传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229 (2002))来测量。
术语“抗[抗原]抗体”和“结合[抗原]的抗体指能够以足够亲和力结合相应 抗原，使得该抗体在靶向抗原中可用作诊断剂和/或治疗剂的抗体。在一个 实施方案中，抗抗原抗体对无关蛋白的结合程度小于该抗体对抗原的结合 的约10％，如通过例如放射免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中， 结合抗原的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤ 0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低、例如10-8M至10-13M、例如10-9M至 10-13M)的解离常数(KD)。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗 原)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，如本文中使用的， “结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和受体)之间1:1相互作用的内 在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)来 表述，其为解离与结合速率常数(分别为K解离和K结合)的比率。如此，相等 的亲和力可能包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同。亲和 力可以通过本领域知道的确立方法来测量，包括本文中描述的那些方法。 用于测量亲和力的具体方法是表面等离振子共振(SPR)。
依照一个实施方案，通过表面等离振子共振使用T100仪 (GE Healthcare)于25℃用固定化于CM5芯片上的配体(例如效应器模块受 体、Fc受体或靶抗原)测量KD。简言之，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯 片(CM5，GE Healthcare)依照供应商说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)- 碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。在以10μl/ 分钟的流速注射前，将重组配体用10mM醋酸钠pH 5.5稀释至0.5-30μg/ml 以实现约100-5000响应单位(RU)的偶联蛋白。在注射配体后，注射1M乙 醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将免疫缀合物的3至5倍连续 稀释物(范围为约0.01nM至300nM)在HBS-EP+(GE Healthcare，10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)中于 25℃以约30-50μl/分钟的流速注射。使用简单的1对1Langmuir结合模型 (T100评估软件版本1.1.1)通过同时拟合结合和解离传感图来 计算结合速率(k结合)和解离速率(k解离)。平衡解离常数(KD)计算为比率 k解离/k结合。参见例如Chen et al.,J Mol Biol 293,865-881(1999)。
“降低的结合”，例如降低的对Fc受体或CD25的结合，指相应相互作用 的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为了清楚，该术语还包括亲和力降 低至0(或低于分析方法的检测限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加 的结合”指相应相互作用的结合亲和力的升高。
如本文中使用的，就抗体、效应器模块等而言的术语“第一”和“第二”为 了在有超过一个每类模块时便于区分而使用。除非明确如此陈述，这些术 语的使用不意图赋予免疫缀合物的特定次序或取向。
如本文中使用的，术语“效应器模块”指例如经由信号转导或其它细胞 途径影响细胞活性的多肽例如蛋白质或糖蛋白。因此，本发明的效应器模 块可与受体介导的信号传导关联，该信号传导从细胞膜外部传递信号以调 控携带一种或多种针对该效应器模块的受体的细胞中的应答。在一个实施 方案中，效应器模块能引发携带一种或多种针对该效应器模块的受体的细 胞中的细胞毒性应答。在另一个实施方案中，效应器模块能引发携带一种 或多种针对该效应器模块的受体的细胞中的增殖性应答。在另一个实施方 案中，效应器模块能引发携带针对该效应器模块的受体的细胞中的分化。 在另一个实施方案中，效应器模块能改变携带针对该效应器模块的受体的 细胞中内源性细胞蛋白质的表达(即上调或下调)。效应器模块的非限制性 例子包括细胞因子、生长因子、激素、酶、底物和辅因子。效应器模块可 以以多种构造与抗体联合以形成免疫缀合物。
如本文中使用的，术语“细胞因子”指介导和/或调节生物学或细胞功能 或过程(例如免疫、炎症和造血作用)的分子。如本文中使用的，术语“细 胞因子”包括“淋巴因子”、“趋化因子”、“单核因子”和“白介素”。可用的细 胞因子的例子包括但不限于，GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、 MIP-1β、TGF-β、TNF-α和TNF-β。具体的细胞因子是IL-2和IL-12。如本文 中使用的，术语“细胞因子”还意为包括细胞因子变体，其在相应野生型细 胞因子的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸突变，如例如记载于Sauvé et al.,Proc Natl Acad Sci USA 88,4636-40(1991)；Hu et al.,Blood 101,4853-4861 (2003)及美国专利公开文本No.2003/0124678；Shanafelt et al.,Nature Biotechnol 18,1197-1202(2000)；Heaton et al.,Cancer Res 53,2597-602(1993) 及美国专利No.5,229,109；美国专利公开文本No.2007/0036752；WO 2008/0034473；WO 2009/061853；或上文和下文中的IL-2变体。
如本文中使用的，术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体 的分子。在一个实施方案中，所述效应器模块是单链效应器模块。单链效 应器模块的非限制性例子包括细胞因子、生长因子、激素、酶、底物和辅 因子。当效应器模块是细胞因子且感兴趣的细胞因子正常在自然中以多聚 体发现时，多聚体细胞因子的每个亚基由该效应器模块的单链连续编码。 因此，可用的单链效应器模块的非限制性例子包括GM-CSF、IL-1α、 IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、 IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α和TNF-β。
如本文中使用的，术语“对照效应器模块”指未缀合的效应器模块。例 如，当将本文中描述的IL-2免疫缀合物与对照效应器模块比较时，对照效应 器模块是游离的、未缀合的IL-2。类似地，例如当将IL-12免疫缀合物与对 照效应器模块比较时，对照效应器模块是游离的、未缀合物的IL-12(例如展 现为异二聚体蛋白质，其中p40和p35亚基仅分享二硫键)。
如本文中使用的，术语“效应器模块受体”指能特异性结合效应器模块 的多肽分子。例如，在IL-2是效应器模块的情况中，结合IL-2分子(例如包 含IL-2的免疫缀合物)的效应器模块受体是IL-2受体。类似地，例如在IL-12 是免疫缀合物的效应器模块的情况中，效应器模块受体是IL-12受体。在效 应器模块特异性结合超过一种受体的情况中，所有特异性结合效应器模块 的受体均为该效应器模块的“效应器模块受体”。
术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限 于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体 片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性且包含Fc区或与免疫球蛋白Fc 区等同的区域。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指具有与天然免疫 球蛋白结构实质性相似的结构的抗体。
术语“免疫球蛋白”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，IgG类 的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两 条轻链和两条重链构成。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH，也称为 可变重域或重链可变域)，接着是3个恒定域(CH1、CH2和CH3，也称为重 链恒定区)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL，也称为可 变轻域或轻链可变域)，接着是恒定轻(CL)域(也称为轻链恒定区)。免 疫球蛋白的重链可以归入称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或 μ(IgM)的5类之一，其中一些可以进一步分成亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定 域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以归入称为卡帕(κ)和拉姆达(λ) 的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子 和Fc区组成。
“抗体片段”指完整抗体外的分子，其包含完整抗体中结合与完整抗体 结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、 Fab’-SH、F(ab’)2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)、单域抗 体、和自抗体片段形成的多特异性抗体。对于某些抗体片段的综述，参见 Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见例如 Plückthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；还可参见WO 93/16185；及美国专利No.5,571,894和No.5,587,458。对包含补救受体结合表 位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的论述，参见美国专利 No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价 或双特异性的。参见，例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)；及Hollinger et al.,Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson et al.,Nat Med 9, 129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域、或整个或 部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体 (Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可 以通过各种技术来制备抗体片段，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消 化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中描述 的。
术语“抗原结合域”指包含特异性结合部分或整个抗原且与其互补的区 域的抗体部分。抗原结合域可由例如一个或多个抗体可变域(也称为抗体可 变区)提供。具体地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链 可变区(VH)。
术语“可变区”或“可变域”指牵涉抗体对抗原结合的抗体重链或轻链的 域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结 构，每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见，例 如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91 (2007)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。
如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中序列中高度 可变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。通常，天然的四链 抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、 L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自互补性决定区(CDR)的氨基酸 残基，后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。除了VH中CDR1外， CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为“互补性决 定区”(CDR)，并且在述及形成抗原结合区的可变区部分时这些术语在本 文中可交换使用。此特定区域已由Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)及 Chothia et al.,J Mol Biol 196:901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较 时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一种定义来指抗体或其变体的 CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每 篇参考文献定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下表1中列出作为比较。涵盖 特定CDR的确切残基数将随着CDR的序列和大小而变化。在给定抗体的可 变区氨基酸序列情况下，本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定 CDR。
表1：CDR定义1
1表1中所有CDR定义的编号方式依照由Kabat等提出的编号惯例(见下文)。
2如表1中使用的具有小写字母“b”的“AbM”指由Oxford Molecular的“AbM”抗 体建模软件定义的CDR。
Kabat等还定义针对可变区序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本 领域的普通技术人员可以明确地将此“Kabat编号”系统归入任何可变区序 列，不依赖于序列本身外的任何实验数据。如本文中使用的，“Kabat编号 方式”指由Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)提出的编号系统。除非另外说明， 提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号方式依照Kabat编号系统。
序列表的多肽序列(即SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、等)并不 依照Kabat编号系统编号。然而，本领域中普通技术人员完全能将序列表的 序列编号方式转变成Kabat编号方式。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR 一般由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般 以下列顺序出现在VH(或VL)中： FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗体的“类”指其重链具有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种主要的 类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中数种可以进一步分成亚类(同种 型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类 的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文中术语“Fc区”或“Fc域”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区 的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链 的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或 Pro230延伸至重链的羧基端。然而，可以存在或不存在Fc区的C端赖氨酸 (Lys447)。除非本文中另外指定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式 依照EU编号系统，也称为EU索引，如记载于Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991的。
“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”意图包括免疫球蛋白的Fc区的天然 发生等位变体以及具有产生替代、添加、或删除的改变，但是没有实质性 降低免疫球蛋白介导效应器功能(诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)的 能力的变体。例如，可以在生物学功能没有实质性损失的情况中自免疫球 蛋白Fc区的N端或C端删除一个或多个氨基酸。可以依照本领域中已知的一 般规则来选择此类变体，使得对活性具有最小的影响(参见例如Bowie et al., Science 247,1306-10(1990))。
“促进异二聚化的修饰”是降低或防止多肽(例如免疫球蛋白重链)与相 同多肽联合以形成同二聚体的肽主链操作或多肽的翻译后修饰。如本文中 使用的，具体地，促进异二聚化的修饰包括对期望形成二聚体的两个多肽 中的每一个进行的分开的修饰，其中所述修饰彼此互补，从而促进两个多 肽的联合。例如，促进异二聚化的修饰可以改变期望形成二聚体的一个或 两个多肽的结构或电荷，从而在立体或静电上分别促进它们的联合。异二 聚化在两个不相同的多肽如两个免疫球蛋白重链之间发生，其中与每个重 链融合的别的免疫缀合物组分(例如效应器模块)是不相同的。在本发明的 免疫缀合物中，促进异二聚化的修饰在免疫球蛋白的重链中，具体在Fc区 中。在一些实施方案中，促进异二聚化的修饰包含氨基酸突变，具体为氨 基酸取代。在一个具体的实施方案中，促进异二聚化的修饰包含两个免疫 球蛋白重链的每一个中分开的氨基酸突变，具体为氨基酸取代。
术语“效应器功能”在提及抗体使用时指那些可归于抗体Fc区且随抗体 同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体 依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复 合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)下 调和B细胞活化。
如本文中使用的，术语“效应细胞”指如下的一群淋巴细胞，它们在它 们的表面上展示效应器模块受体(例如细胞因子受体)和/或Fc受体，它们经 由所述受体结合效应器模块(例如细胞因子)和/或抗体的Fc区并促成对靶细 胞(例如肿瘤细胞)的破坏。例如，效应细胞可介导细胞毒性或吞噬效应。 效应细胞包括但不限于效应T细胞诸如CD8+细胞毒性T细胞、CD4+辅助T细 胞、γδT细胞、NK细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞和巨噬细胞/单 核细胞。根据它们的受体表达样式，可以有不同子集的效应细胞，即(a)表 达特定效应器模块的受体但不表达Fc受体且受本发明免疫缀合物刺激但不 受本发明抗体刺激的细胞(例如表达IL-2受体的T细胞)；(b)表达Fc受体但 不表达特定效应器模块的受体且受本发明抗体刺激但不受本发明免疫缀合 物刺激的细胞；和(c)表达Fc受体和特定效应器模块的受体二者且受本发明 的抗体和免疫缀合物同时刺激的细胞(例如表达FcγIII受体和IL-2受体的NK 细胞)。
如本文中使用的，术语“工程化”视为包括对肽主链的任意操作或对天 然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列、 糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰，以及这些办法的组合。“工程 化”，特别是具有前缀“糖”时，以及术语“糖基化工程化”包括细胞的糖基化 装置的代谢工程化，包括对寡糖合成途径的遗传操作以实现细胞中表达的 糖蛋白的改变的糖基化。此外，糖基化工程化包括突变和细胞环境对糖基 化的影响。在一个实施方案中，糖基化工程化是糖基转移酶活性的改变。 在一个具体的实施方案中，工程化导致改变的葡糖胺基转移酶活性和/或岩 藻糖基转移酶活性。糖基化工程化可用于获得“具有增加的GnTIII活性的宿 主细胞”(例如经过操作而表达升高水平的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖 胺基转移酶III(GnTIII)活性的多肽的宿主细胞)、“具有增加的ManII活性 的宿主细胞”(例如经过操作而表达升高水平的一种或多种具有α-甘露糖苷 酶II(ManII)活性的多肽的宿主细胞)或“具有降低的α(1,6)岩藻糖基转移酶 活性的宿主细胞”(例如经过操作而表达降低水平的α(1,6)岩藻糖基转移酶的 宿主细胞)。
如本文中使用的，术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸取代、缺失、插 入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任意组合来实现最终构建 体，只要最终构建体拥有期望的特性，例如降低的对Fc受体的结合。氨基 酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸插入。具体的氨基酸 突变是氨基酸取代。为了改变例如Fc区的结合特征，特别优选非保守性的 氨基酸取代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基 酸替换。氨基酸取代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天 然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨 酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基 酸突变。遗传方法可以包括定点诱变、PCR、基因合成等。通过与遗传工 程化不同的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能可用。本 文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。例如，从Fc区第329位脯氨酸 到甘氨酸的取代可指示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序 列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守 性取代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基 酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测定百分比氨基酸序列同一性目的 比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计 算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。 本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括在比较序列的全长 里获得最大比对需要的任何算法。然而，就本文中目的而言，使用序列比 较计算机程序ALIGN-2来生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计 算机程序由Genentech,Inc.创作，并且源代码已与用户文档一起提交到美国 版权局(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.，20559，其在美国版权注 册No.TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，South San Francisco，California公开获得，或可从源代码汇编。ALIGN-2程序应当汇 编用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由 ALIGN-2程序设定且不改变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况 下，给定的氨基酸序列A对/与/相对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一 性(或其可以用短语表示为对/与/相对给定的氨基酸序列B具有或包含特定％ 氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y的100倍
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在所述程序对A和B的比对中评为相同匹 配的氨基酸残基数，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。会领会的是，当氨 基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一 性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另外明确说明，本文中使用 的所有％氨基酸序列同一性值如在上一段中描述的那样使用ALIGN-2计算机 程序获得。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已 引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经 转化的细胞”，其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。 后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文 中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突 变体后代。宿主细胞是能用于生成用于本发明的抗体和免疫缀合物的任意 类型的细胞系统。在一个实施方案中，将宿主细胞工程化为允许生成具有 经修饰寡糖的抗体。在某些实施方案中，操作宿主细胞为表达升高水平的 一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性的多肽。在 某些实施方案中，还操作宿主细胞为表达升高水平的一种或多种具有α-甘 露糖苷酶II(ManII)活性的多肽。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物 培养细胞如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细 胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母 细胞、昆虫细胞和植物细胞等，而且还包括在转基因动物、转基因植物或 培养的植物或动物组织中包含的细胞。
如本文中使用的，术语“具有GnTIII活性的多肽”指能够催化将N-乙酰葡 糖胺(GlcNAc)残基以β-1,4连接添加到N-连接的寡糖的三甘露糖基核心的β- 连接的甘露糖苷的多肽。这包括根据特定的生物学测定法的测量在有或无 剂量依赖性的情况中展现出的酶活性类似于但不一定等同于β(1,4)-N-乙酰 葡糖胺基转移酶III的活性的融合多肽，依照国际生物化学与分子生物学联 盟命名委员会(NC-IUBMB)，β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III也称为β-1,4- 甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺基转移酶(EC 2.4.1.144)。在确实存在 剂量依赖性的情况中，其不需要等于GnTIII的，而是相比于GnTIII，基本类 似于在给定活性的剂量依赖性(即，相对于GnTIII，候选多肽将展现出更大 的活性或小不超过约25倍，而且优选地小不超过约10倍的活性，且最优选 地，小不超过约3倍的活性)。在某些实施方案中，具有GnTIII活性的多肽 是融合多肽，其包含GnTIII的催化域和异源高尔基(Golgi)驻留多肽的高尔 基定位域。特定地，高尔基定位域是甘露糖苷酶II或GnTI的定位域，最特 定地是甘露糖苷酶II的定位域。或者，高尔基定位域选自下组：甘露糖苷酶 I的定位域、GnTII的定位域和α1,6核心岩藻糖基转移酶的定位域。用于生成 这类融合多肽及使用它们来生成具有升高的效应器功能的抗体的方法在 WO2004/065540、美国临时专利申请No.60/495,142和美国专利申请公开文 本No.2004/0241817中披露，其完整内容通过提述明确并入本文。
如本文中使用的，术语“高尔基定位域”指高尔基驻留多肽中负责将多 肽锚定到高尔基复合体内的位置的氨基酸序列。一般地，定位域包含酶的 氨基端“尾部”。
如本文中使用的，术语“具有ManII活性的多肽”指能够催化N-连接的寡 糖的分支GlcNAcMan5GlcNAc2甘露糖中间物中末端1,3-和1,6-连接的α-D-甘 露糖残基的水解的多肽。这包括展现出的酶活性类似于但不一定等同于高 尔基体α-甘露糖苷酶II的活性的多肽，依照国际生物化学与分子生物学联盟 命名委员会(NC-IUBMB)，α-甘露糖苷酶II也称为甘露糖基寡糖1,3-1,6-α- 甘露糖苷酶II(EC 3.2.1.114)。
“激活Fc受体”是一种在抗体的Fc区衔接后，引发刺激携带该受体的细 胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。激活Fc受体包括FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是一种导致通过免疫效应细 胞对抗体包被的靶细胞裂解的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其片 段一般经由Fc区的N端的蛋白质部分特异性结合的细胞。如本文中使用的， 术语“升高/降低的ADCC”定义为通过上文定义的ADCC机制，以靶细胞周围 介质中给定浓度的抗体，在给定的时间内裂解的靶细胞数目的增加/减少， 和/或通过ADCC机制，实现给定时间内给定数目的靶细胞裂解需要的靶细 胞周围介质中抗体浓度的降低/升高。ADCC的升高/降低相对于使用相同的 标准生产、纯化、配制和贮存方法(其是本领域技术人员已知的)、由同一 类型的宿主细胞生成但尚未工程化改造的相同抗体介导的ADCC。例如，由 通过本文中描述的方法工程化改造为具有改变的糖基化模式(例如表达糖基 转移酶、GnTIII或其它糖基转移酶)的宿主细胞生成的抗体介导的ADCC的 升高，是相对于由同一类型的未工程化宿主细胞生成的相同抗体介导的 ADCC而言。
“具有升高/降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体”意 指一种具有升高/降低的ADCC的抗体，如通过本领域普通技术人员已知的 任何合适的方法测定的。一种公认的体外ADCC测定法如下：
1)该测定法使用已知表达由抗体的抗原结合区识别的靶抗原的靶细胞；
2)该测定法使用从随机选择的健康供体的血液分离的人外周血单个核细 胞(PBMC)作为效应细胞；
3)该测定法依照以下方案实施：
i)使用标准的密度离心规程分离PBMC，并以5x 106个细胞/ml重悬 于RPMI细胞培养基中；
ii)通过标准的组织培养方法培养靶细胞，从存活率高于90％的指数 生长阶段收获，在RPMI细胞培养基中清洗，用100微居里51Cr标记，并用细 胞培养基清洗2次，并以105个细胞/ml的密度重悬于细胞培养基中；
iii)将100微升的上述最终靶细胞悬液转移至96孔微量滴定板的每个 孔；
iv)在细胞培养基中将抗体从4000ng/ml连续稀释至0.04ng/ml，并将 50微升所得抗体溶液添加至96孔微量滴定板中的靶细胞，以一式三份测试 覆盖上述整个浓度范围的各种抗体浓度；
v)对于最大释放(MR)对照，在含有经标记的靶细胞的板中3个另外 的孔接受50微升非离子型去污剂(Nonidet，Sigma，St.Louis)的2％(V/V) 水性溶液，代替抗体溶液(上述第iv点)；
vi)对于自发性释放(SR)对照，在含有经标记的靶细胞的板中3个另 外的孔接受50微升RPMI细胞培养基，代替抗体溶液(上述第iv点)；
vii)然后将96孔微量滴定板以50x g离心1分钟并在4℃温育1小时；
viii)将50微升PBMC悬液(上述第i点)添加至每孔以得到25:1的效应细 胞:靶细胞比率，并将板在5％CO2气氛下置于培养箱中于37℃达4小时；
ix)收获来自每孔的无细胞上清液，并使用γ计数器量化实验释放的放 射性(ER)；
x)依照公式(ER-MR)/(MR-SR)x 100对每一抗体浓度计算特定裂解的 百分比，其中ER是对该抗体浓度量化的平均放射性(见上述第ix点)，MR 是对MR对照(见上述第v点)量化的平均放射性(见上述第ix点)，而SR是 对SR对照(见上述第vi点)量化的平均放射性(见上述第ix点)；
4)“升高/降低的ADCC”定义为在上文测试的抗体浓度范围内观察到的比 裂解的最大百分比的增加/减少，和/或实现上文测试的抗体浓度范围内观察 到的比裂解的最大百分比的一半需要的抗体浓度的降低/升高。ADCC的升 高/降低相对于用上述测定法测量的，使用本领域技术人员已知的相同的标 准生成、纯化、配制和贮存方法，由相同类型的宿主细胞产生的，但是尚 未工程化改造的相同抗体介导的ADCC。
如本文中使用的，“组合”(及其语法变型诸如“联合”或“结合”)涵盖依 照本发明的抗体和免疫缀合物的组合，其中免疫缀合物和抗体在相同或不 同容器中，在相同或不同药物配制剂中，一起或分开施用，同时或序贯(以 任何次序)施用，而且通过相同或不同途径施用，只要免疫缀合物和抗体能 在身体中同时发挥它们的生物学效果，即同时刺激效应细胞。例如，“组 合”依照本发明的抗体和免疫缀合物可以表示首先在特定药物配制剂中施用 免疫缀合物，接着在另一药物配制剂中施用抗体，反之亦然。
药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化必需 的量。
药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指有效实现期望的治疗或预防结 果的量(以必要的剂量且持续必要的时间)。治疗有效量的药剂例如消除、 降低、延迟、最小化或预防疾病的不良作用。数种活性组分的组合的治疗 有效量可以是每一种活性组分的治疗有效量。或者，为了降低由治疗引起 的副作用，数种活性组分的组合的治疗有效量可以是各种活性组分的如下 量，其有效产生叠加或超叠加或协同效应，而且在组合时是治疗上有效 的，但是可以是一种或数种活性组分单独使用时的亚治疗量。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例 如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如人和非人灵长类如猴)、家兔和 啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，所述个体或受试者是人。
术语“药物组合物”指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活 性有效，且不含对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的别的成 分的制剂。
“药学可接受载体”指药物配制剂中活性成分以外对受试者无毒的成 分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中 疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的 临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症 状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展 率、改善或减轻疾病状态、及消退或改善的预后。在一些实施方案中，本 发明的组合用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业化包装中通常含有的说明书， 其含有关于适应症、使用、剂量、施用、组合疗法、禁忌症的信息和/或关 于使用这类治疗产品的警告。
免疫缀合物
在本发明中有用的免疫缀合物是包含效应器模块和工程化改造成具有 与对应非工程化抗体相比降低的效应器功能的抗体的多肽分子。
可以通过将效应器模块化学缀合至抗体或通过作为融合蛋白表达效应 器模块和抗体来制备免疫缀合物(参见例如Nakamura and Kubo,Cancer 80, 2650-2655(1997)；及Becker et al.,Proc Natl Acad Sci USA 93,7826-7831 (1996))。对于本发明中的使用，一般优选作为融合蛋白的免疫缀合物。因 而，在某些实施方案中，效应器模块与抗体分享氨基或羧基末端肽键(即免 疫缀合物是融合蛋白)。在此类免疫缀合物中，例如，可以将效应器模块融 合至免疫球蛋白重或轻链。包含全长IgG类抗体，特别是全长IgG1亚类抗体 的免疫缀合物在本发明中特别有用。
在一个实施方案中，效应器模块是单链效应器模块。在一个实施方案 中，效应器模块是细胞因子。免疫缀合物的抗体和效应器模块包括本文中 上文和下文详细描述的那些。免疫缀合物的抗体可以针对多种靶分子(例如 在肿瘤细胞或肿瘤基质上表达的蛋白质分子的抗原性决定簇)。本文中描述 了抗体的非限制性例子。本文中描述的特别有用的免疫缀合物通常展现一 种或多种下述特性：高作用特异性，降低的毒性，较好的可生产性和/或改 善的稳定性，特别是与不同构造、靶向相同抗原性决定簇且携带相同效应 器模块的免疫缀合物相比。供本发明中使用的具体免疫缀合物进一步记载 于PCT公开文本No.WO 2012/146628，通过提述将其完整内容收入本文。
免疫缀合物型式
PCT公开文本No.WO 2012/146628中记载的免疫缀合物包含不多于一个 效应器模块。因而，在一个特定实施方案中，供本发明中使用的免疫缀合 物包含不多于一个效应器模块。在一个特定实施方案中，效应器模块是单 链效应器模块。依照本发明的免疫缀合物中包含的抗体特别是全长IgG类抗 体，更特别地是全长IgG1亚类抗体。在一个实施方案中，抗体是人的。在 其它实施方案中，抗体是人源化的或嵌合的。在一个实施方案中，抗体包 含人Fc区，更特别地是人IgG Fc区，最特别地是人IgG1Fc区。在本发明中 有用的抗体可包含人Ig伽马-1重链恒定区，如SEQ ID NO：124所列(即抗体 是人IgG1亚类的)。
在一个实施方案中，效应器模块与抗体分享氨基或羧基末端肽键。在 一个实施方案中，免疫缀合物基本上由通过一个或多个肽接头连接的效应 器模块和抗体，特别是IgG类抗体，更特别地是IgG1亚类抗体组成。在一个 具体实施方案中，效应器模块在其氨基末端氨基酸处融合至免疫球蛋白重 链之一的羧基末端氨基酸，任选经由肽接头。
在某些实施方案中，特别是免疫缀合物只包含单一效应器模块的情 况，抗体在Fc区中包含促进两条不相同免疫球蛋白重链的异二聚化的修 饰。人IgG Fc区的两条多肽链之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点 在Fc区的CH3域中。如此，在一个实施方案中，所述修饰在Fc区的CH3域 中。在一个具体的实施方案中，所述修饰是节-入-孔修饰，其包含在免疫球 蛋白重链之一中的节修饰和在免疫球蛋白重链的另一个中的孔修饰。节-入- 孔技术记载于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al.,Prot Eng 9, 617-621(1996)及Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)。一般地，该方法 牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面处引入相应 的空腔(“穴”)，从而使得隆起可以置于空腔中以促进异二聚体形成并阻碍 同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例 如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起 相同或相似大小的互补性空腔，其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧 链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换得到。可以通过改变编码多肽的核酸，例如 通过位点专一诱变或通过肽合成来制备隆起和空腔。在一个具体的实施方 案中，节修饰包含在两个免疫球蛋白重链之一中的氨基酸取代T366W，而 穴修饰包含在两个免疫球蛋白重链的另一个中的氨基酸取代T366S、L368A 和Y407V(Kabat编号方式)。在另一个具体的实施方案中，包含节修饰的 免疫球蛋白重链另外包含氨基酸取代S354C，且包含穴修饰的免疫球蛋白重 链另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在两个重链 之间形成二硫桥，从而进一步稳定二聚体(Carter,J Immunol Methods 248, 7-15(2001))。
在一个特定实施方案中，将效应器模块连接至包含节修饰的免疫球蛋 白重链的羧基末端氨基酸。
在一个备选的实施方案中，促进两条不相同多肽链的异二聚化的修饰 包含介导静电操纵效应(electrostatic steering effect)的修饰，例如如记载于 PCT公开文本WO 2009/089004的。一般地，此方法涉及将在两条多肽链界 面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而在静电上 不利于同二聚体形成而在静电上有利于异二聚化。
Fc区赋予免疫缀合物有利的药动学特性，包括长血清半衰期，其有助 于较好的靶组织中积累和有利的组织-血液分布比。然而，它同时可引起不 想要的将免疫缀合物靶向表达Fc受体的细胞，而非优选的携带抗原的细 胞。此外，Fc受体信号传导途径的共激活可引起细胞因子释放，其与效应 器模块和免疫缀合物的长半衰期组合，在系统性施用后导致细胞因子受体 过度激活和严重副作用。符合这一点，已经记载了将常规IgG-IL-2免疫缀合 物与灌注反应有关(参见例如King et al.,J Clin Oncol 22,4463-4473(2004))。
因而，将免疫缀合物中包含的抗体工程化改造成具有与对应非工程化 抗体相比降低的效应器功能。在特定实施方案中，降低的效应器功能为降 低的对活化性Fc受体的结合。在一个此类实施方案中，抗体在其Fc区中包 含一处或多处降低免疫缀合物对活化性Fc受体的结合亲和力的氨基酸突 变。通常，两条免疫球蛋白重链的每一条中存在相同的一处或多处氨基酸 突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变将免疫缀合物对活化性Fc受体 的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍、或至少10倍。在存在多于一处降低 免疫缀合物对活化性Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这 些氨基酸突变的组合可以将免疫缀合物对活化性Fc受体的结合亲和力降低 至少10倍、至少20倍、或甚至至少50倍。在一个实施方案中，包含工程化 抗体的免疫缀合物展现与包含非工程化抗体的免疫缀合物相比少于20％， 特别是少于10％，更特别地是少于5％的对活化性Fc受体的结合亲和力。在 一个具体实施方案中，活化性Fc受体为Fcγ受体，更具体地是FcγRIIIa、 FcγRI或FcγRIIa受体。优选地，对这些受体每一个的结合是降低的。在一些 实施方案中，对补体成分的结合亲和力，具体是对C1q的结合亲和力也是降 低的。在一个实施方案中，对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力不是降低 的。当抗体(或包含所述抗体的免疫缀合物)展现非工程化形式的抗体(或 包含所述非工程化形式的抗体的免疫缀合物)对FcRn的结合亲和力的大于约 70％时，实现基本上相似的对FcRn的结合，即保留抗体对所述受体的结合 亲和力。抗体或包含所述抗体的免疫缀合物可展现此类亲和力的大于约 80％和甚至大于约90％。在一个实施方案中，氨基酸突变为氨基酸替代。在 一个实施方案中，抗体，特别人IgG1亚类抗体，在免疫球蛋白重链的位置 P329(Kabat编号方式)处包含氨基酸替代。在一个更加具体实施方案中， 氨基酸替代为P329A或P329G，特别是P329G。在一个实施方案中，抗体在 选自免疫球蛋白重链S228、E233、L234，L235、N297和P331的位置处包含 进一步的氨基酸替代。在一个更加具体实施方案中，进一步的氨基酸替代 为S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在 一个特定实施方案中，抗体在免疫球蛋白重链的位置P329、L234和L235 (Kabat编号方式)处包含氨基酸替代。在一个更加特定实施方案中，抗体 在免疫球蛋白重链中包含氨基酸替代L234A、L235A和P329G(LALA P329G)。这种氨基酸替代组合几乎特别是有效消除人IgG分子的Fcγ受体结 合，和因此降低效应器功能，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)，如记载于PCT公开文本No.WO 2012/130831，通过提述完整收 入本文。WO 2012/130831还记载了制备此类突变型抗体的方法和用于测定 其特性诸如Fc受体结合或效应器功能的方法。
可以使用本领域公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除、替代、插入 或修饰来制备突变型抗体。遗传方法可包括编码DNA序列的位点特异性诱 变、PCR、基因合成、等等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变 化。
可以容易地测定对Fc受体的结合，例如通过ELISA或通过使用标准仪 器如BIAcore仪(GE Healthcare)的表面等离振子共振(SPR)，且Fc受体如 可以通过重组表达获得。本文中描述了合适的这类结合测定法。或者，可 以使用已知表达特定Fc受体的细胞系，如表达FcγIIIa受体的NK细胞来评估 抗体或包含抗体的免疫缀合物对Fc受体的结合亲和力。
在一些实施方案中，将免疫缀合物的抗体工程化改造为相比于非工程 化抗体，具有降低的效应器功能，特别是降低的ADCC。
可以通过本领域中已知的方法来测量抗体或包含抗体的免疫缀合物的 效应器功能。本文中描述了适合用于测量ADCC的测定法。评估感兴趣分子 的ADCC活性的体外测定法的其它例子记载于美国专利No.5,500,362； Hellstrom et al.Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)及Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337； Bruggemann et al.,J Exp Med 166,1351-1361(1987)。或者，可以采用非放射 性的测定方法(参见，例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测 定(CellTechnology,Inc.，Mountain View，CA)；和CytoTox非放射性细 胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。可用于这类测定法的效应细胞包 括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以 体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型，如在Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中披露的动物模型中。
在一些实施方案中，改变抗体对补体成分，特别地对C1q的结合。因 此，在抗体工程化改造为具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述 降低的效应器功能包括降低的CDC。可以实施C1q结合测定法来测定免疫缀 合物能否结合C1q并因此具有CDC活性。参见，例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC 测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J Immunol Methods 202,163(1996)； Cragg et al.,Blood 101,1045-1052(2003)；及Cragg and Glennie,Blood 103, 2738-2743(2004))。
在一些实施方案中，免疫缀合物包含一个或多个位于效应器模块和抗 体之间的蛋白水解切割位点。免疫缀合物的各组件可以直接或经由本文中 描述的或本领域已知的各种接头，特别是包含一个或多个氨基酸，通常约 2-20个氨基酸的肽接头连接。合适的、非免疫原性肽接头包括例如(G4S) n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中n一般为1和10之间，通常2和4之间 的数。
免疫缀合物的抗体
本发明的免疫缀合物的抗体一般是结合特定抗原性决定簇且能够将它 附着的实体(例如效应器模块)引导至靶位点(例如携带该抗原性决定簇的 特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质)的免疫球蛋白分子。免疫缀合物可结合例 如在肿瘤细胞的表面上、在受到病毒感染的细胞的表面上、在其它患病细胞 的表面上、在血液中游离、和/或在细胞外基质(ECM)中找到的抗原性决 定簇。肿瘤抗原的非限制性例子包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、 二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、 结直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性 表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性 表位PSA-1、PSA-2、和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受 体/CD3ζ链、MAGE家族肿瘤抗原(例如MAGE-A1、MAGE-A2、 MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、 MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、 MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4 (MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、 MAGE-C5)、GAGE家族肿瘤抗原(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、 GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、 RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、 MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、甲胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-联蛋 白、β-联蛋白和γ-联蛋白、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、 NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、 Ig独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物诸如人乳头瘤病 毒蛋白、Smad家族肿瘤抗原、lmp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA) -1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、 SSX-5、SCP-1和CT-7、和c-erbB-2。病毒抗原的非限制性例子包括流感病 毒血凝素、Epstein-Barr病毒LMP-1、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、HIV gp160、 和HIV gp120。ECM抗原的非限制性例子包括黏结蛋白聚糖、类肝素酶、整 联蛋白、骨桥蛋白、link、钙粘蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白型EGF、凝 集素、纤连蛋白、刻缺蛋白、生腱蛋白、和基质蛋白酶。本发明的免疫缀 合物可结合细胞表面抗原的下述具体非限制性例子：FAP、Her2、EGFR、 IGF-1R、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR联合的异多聚体)、CD22 (B细胞受体)、CD23(低亲和力IgE受体)、CD25(IL-2受体α链)、CD30 (细胞因子受体)、CD33(髓样细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受 体)、IL-6R(IL6受体)、CD20、MCSP、c-Met、CUB域-含有蛋白-1 (CDCP1)、和PDGFβR(β-血小板衍生生长因子受体)。
在某些实施方案中，抗体针对肿瘤细胞上或肿瘤细胞环境中呈现的抗 原。在一个具体实施方案中，抗体针对选自下组的抗原：成纤维细胞激活 蛋白(FAP)，生腱蛋白-C的A1域(TNC A1)，生腱蛋白-C的A2域(TNC A2)，纤连蛋白的外域B(EDB)，癌胚抗原(CEA)和黑素瘤相关硫酸软 骨素蛋白聚糖(MCSP)。
抗体可以是保留对抗原性决定簇的特异性结合且包含Fc区的任何类型 的抗体或其片段。在一个实施方案中，抗体是全长抗体。特别优选的抗体 是IgG类，具体是IgG1亚类的免疫球蛋白。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含对生腱蛋白的A1和/或A4域 (TNC-A1或TNC-A4或TNC-A1/A4)特异性的抗体。在一个具体实施方案 中，免疫缀合物的抗体包含与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9任一至少约 80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变 区序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体实施方案中，免疫缀合物 的抗体包含与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7任一至少约80％，85％， 90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列，或其 保留功能性的变体。在一个更加具体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含 与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9任一至少约80％，85％，90％，95％， 96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列或其保留功能性的变 体，和与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7任一至少约80％，85％，90％， 95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列或其保留功能 性的变体。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含对生腱蛋白的A2域(TNC-A2)特 异性的抗体。在一个具体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含与选自下组 的序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相 同的重链可变区序列：SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO： 73，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO： 81，SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：85，或其保留功能性的变体。在另一个 具体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含与选自下组的序列至少约80％， 85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序 列：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：72， SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80， SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：84，或其保留功能性的变体。在一个更加具 体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含与选自下组的序列至少约80％， 85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序 列：SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO： 75，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：83 和SEQ ID NO：85，或其保留功能性的变体，和与选自下组的序列至少约 80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变 区序列：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：70，SEQ ID NO： 72，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO： 80，SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：84，或其保留功能性的变体。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含对成纤维细胞激活的蛋白(FAP) 特异性的抗体。在一个具体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含与选自下 组的序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％ 相同的重链可变区序列：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO： 15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO： 23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO： 31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO： 39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO： 47，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO： 55，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO： 63，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：69，或其保留功能性 的变体。在另一个具体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含与选自下组的 序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同 的轻链可变区序列：SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13， SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22， SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30， SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38， SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46， SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54， SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62， SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：68，或其保留功能性的变 体。在一个更加具体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含与选自下组的序 列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的 重链可变区序列：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15， SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23， SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31， SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39， SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47， SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：55， SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：63， SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：69，或其保留功能性的变 体，和与选自下组的序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％， 98％，99％或100％相同的轻链可变区序列：SEQ ID NO：10，SEQ ID NO： 11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO： 20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO： 28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO： 36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO： 44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO： 52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO： 60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66和SEQ ID NO： 68，或其保留功能性的变体。在另一个具体实施方案中，免疫缀合物的抗 体包含SEQ ID NO：12的重链可变区序列和SEQ ID NO：11的轻链可变区序 列。在另一个具体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含SEQ ID NO：17的 重链可变区序列和SEQ ID NO：16的轻链可变区序列。在另一个具体实施 方案中，免疫缀合物的抗体包含SEQ ID NO：47的重链可变区序列和SEQ ID NO：46的轻链可变区序列。在另一个具体实施方案中，免疫缀合物的抗 体包含SEQ ID NO：63的重链可变区序列和SEQ ID NO：62的轻链可变区序 列。在另一个具体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含SEQ ID NO：67的 重链可变区序列和SEQ ID NO：66的轻链可变区序列。在另一个具体实施 方案中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：125至少约80％，85％， 90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列或其保留功能 性的变体，与SEQ ID NO：126至少约80％，85％，90％，95％，96％， 97％，98％，99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体，和与SEQ ID NO：129至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或 100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体。在另一个具体实施方案中， 本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：127至少约80％，85％，90％， 95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变 体，与SEQ ID NO：128至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％， 98％，99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体，和与SEQ ID NO：129至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％ 相同的多肽序列或其保留功能性的变体。在另一个具体实施方案中，本发 明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：130至少约80％，85％，90％，95％， 96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体，与 SEQ ID NO：131至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％ 或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体，和与SEQ ID NO：132至少 约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序 列或其保留功能性的变体。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含对黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖 (MCSP)特异性的抗体。在一个具体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含 与SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：122任一的序列至少约80％，85％，90％， 95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列或其保留功能 性的变体。在另一个具体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含与SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：123任一的序列至少约80％，85％，90％，95％， 96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变 体。在一个更加具体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含与SEQ ID NO： 86或SEQ ID NO：122任一的序列至少约80％，85％，90％，95％，96％， 97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列，或其保留功能性的变 体，和与SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：123任一的序列至少约80％， 85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序 列，或其保留功能性的变体。在一个更加具体实施方案中，免疫缀合物的 抗体包含与SEQ ID NO：86的序列至少约80％，85％，90％，95％，96％， 97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列，和与SEQ ID NO：87的序 列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的 轻链可变区序列。在另一个具体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含与 SEQ ID NO：122的序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％， 98％，99％或100％相同的重链可变区序列，和与SEQ ID NO：123的序列至 少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链 可变区序列。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含对癌胚抗原(CEA)特异性的抗 体。在一个具体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含与SEQ ID NO：114的 序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同 的重链可变区序列或其保留功能性的变体。在另一个具体实施方案中，免 疫缀合物的抗体包含与SEQ ID NO：115的序列至少约80％，85％，90％， 95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列或其保留功能 性的变体。在一个更加具体实施方案中，免疫缀合物的抗体包含与SEQ ID NO：114的序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或 100％相同的重链可变区序列，或其保留功能性的变体，和与SEQ ID NO： 115的序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％ 相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体实施方案 中，本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO：136至少约80％，85％， 90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列或其保留功能 性的变体，与SEQ ID NO：137至少约80％，85％，90％，95％，96％， 97％，98％，99％或100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体，和与SEQ ID NO：138至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或 100％相同的多肽序列或其保留功能性的变体。
依照本发明的免疫缀合物包括那些包含与SEQ ID NO：3-87、108-132 和136-138所列序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％， 99％，或100％相同的序列的，包括其功能性片段或变体。依照本发明的免 疫缀合物还涵盖包含SEQ ID NO：3-127的序列且带有保守氨基酸替代的抗 体。要理解，在SEQ ID NO：126，128，131，134和137的序列中，本文所 述突变型IL-2的序列(见SEQ ID NO：2)可以用人IL-2的序列(见SEQ ID NO：1)替换。
免疫缀合物的效应器模块
供本发明中使用的效应器模块一般是影响细胞活性(例如经由信号传导 途径)的多肽。因而，在本发明中有用的免疫缀合物的效应器模块可以与受 体介导的信号传导(其传递来自细胞膜外面的信号以调控细胞内的应答)有 关。例如，免疫缀合物的效应器模块可以是细胞因子。在一个特定实施方 案中，效应器模块为本文所述单链效应器模块。在一个实施方案中，依照 本发明的免疫缀合物的效应器模块(通常是单链效应器模块)是选自下组的 细胞因子：IL-2，GM-CSF，IFN-α，和IL-12。在一个实施方案中，效应器 模块为IL-2。在另一个实施方案中，免疫缀合物的单链效应器模块是选自下 组的细胞因子：IL-8，MIP-1α，MIP-1β，和TGF-β。
在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，特别是单链效应器模 块为IL-2。在一个具体实施方案中，IL-2效应器模块能引发一种或多种选自 下组的细胞应答：激活的T淋巴细胞中的增殖，激活的T淋巴细胞中的分 化，细胞毒性T细胞(CTL)活性，激活的B细胞中的增殖，激活的B细胞中 的分化，天然杀伤(NK)细胞中的增殖，NK细胞中的分化，激活的T细胞 或NK细胞的细胞因子分泌，和NK/淋巴细胞激活的杀伤(LAK)抗肿瘤细胞 毒性。在某些实施方案中，IL-2效应器模块为突变型IL-2效应器模块包含至 少一处与非突变型IL-2效应器模块相比降低或消除突变型IL-2效应器模块对 IL-2受体(也称作CD25)α亚基的亲和力但保留突变型IL-2效应器模块对中 间亲和力IL-2受体(由IL-2受体β-和γ亚基组成)的亲和力的氨基酸突变。在 一个实施方案中，氨基酸突变为氨基酸替代。在一个具体实施方案中，突 变型IL-2效应器模块在选自与人IL-2(SEQ ID NO：1)残基42、45、和72对 应的位置的一个、两个或三个位置处包含一处、两处或三处氨基酸替代。 在一个更加具体实施方案中，突变型IL-2效应器模块在与人IL-2残基42、45 和72对应的位置处包含三处氨基酸替代。在一个甚至更加具体实施方案 中，突变型IL-2效应器模块为包含氨基酸替代F42A、Y45A和L72G的人 IL-2。在一个实施方案中，突变型IL-2效应器模块在与人IL-2位置3对应的 位置处另外包含氨基酸突变，其消除IL-2的O-糖基化位点。特别是所述别 的氨基酸突变为用丙氨酸残基替换苏氨酸残基的氨基酸替代。包含氨基酸 替代T3A、F42A、Y45A和L72G的四重突变型(QM)IL-2的序列显示于SEQ ID NO：2。合适的突变型IL-2分子更加详细地记载于PCT公开文本No.WO 2012/107417。
作为免疫缀合物中的效应器模块有用的突变型IL-2分子可使用本领域公 知的遗传或化学方法通过删除、替代、插入或修饰来制备。遗传方法可包 括编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成、等等。可通过例如 测序来验证正确的核苷酸变化。在这点上，天然IL-2的核苷酸序列已经记载 于Taniguchi et al.,Nature 302,305-10(1983)，而且编码人IL-2的核酸可得自 公开的保藏机构，诸如美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。人IL-2 的一种例示性序列显示于SEQ ID NO：1。替代或插入可涉及天然以及非天 然氨基酸残基。氨基酸修饰包括公知的化学修饰方法，诸如添加或消除糖 基化位点或碳水化合物附着，等等。
在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，特别是单链效应器模 块为GM-CSF。在一个具体实施方案中，GM-CSF效应器模块能引发粒细 胞、单核细胞或树突细胞中的增殖和/或分化。在一个实施方案中，免疫缀 合物的效应器模块，特别是单链效应器模块为IFN-α。在一个具体实施方案 中，IFN-α效应器模块能引发一种或多种选自下组的细胞应答：在受到病毒 感染的细胞中抑制病毒复制，和上调主要组织相容性复合物I(MHC I)的表 达。在另一个具体实施方案中，IFN-α效应器模块能抑制肿瘤细胞中的增 殖。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，特别是单链效应器模 块为IL-12。在一个具体实施方案中，IL-12效应器模块能引发一种或多种选 自下组的细胞应答：NK细胞中的增殖，NK细胞中的分化，T细胞中的增 殖，和T细胞中的分化。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，特 别是单链效应器模块为IL-8。在一个具体实施方案中，IL-8效应器模块能引 发嗜中性粒细胞中的趋化性。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模 块，特别是单链效应器模块为MIP-1α。在一个具体实施方案中，MIP-1α效 应器模块能引发单核细胞和T淋巴细胞中的趋化性。在一个实施方案中，免 疫缀合物的效应器模块，特别是单链效应器模块为MIP-1β。在一个具体实 施方案中，MIP-1β效应器模块能引发单核细胞和T淋巴细胞中的趋化性。在 一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，特别是单链效应器模块为 TGF-β。在一个具体实施方案中，TGF-β效应器模块能引发一种或多种选自 下组的细胞应答：单核细胞中的趋化性，巨噬细胞中的趋化性，激活的巨 噬细胞中IL-1表达的上调，和激活的B细胞中IgA表达的上调。
用于与免疫缀合物组合的抗体
依照本发明，用于与免疫缀合物组合的抗体是工程化改造成具有升高 的效应器功能。用于与免疫缀合物组合的在本发明中有用的抗体包括结合 特定抗原性决定簇(例如特定肿瘤细胞抗原)且包含Fc区的抗体或抗体片 段。在某些实施方案中，抗体针对肿瘤细胞上呈现的抗原。在本发明中有 用的抗体的具体靶抗原包括肿瘤细胞的表面上表达的抗原，包括但不限于 细胞表面受体，诸如表皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素样生长因子受体 (IGFR)和血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、前列腺特异性膜抗原 (PSMA)、癌胚抗原(CEA)、二肽基肽酶IV(CD26，DPPIV)、FAP、 HER2/neu、HER-3、E-钙粘蛋白、CD20、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖 (MCSP)、c-Met、含CUB域蛋白-1(CDCP1)、和鳞状细胞癌抗原 (SCCA)。
在一个具体实施方案中，抗体针对选自下组的抗原：CD20，表皮生长 因子受体(EGFR)，HER2，HER3，胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)， 癌胚抗原(CEA)，c-Met，含CUB域蛋白-1(CDCP1)，和黑素瘤相关硫 酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。在一个实施方案中，抗体是针对两种或更多 种选自下组的抗原的多特异性抗体：CD20，表皮生长因子受体(EGFR)， HER2，HER3，胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)，癌胚抗原(CEA)， c-Met，含CUB域蛋白-1(CDCP1)，和黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖 (MCSP)。
在本发明中有用的具体抗CD20抗体是具有鼠B-Ly1抗体(Poppema and Visser,Biotest Bulletin 3,131-139(1987))的结合特异性的人源化IgG类II型抗 CD20抗体。包含下述各项的人源化IgG类II型抗CD20抗体是特别有用的：
a)重链可变域中，SEQ ID NO：88的CDR1、SEQ ID NO：89的CDR2、和 SEQ ID NO：90的CDR3，和
b)轻链可变域中，SEQ ID NO：91的CDR1、SEQ ID NO：92的CDR2、和 SEQ ID NO：93的CDR3。
特别地，所述抗体的重链可变区框架区(FR)FR1、FR2、和FR3是由 VH1_10人种系序列编码的人FR序列，所述抗体的重链可变区FR4是由JH4 人种系序列编码的人FR序列，所述抗体的轻链可变区FR FR1、FR2、和 FR3是由VK_2_40人种系序列编码的人FR序列，且所述抗体的轻链可变区 FR4是由JK4人种系序列编码的人FR序列。
在本发明中有用的一种更加具体的抗CD20抗体包含SEQ ID NO：94的 重链可变域和SEQ ID NO：95的轻链可变域。
此类抗CD20抗体记载于WO 2005/044859，通过提述将其完整收入本 文。
在本发明中有用的具体抗EGFR抗体是具有大鼠ICR62抗体(Modjtahedi et al.,Br J Cancer 67,247-253(1993))的结合特异性的人源化IgG类抗体。包 含下述各项的人源化IgG类抗EGFR抗体是特别有用的：
a)重链可变域中，SEQ ID NO：96的CDR1、SEQ ID NO：97的CDR2、和 SEQ ID NO：98的CDR3，和
b)轻链可变域中，SEQ ID NO：99的CDR1、SEQ ID NO：100的CDR2、和 SEQ ID NO：101的CDR3。
在本发明中有用的一种更加具体的抗EGFR抗体包含SEQ ID NO：102 的重链可变域和SEQ ID NO：103的轻链可变域。
此类抗EGFR抗体记载于WO 2006/082515和WO 2008/017963，通过提 述将其每一篇完整收入本文。
对本发明有用的其它合适的人源化IgG类抗EGFR抗体包括 cetuximab/IMC-C225(记载于Goldstein et al.,Clin Cancer Res 1, 1311-1318(1995))，panitumumab/ABX-EGF(记载于Yang et al., Cancer Res 59,1236-1243(1999)；Yang et al.,Critical Reviews in Oncology/Hematology 38,17-23(2001))，nimotuzumab/h-R3(记载于Mateo et al.,Immunotechnology 3,71-81(1997)；Crombet-Ramos et al., Int J Cancer 101,567-575(2002)；Boland&Bebb,Expert Opin Biol Ther 9, 1199-1206(2009))，matuzumab/EMD 72000(记载于Bier et al.,Cancer Immunol Immunother 46,167-173(1998)；Kim,Curr Opin Mol Ther 6,96-103 (2004))，和zalutumumab/2F8(记载于Bleeker et al.,J Immunol 173,4699-4707 (2004)；Lammerts van Bueren,PNAS 105,6109-6114(2008))。
在本发明中有用的具体抗IGF-1R抗体记载于WO 2005/005635和WO 2008/077546，通过提述将每一篇的完整内容收入本文，且抑制胰岛素样生 长因子-1(IGF-1)和胰岛素样生长因子-2(IGF-2)对胰岛素样生长因子-1 受体(IGF-1R)的结合。
对本发明有用的抗IGF-1R抗体优选单克隆抗体，还有嵌合抗体(人恒定 域)，人源化抗体和尤其优选的完全人的抗体。对本发明有用的具体抗 IGF-1R抗体与抗体18竞争结合人IGF-1R，即它们与抗体18结合IGF-1R的相 同表位，抗体18记载于WO 2005/005635。具体抗IGF-1R抗体的特征还在于 10-8M(KD)或更小，特别是约10-9至10-13M的对IGF-1R的亲和力，且优选 对胰岛素结合胰岛素受体不显示可检测的浓度依赖性抑制。
对本发明有用的具体抗IGF-1R抗体包含具有下述序列的互补决定区 (CDR)：
a)抗体重链包含SEQ ID NO：104或106的CDR1、CDR2和CDR3作为CDR；
b)抗体轻链包含SEQ ID NO：105或107的CDR1、CDR2和CDR3作为CDR。
特别地，对本发明有用的抗IGF-1R抗体包含SEQ ID NO：104的抗体重 链可变域氨基酸序列和SEQ ID NO：105的抗体轻链可变域氨基酸序列，或 SEQ ID NO：106的抗体重链可变域氨基酸序列和SEQ ID NO：107的抗体轻 链可变域氨基酸序列。
对本发明有用的具体抗IGF-1R抗体可得自杂交瘤细胞系 <IGF-1R>HUMAB-克隆18和<IGF-1R>HUMAB-克隆22，它们保藏于德国的 德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，保藏号分别为DSM ACC 2587和DSM ACC 2594。
对本发明有用的其它合适的抗IGF-1R抗体有例如完全人的IgG1单抗 cixutumumab/IMC-A12(记载于Burtrum et al.,Cancer Res 63,8912-21(2003)； Rowinsky et al.,Clin Cancer Res 13,5549s-5555s(2007))，完全人的IgG1单抗 AMG-479(记载于Beltran et al.,Mol Cancer Ther 8,1095-1105(2009)；Tolcher et al.,J Clin Oncol 27,5800-7(2009))，人源化IgG1单抗MK-0646/h7C10(记 载于Goetsch et al.,Int J Cancer 113,316-28(2005)；Broussas et al.,Int J Cancer 124,2281-93(2009)；Hidalgo et al.,J Clin Oncol 26,abstract 3520(2008)；Atzori et al.,J Clin Oncol 26,abstract 3519(2008))，人源化IgG1单抗AVE1642(记 载于Descamps et al.,Br J Cancer 100,366-9(2009)；Tolcher et al.,J Clin Oncol 26,abstract 3582(2008)；Moreau et al.,Blood 110,abstract 1166(2007)； Maloney et al.,Cancer Res 63,5073-83(2003))，完全人的IgG2单抗 figitumumab/CP-751,871(Cohen et al.,Clin Cancer Res 11,2063-73(2005)； Haluska et al.,Clin Cancer Res 13,5834-40(2007)；Lacy et al.,J Clin Oncol 26, 3196-203(2008)；Gualberto&Karp,Clin Lung Cancer 10,273-80(2009))，完 全人的IgG1单抗SCH-717454(记载于WO 2008/076257或Kolb et al.,Pediatr Blood Cancer 50,1190-7(2008))，2.13.2.单抗(记载于US 7,037,498(WO 2002/053596))或完全人的IgG4单抗BIIB022。
在本发明中有用的具体抗CEA抗体是具有鼠PR1A3抗体(Richman and Bodmer,Int J Cancer 39,317-328(1987))的结合特异性的人源化IgG类抗体。 包含下述各项的人源化IgG类抗CEA抗体是特别有用的：
a)重链可变域中，SEQ ID NO：108的CDR1、SEQ ID NO：109的CDR2、和 SEQ ID NO：110的CDR3，和
b)轻链可变域中，SEQ ID NO：111的CDR1、SEQ ID NO：112的CDR2、和 SEQ ID NO：113的CDR3。
在本发明中有用的一种更加具体的抗CEA抗体包含SEQ ID NO：114的 重链可变域和SEQ ID NO：115的轻链可变域。
此类抗CEA抗体记载于PCT公开文本No.WO 2011/023787，通过提述将 其完整收入本文。
在本发明中有用的具体抗HER3抗体是人源化IgG类抗体，诸如单抗 205.10.1、单抗205.10.2和单抗205.10.3，特别是单抗205.10.2，记载于PCT 公开文本No.WO 2011/076683。包含下述各项的人源化IgG类抗HER3抗体 是特别有用的：
a)重链可变域中，SEQ ID NO：139的CDR1、SEQ ID NO：140的CDR2、和 SEQ ID NO：141的CDR3，和
b)轻链可变域中，SEQ ID NO：143的CDR1、SEQ ID NO：144的CDR2、和 SEQ ID NO：145的CDR3。
在本发明中有用的一种更加具体的抗HER3抗体包含SEQ ID NO：142 的重链可变域和SEQ ID NO：146的轻链可变域。
在本发明中有用的具体抗CDCP1-抗体是自记载于PCT公开文本No.WO 2011/023389的CUB4抗体(保藏号DSM ACC 2551(DSMZ)衍生的人源化IgG 类抗体。
可用于本发明的例示性抗MCSP抗体记载于例如欧洲专利申请No.EP 11178393.2。包含下述各项的人源化IgG类抗MCSP抗体是特别有用的：
a)重链可变域中，SEQ ID NO：116的CDR1、SEQ ID NO：117的CDR2、和 SEQ ID NO：118的CDR3，和
b)轻链可变域中，SEQ ID NO：119的CDR1、SEQ ID NO：120的CDR2、和 SEQ ID NO：121的CDR3。
在本发明中有用的一种更加具体的抗MCSP抗体包含SEQ ID NO：122 的重链可变域和SEQ ID NO：123的轻链可变域。
在一个实施方案中，抗体是IgG类的全长抗体。在一个特定实施方案 中，抗体是IgG1抗体。在一个实施方案中，抗体包含人Fc区，更特别是人 IgG Fc区，最特别的是人IgG1Fc区。在本发明中有用的抗体(诸如上文所述 抗IGF-1R、抗EGFR和抗CD20抗体)可包含人Ig伽马1重链恒定区，如SEQ ID NO：124所列(即抗体是人IgG1亚类的)。
将在本发明中有用的抗体工程化改造成与对应非工程化抗体相比具有 升高的效应器功能。在一个实施方案中，工程化改造成与对应非工程化抗 体相比具有升高的效应器功能的抗体具有升高至少2倍、至少10倍或甚至至 少100倍的效应器功能。升高的效应器功能可包括但不限于下述一项或多 项：升高的Fc受体结合，升高的C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)， 升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，升高的抗体依赖性细胞 吞噬(ADCP)，升高的细胞因子分泌，升高的免疫复合物介导的抗原呈递 细胞对抗原的摄取，升高的对NK细胞的结合，升高的对巨噬细胞的结合， 升高的对单核细胞的结合，升高的对多形核细胞的结合，升高的诱导凋亡 的直接信号传导，升高的靶物结合抗体交联，升高的树突细胞成熟，或升 高的T细胞引发。
在一个实施方案中，升高的效应器功能为选自下组的一项或多项：升 高的Fc受体结合，升高的CDC，升高的ADCC，升高的ADCP，和升高的细 胞因子分泌。在一个实施方案中，升高的效应器功能为升高的对活化性Fc 受体的结合。在一个此类实施方案中，对活化性Fc受体的结合亲和力与对 应非工程化抗体的结合亲和力相比升高至少2倍，特别是至少10倍。在一个 具体实施方案中，活化性Fc受体选自下组：FcγRIIIa，FcγRI，和FcγRIIa。 在一个实施方案中，活化性Fc受体为FcγRIIIa，特别是人FcγRIIIa。在另一 个实施方案中，升高的效应器功能为升高的ADCC。在一个此类实施方案 中，ADCC与由对应非工程化抗体介导的ADCC相比升高至少10倍，特别是 至少100倍。在还有另一个实施方案中，升高的效应器功能为升高的对活化 性Fc受体的结合和升高的ADCC。
升高的效应器功能可通过本领域已知方法来测量。本文中描述了一种 适合于测量ADCC的测定法。用于评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定 法的其它例子记载于美国专利No.5,500,362；Hellstrom et al.Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)及Hellstrom et al.,Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann et al.,J Exp Med 166, 1351-1361(1987)。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如ACTITM用于 流式细胞术的非放射性细胞毒性测定法(Cell Technology，Inc。Mountain View，CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega， Madison，WI))。对此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞 (PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分 子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中披露的。对Fc受体的结合可以例如通过ELISA或表 面等离振子共振(SPR)使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)容 易地测定，而且诸如Fc受体可以通过重组表达来获得。依照一个具体实施 方案，通过表面等离振子共振使用T100机器(GE Healthcare) 在25℃测量对活化性Fc受体的结合亲和力。或者，可以使用已知表达特定 Fc受体的细胞系，诸如表达FcγIIIa受体的NK细胞来评估抗体对Fc受体的结 合亲和力。还可以进行C1q结合测定法来确定抗体是否能够结合C1q并因此 具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c 结合ELISA。为了评估补体活化，可以实施CDC测定法(参见例如 Gazzano-Santoro et al.,J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg et al.,Blood 101,1045-1052(2003)；及Cragg and Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
升高的效应器功能可源自例如Fc区的糖工程化改造或在抗体的Fc区中 引入氨基酸突变。在一个实施方案中，通过在Fc区中引入一处或多处氨基 酸突变来工程化改造抗体。在一个具体实施方案中，氨基酸突变为氨基酸 替代。在一个甚至更加具体实施方案中，氨基酸替代位于Fc区的位置298、 333、和/或334(EU残基编号方式)。别的合适的氨基酸突变记载于例如 Shields et al.,J Biol Chem 9(2),6591-6604(2001)；美国专利No.6,737,056； WO 2004/063351及WO 2004/099249。可以使用本领域中公知的遗传或化学 方法通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变体Fc区。遗传方法可 以包括对编码DNA序列的位点专一性诱变、PCR、基因合成等。正确的核 苷酸变化可以通过例如测序来验证。
在另一个实施方案中，通过修饰Fc区中的糖基化来工程化改造抗体。 在一个具体实施方案中，将抗体工程化改造为相比于非工程化改造的抗体 在Fc区中具有增加的非岩藻糖基化寡糖比例。抗体Fc区中增加的非岩藻糖 基化寡糖比例导致抗体具有升高的效应器功能，特别是升高的ADCC。
在一个更具体的实施方案中，抗体Fc区中至少约20％、约25％、约 30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约 70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％，优选至少约 50％，更优选至少约70％的N-连接的寡糖是非岩藻糖基化的。非岩藻糖基化 的寡糖可以是杂合或复合类型的。
在另一个具体的实施方案中，将抗体工程化改造成相比于非工程化改 造的抗体在Fc区中具有增加的两分型寡糖比例。在一个更具体的实施方案 中，抗体Fc区中至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、 约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约 80％、约85％、约90％、约95％或约100％，优选至少约50％，更优选至少约 70％的N-连接的寡糖是两分的。两分型寡糖可以是杂合或复合类型的。
在又一个具体的实施方案中，将抗体工程化改造成相比于非工程化的 抗体在Fc区中具有增加的两分型非岩藻糖基化寡糖比例。在一个更具体的 实施方案中，抗体Fc区中至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、 约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约 75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％，优选至少约15％，更优 选至少约25％、至少约35％或至少约50％的N-连接的寡糖是两分的、非岩藻 糖基化的。两分的、非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合或复合类型的。
可以通过本领域中公知的方法来分析抗体Fc区中的寡糖结构，例如通 过MALDI TOF质谱术进行，如记载于Umana et al.,Nat Biotechnol 17, 176-180(1999)或Ferrara et al.,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)的。非岩藻 糖基化的寡糖的百分比是相对于附接于Asn 297的所有寡糖(例如复合、杂 合和高甘露糖结构)并通过MALDI TOF MS在N-糖苷酶F处理的样品中鉴定 的缺少岩藻糖残基的寡糖量。Asn 297指位于Fc区中约第297位(Fc区残基的 EU编号方式)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变异， Asn297也可以位于第297位的上游或下游约±3个氨基酸，即介于位置294和 300之间。类似地，测定两分型，或两分型非岩藻糖基化的寡糖的百分比。
在一个实施方案中，将抗体工程化改造为相比于非工程化抗体在Fc区 中具有改变的糖基化，其通过在具有改变的一种或多种糖基转移酶活性的 宿主细胞中生成该抗体进行。糖基转移酶包括β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移 酶III(GnTIII)、β(1,4)-半乳糖基转移酶(GalT)、β(1,2)-N-乙酰葡糖胺基转 移酶I(GnTI)、β(1,2)-N-乙酰葡糖胺基转移酶II(GnTII)和α(1,6)-岩藻糖基 转移酶。在一个具体的实施方案中，将抗体工程化改造为相比于非工程化 的抗体在Fc区中具有增加的非岩藻糖基化寡糖比例，其通过在具有增加的 β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性的宿主细胞中生成该抗体进 行。在一个甚至更具体的实施方案中，宿主细胞另外具有增加的α-甘露糖 苷酶II(ManII)活性。可用于工程化改造对本发明有用的抗体的糖工程化方 法学已详细记载于Umana et al.,Nat Biotechnol 17,176-180(1999)；Ferrara et al.,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342(美国专利No. 6,602,684；EP 1071700)；WO 2004/065540(美国专利申请公开文本No. 2004/0241817；EP 1587921)；WO 03/011878(美国专利申请公开文本No. 2003/0175884)，其中每篇的内容通过提述完整并入本文。使用这种方法学 糖工程化改造的抗体在本文中称作GlycoMab(糖单抗)。
一般地，可以使用任意类型的培养的细胞系(包括在本文中论述的细胞 系)来生成用于生产具有改变的糖基化模式的抗TNC A2抗体的细胞系。具 体的细胞系包括CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤 细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞、或杂交瘤细胞和 其它哺乳动物细胞。在某些实施方案中，宿主细胞已操作为表达升高水平 的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性的多肽。 在某些实施方案中，宿主细胞还已操作为表达升高水平的一种或多种具有 α-甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽。在一个具体的实施方案中，具有 GnTIII活性的多肽是融合多肽，其包含GnTIII的催化域和异源高尔基驻留多 肽的高尔基定位域。具体地，所述高尔基定位域是甘露糖苷酶II的高尔基定 位域。用于生成这类融合多肽以及使用它们来生成具有增加的效应器功能 的抗体的方法公开在Ferrara et al.,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)及 WO2004/065540中，其完整内容通过提述明确并入本文。
可以鉴定含有对本发明有用的抗体的编码序列和/或具有糖基转移酶活 性的多肽的编码序列，并且表达生物学活性基因产物的宿主细胞，例如通 过DNA-DNA或DNA-RNA杂交；存在或缺乏“标志物”基因功能；评估转录 水平(如通过宿主细胞中相应mRNA转录本的表达测量的)；或检测基因产 物(如通过免疫测定法或通过其生物学活性测量的)进行，这些方法是本领 域中公知的。可以例如通过采用分别结合GnTIII或ManII的生物合成产物的 凝集素来检测GnTIII或ManII活性。这类凝集素的一个例子是E4-PHA凝集 素，其优先结合含有两分型GlcNAc的寡糖。还可以检测具有GnTIII或ManII 活性的多肽的生物合成产物(即特定的寡糖结构)，其通过对从由表达所述 多肽的细胞生成的糖蛋白释放的寡糖的质谱分析进行。或者，可以使用测 量由抗体介导的增加的效应器功能，例如增加的Fc受体结合的功能测定 法，所述抗体是由工程化为具有有GnTIII或ManII活性的多肽的细胞生成。
在另一个实施方案中，将抗体工程化改造为相比于非工程化的抗体在 Fc区中具有增加的非岩藻糖基化寡糖比例，其通过在具有降低的α(1,6)-岩藻 糖基转移酶活性的宿主细胞中生成该抗体进行。具有降低的α(1,6)-岩藻糖基 转移酶活性的宿主细胞可以是其中α(1,6)-岩藻糖基转移酶基因已被破坏或以 其它方式失活(例如敲除)的细胞(参见Yamane-Ohnuki et al.,Biotech Bioeng 87,614(2004)；Kanda et al.,Biotechnol Bioeng,94(4),680-688(2006)；Niwa et al.,J Immunol Methods 306,151-160(2006))。
能够生成去岩藻糖基化抗体的细胞系的其它例子包括在蛋白质岩藻糖 基化中缺陷性的Lec13CHO细胞(Ripka et al.,Arch Biochem Biophys 249, 533-545(1986)；美国专利申请No.US 2003/0157108；及WO 2004/056312， 尤其在实施例11)。或者，可以将在本发明中有用的抗体糖工程化改造为在 Fc区中有减少的岩藻糖残基，其依照在EP 1176195A1、WO 03/084570、 WO 03/085119和美国专利申请公开No.2003/0115614、2004/093621、 2004/110282、2004/110704、2004/132140、美国专利No.6,946,292(Kyowa) 中公开的技术，例如通过减小或消除用于抗体生成的宿主细胞中GDP-岩藻 糖运输蛋白的活性进行。
在本发明中有用的糖工程化的抗体还可以在生成经修饰的糖蛋白的表 达系统中生成，如在WO 03/056914(GlycoFi,Inc.)或WO 2004/057002和WO 2004/024927(Greenovation)中教导的那些系统。
重组方法
用于生成在本发明中有用的抗体和免疫缀合物的方法是本领域公知 的，而且记载于例如WO 2012/146628；WO 2005/044859；WO 2006/082515；WO 2008/017963；WO 2005/005635；WO 2008/077546；WO 2011/023787；WO 2011/076683；WO 2011/023389；及WO 2006/100582。已 建立的用于生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法还记载于例如Harlow and Lane,"Antibodies,a laboratory manual",Cold Spring Harbor Laboratory,1988。
非天然发生抗体或其片段可以使用固相肽合成来构建，可以重组生成 (例如如美国专利No.4,816,567记载的)，或者可以例如通过筛选包含可变 重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如授予McCafferty的美国专利No. 5,969,108)。对于在本发明中有用的免疫缀合物和抗体的重组生成，分离一 种或多种编码所述免疫缀合物或抗体的多核苷酸并插入一种或多种载体， 用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易地分离此 类多核苷酸并测序。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有抗体 或免疫缀合物的编码序列以及适宜转录/翻译控制信号的表达载体。这些方 法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如 Maniatis et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；及Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y(1989)中记载的技术。
可以自编码完整免疫缀合物的单一多核苷酸或共表达的多种(例如两种 或更多种)多核苷酸表达在本发明中有用的免疫缀合物。由共表达的多核苷 酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性免疫缀合 物。例如，可以由与免疫缀合物包含抗体重链部分和效应器模块的部分分 开的多核苷酸编码抗体的轻链部分。在共表达时，重链多肽会与轻链多肽 联合以形成抗体。
适用于复制并支持重组蛋白表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适 当时，可用特定的表达载体转染或转导这类细胞，并且可以培养大量的含 载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的蛋白质，例如用于 临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物如大肠杆菌，或各种真核细 胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成 重组蛋白，尤其在不需要糖基化时。在表达后，可以将蛋白质在可溶性级 分中从细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物 如丝状真菌或酵母也是适合编码蛋白质的载体的克隆或表达宿主，包括其 糖基化途径已被“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化模式的蛋 白质的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)； 及Li et al.,Nat Biotech 24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)蛋白质的 宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细 胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆 状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可 以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177；No. 6,040,498；No.6,420,548；No.7,125,978；及No.6,417,429(描述用于在转基 因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿 主。例如，适应于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的 哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人 胚肾(HEK)系(293或293T细胞，如例如记载于Graham et al.,J Gen Virol 36, 59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细 胞，如例如记载于Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)的)、猴肾细胞 (CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾 细胞(MDCK)，牛鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞 (Hep G2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如记载 于Mather et al.,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)的)、MRC 5细胞和 FS4细胞。其它可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞， 包括dhfr-CHO细胞(Urlaub et al.,Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))； 和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产 的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp. 255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞、酵母 细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物、转基 因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主 细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、 人胚肾(HEK)293细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
如果抗体和免疫缀合物意图供人使用，那么可以使用嵌合形式的抗 体，其中抗体恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化 或全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可 以通过各种方法实现，包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到 人(例如受体抗体)框架和恒定区上，保留或不保留关键的框架残基(例如 那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)，(b)仅将非人 特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到 人框架和恒定区上，或(c)移植完整的非人可变域，但通过替换表面残基用 人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化的抗体及其制备方法综述于例如 Almagro and Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)，并且还记载于例如 Riechmann et al.,Nature 332,323-329(1988)；Queen et al.,Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337、No.7,527,791、No. 6,982,321、及No.7,087,409；Jones et al.,Nature 321,522-525(1986)； Morrison et al.,Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison and Oi, Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen et al.,Science 239,1534-1536 (1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri et al.,Methods 36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498 (1991)(描述“表面重建”)；Dall’Acqua et al.,Methods 36,43-60(2005)(描 述“FR改组”)；及Osbourn et al.,Methods 36,61-68(2005)及Klimka et al.,Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”办法)。可以使用本 领域中已知的各种技术来生成人抗体和人可变区。人抗体一般记载于van Dijk and van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)。人可变区能形成通过杂交瘤方法制备的 人单克隆抗体的一部分和自其衍生(参见例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变 区，所述转基因动物已经过修饰以应答抗原激发而生成完整的人抗体或具 有人可变区的完整抗体(参见例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125 (2005))。还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示库的Fv克隆可变区序列 来生成人抗体和人可变区(参见例如Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ, 2001)；及McCafferty et al.,Nature 348,552-554；Clackson et al.,Nature 352, 624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作 为Fab片段。
在某些实施方案中，将在本发明中有用的抗体工程化改造为具有增强 的结合亲和力，其依照例如公开于美国专利申请公开文本No.2004/0132066 的方法进行，其完整内容通过提述据此并入。可以经由酶联免疫吸附测定 法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术来测量在本发明中有用的抗 体结合特定抗原决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离振子共振技术 (在BIACORE T100系统上分析)(Liljeblad,et al.,Glyco J 17,323-329 (2000))和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。
可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的抗体和 免疫缀合物，所述技术如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和 层析、大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于因 素，如净电荷、疏水性、亲水性等，而且对于本领域中的技术人员将是明 显的。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供一种药物组合物，其在药学可接受载体中 包含(a)包含工程化改造成具有降低的效应器功能的第一抗体和效应器模块 的免疫缀合物，和(b)工程化改造成具有升高的效应器功能的第二抗体。这 些药物组合物可用于例如任何下文所述治疗性方法。
如本文中所描述的具有升高的效应器功能的免疫缀合物和抗体的药物 组合物通过混合具有期望纯度的此类免疫缀合物和抗体与一种或多种任选 的药学可接受载体(Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition,Mack Printing Company(1990))以冻干配制剂或水性溶液形式制备。一般地，药学 可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于 缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血 酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺； 苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对 羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲 酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶 或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨 酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它 碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸 如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物 (例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇 (PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸 如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透 明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。 某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文 本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种 别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性的冻干配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性配制剂包括那 些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组 氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的药物组合物还可含有另外的所治疗具体适应症所必需的活性 组分，特别是那些活性互补且彼此没有不利影响的组分。例如，如果要治疗 的疾病是癌症，那么可能想要进一步提供一种或多种抗癌剂，例如化疗剂、 肿瘤细胞增殖抑制剂、或肿瘤细胞凋亡激活剂。此类活性组分适于以有效用 于所需目的的量而组合存在。
活性组分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中 (例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在 胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳 米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition,Mack Printing Company(1990)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的 固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微 胶囊。
用于体内施用的组合物一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过 穿过无菌滤膜过滤。
治疗方法
本文中提供的(a)包含工程化改造成具有降低的效应器功能的第一抗体 和效应器模块的免疫缀合物和(b)工程化改造成具有升高的效应器功能的第 二抗体的组合可用于治疗方法。
在一个方面，提供了作为药物使用的(a)包含工程化改造成具有降低的 效应器功能的第一抗体和效应器模块的免疫缀合物和(b)工程化改造成具有 升高的效应器功能的第二抗体的组合。在别的方面，提供了在治疗疾病中 使用的(a)包含工程化改造成具有降低的效应器功能的第一抗体和效应器模 块的免疫缀合物，和(b)工程化改造成具有升高的效应器功能的第二抗体的 组合。在某些实施方案中，提供了在治疗方法中使用的(a)包含工程化改造 成具有降低的效应器功能的第一抗体和效应器模块的免疫缀合物，和(b)工 程化改造成具有升高的效应器功能的第二抗体的组合。在某些实施方案 中，本发明提供(a)包含工程化改造成具有降低的效应器功能的第一抗体和 效应器模块的免疫缀合物，和(b)工程化改造成具有升高的效应器功能的第 二抗体的组合，供治疗具有疾病的个体的方法中使用，包括对该个体施用 治疗有效量的组合。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对该个体 施用治疗有效量的至少一种别的治疗剂，例如下文所述。在别的实施方案 中，本发明提供(a)包含工程化改造成具有降低的效应器功能的第一抗体和 效应器模块的免疫缀合物，和(b)工程化改造成具有升高的效应器功能的第 二抗体的组合，供刺激效应细胞功能中使用。在某些实施方案中，本发明 提供(a)包含工程化改造成具有降低的效应器功能的第一抗体和效应器模块 的免疫缀合物，和(b)工程化改造成具有升高的效应器功能的第二抗体的组 合，供在个体中刺激效应细胞功能的方法中使用，包括对该个体施用有效 量的组合以刺激效应细胞功能。依照任何上述实施方案的“个体”为哺乳动 物，特别是人。依照任何上述实施方案的“疾病”为可通过刺激效应细胞功 能来治疗的疾病。在某些实施方案中，疾病为细胞增殖病症，特别是癌 症。
在又一个方面，本发明提供(a)包含工程化改造成具有降低的效应器功 能的第一抗体和效应器模块的免疫缀合物，和(b)工程化改造成具有升高的 效应器功能的第二抗体的组合在制造或制备药物中的用途。在一个实施方 案中，药物用于治疗疾病。在又一个实施方案中，药物用于治疗疾病的方 法，包括对具有疾病的个体施用治疗有效量的药物。在一个此类实施方案 中，该方法进一步包括对该个体施用治疗有效量的至少一种别的治疗剂， 例如下文所述。在又一个实施方案中，药物用于刺激效应细胞功能。在又 一个实施方案中，药物用于在个体中刺激效应细胞功能的方法，包括对该 个体施用有效刺激效应细胞功能的量的药物。依照任何上述实施方案的“个 体”为哺乳动物，特别是人。依照任何上述实施方案的“疾病”为可通过刺激 效应细胞功能来治疗的疾病。在某些实施方案中，疾病为细胞增殖病症， 特别是癌症。
在又一个方面，本发明提供治疗疾病的方法。在一个实施方案中，该 方法包括对具有此类疾病的个体施用治疗有效量的(a)包含工程化改造成具 有降低的效应器功能的第一抗体和效应器模块的免疫缀合物，和(b)工程化 改造成具有升高的效应器功能的第二抗体的组合。在一个此类实施方案 中，该方法进一步包括对该个体施用治疗有效量的至少一种别的治疗剂， 如下文所述。依照任何上述实施方案的“个体”为哺乳动物，特别是人。依 照任何上述实施方案的“疾病”为可通过刺激效应细胞功能来治疗的疾病。 在某些实施方案中，疾病为细胞增殖病症，特别是癌症。
在又一个方面，本发明提供在个体中刺激效应细胞功能的方法。在一 个实施方案中，该方法包括对该个体施用有效量的(a)包含工程化改造成具 有降低的效应器功能的第一抗体和效应器模块的免疫缀合物，和(b)工程化 改造成具有升高的效应器功能的第二抗体的组合，以刺激效应细胞功能。 在一个实施方案中，“个体”为哺乳动物，特别是人。
在又一个方面，本发明提供药物组合物包含本文中提供的任何(a)包含 工程化改造成具有降低的效应器功能的第一抗体和效应器模块的免疫缀合 物，和(b)工程化改造成具有升高的效应器功能的第二抗体的组合，例如用 于任何上述治疗方法。在一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的(a) 包含工程化改造成具有降低的效应器功能的第一抗体和效应器模块的免疫 缀合物和(b)工程化改造成具有升高的效应器功能的第二抗体的组合，和药 学可接受载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任何 组合和至少一种别的治疗剂，例如如下文所述。
依照任何上述实施方案，疾病为可通过刺激效应细胞功能来治疗的病 症。本发明的组合在治疗刺激宿主免疫系统是有益的疾病状态中是有用 的，特别是想要增强细胞免疫应答的疾患。这些可包括宿主免疫应答不足 或缺陷的疾病状态。可施用本发明的组合的疾病状态包括例如细胞免疫应 答对特异性免疫力会是至关重要的机制的肿瘤或感染。可采用本发明的组 合的具体疾病状态包括癌症，具体是肾细胞癌或黑素瘤；免疫缺陷，具体 是HIV阳性患者、免疫遏制患者、慢性感染等等。在某些实施方案中，疾病 为细胞增殖病症。在一个特定实施方案中，疾病为癌症，具体是选自下组 的癌症：肺癌，结直肠癌，肾癌，前列腺癌，乳腺癌，头和颈癌，卵巢 癌，脑癌，淋巴瘤，白血病，皮肤癌。
本发明的组合可以单独地或与其它药剂一起地在疗法中使用。例如， 本发明的组合可以与至少一种别的治疗剂共施用。在某些实施方案中，别 的治疗剂为抗癌剂，例如化疗剂、肿瘤细胞增殖抑制剂、或肿瘤细胞凋亡 激活剂。
本文中提供的联合疗法涵盖抗体和免疫缀合物的一起施用(其中两种或 更多种治疗剂包含在相同的或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况 中，可以在施用免疫缀合物、别的治疗剂和/或辅助剂之前、同时、和/或之 后发生抗体的施用。本发明的组合也可以与放射疗法组合。
可以通过任何合适的手段，包括胃肠外、肺内、和鼻内，及若期望用 于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的组合(和任何别的治疗剂)。 胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。抗体和 免疫缀合物可以通过相同的或不同的路径来施用。部分根据施用是短暂的还 是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉 内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次 施用或在多个时间点里的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
将以与优良医学实践一致的方式配制、给药和施用本发明的组合。在 此背景中考虑的因素包括待治疗的特定病症、待治疗的特定哺乳动物、个 体患者的临床状况、病症的起因、药剂的投递部位、施用方法、施用时间 安排以及医学从业人员已知的其它因素。该组合无需但任选地与一种或多 种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。此类其它药物的有效量 取决于配制剂中所存在的抗体和免疫缀合物的量、病症或治疗的类型、以 及其它上述讨论的因素。这些通常以本文所述相同的剂量和给药途径使 用，或以约1-99％的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径 使用，所述剂量和途径是凭经验/临床确定为合适的。
为了预防或治疗疾病，抗体和免疫缀合物的合适剂量(当在本发明的组 合中使用时，任选与一种或多种其它另外的治疗剂一起)将取决于待治疗疾 病的类型、抗体和免疫缀合物的类型、疾病的严重程度和进程、施用组合 是为了预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对抗体和/或免疫 缀合物的响应、以及主治医师的判断。抗体和免疫缀合物适宜地在一次或 一系列治疗中施用给患者。
根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg–10 mg/kg)的抗体可作为用于患者施用的起始候选剂量，不管是例如通过一次 或多次分开的施用，还是通过连续输注。根据上文提及的因素，一种典型 的每日剂量的范围可以从约1μg/kg至100mg/kg或更高。对于在数天或更长 时间的重复施用，根据状况一般将持续治疗直至发生对疾病症状的期望的 抑制。抗体的一种例示性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。如 此，可以对患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10 mg/kg(或其任意组合)。可以间歇地施用这类剂量，例如每周或每3周(例 如使得患者接受约2至约20、或例如约6剂的抗体)。可以施用起始较高的加 载剂量继之以一剂或多剂较低剂量。一种例示性剂量给药方案包括施用约4 mg/kg的初始加载剂量，接着是约2mg/kg抗体的每周一次维持剂量。关于 剂量的考虑事项同样适用于依照本发明的组合中使用的免疫缀合物。然 而，可以使用其它剂量方案。通过常规技术和测定法能容易地监测该疗法 的进行。
制品
在本发明的另一个方面，提供含有可用于治疗、预防和/或诊断上文描 述的病症的材料的制品。所述制品包含一个或多个容器和容器上或与容器 联合的标签或包装插页。合适的容器包括，例如瓶、管形瓶、注射器、IV 溶液袋等。所述容器可从多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器容纳组合 物，其自身或与其它组合物组合对于治疗、预防和/或诊断状况是有效的， 并且可以具有无菌的存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的 塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中至少一种活性剂是要在本发明的 组合中使用的抗体。另一种活性剂是要在本发明的组合中使用的免疫缀合 物，其可以在像抗体一样的相同的组合物和容器中，或者可以在不同的组 合物和容器中提供。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的状况。
在一个方面，本发明提供一种意图用于治疗疾病的试剂盒，其在相同 的容器中或在分开的容器中包含(a)包含工程化改造成具有降低的效应器功 能的第一抗体和效应器模块的免疫缀合物，和(b)工程化改造成具有升高的 效应器功能的第二抗体，且任选进一步包含(c)包装插页，其包括指导作为 治疗疾病的方法使用该组合治疗的印刷说明书。此外，所述试剂盒可以包 含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含工程化改造成具有 升高的效应器功能的抗体；(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合 物包含免疫缀合物，该免疫缀合物包含工程化改造成具有降低的效应器功 能的抗体和效应器模块；和任选的(c)其中含有组合物的第三容器，其中所 述组合物包含另外的细胞毒性剂或其它治疗剂。本发明的这一实施方案中 的试剂盒还可以包含包装插页，其指示该组合物可用于治疗特定状况。或 者/另外地，所述试剂盒还可以包含第三(或第四)容器，其包含药学可接受 的缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格(Ringer) 氏溶液和右旋糖溶液。制品可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其 它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应理解鉴于上文提供的一般 性描述，可以实践各种其他实施方案。
通用方法
抗体Fc区的糖工程化改造导致升高的对人FcγRIII受体的结合亲和力， 其继而转化成增强的ADCC诱导和抗肿瘤功效。人FcγRIII受体在巨噬细 胞、嗜中性粒细胞、和天然杀伤(NK)、树突和γδT细胞上表达。在小鼠 中，临床前功效测试中最广泛利用的种类，鼠FcγRIV，人FcγRIIIa的鼠同源 物，存在于巨噬细胞和嗜中性粒细胞上但不存在于NK细胞上。因此，糖工 程化抗体任何预期的改善功效并非完完全全在那些模型中得到反映。我们 生成了人FcγRIIIa(CD16a)转基因小鼠，其展现血液、淋巴样组织和肿瘤 中的鼠NK细胞上稳定的人CD16a表达。此外，这些转基因小鼠的血液中的 未刺激NK细胞上的人CD16a表达水平反映在人中发现的。我们还显示了抗 体疗法后肿瘤相关NK细胞上人FcγRIIIa的下调与抗肿瘤活性有关。最后， 我们显示了糖工程化抗体处理在使用这种新的小鼠品系的肿瘤模型中与它 们的人CD16阴性同窝幼仔相比显著改善的功效。
实施例1：FaDu头和颈癌异种移植物模型
在舌内注射入SCID小鼠的人头和颈癌细胞系FaDu中测试包含IL-2四重 突变体(qm)(分别为SEQ ID NO：125，126，129，和SEQ ID NO： 133-135)和抗EGFR GlycoMab(SEQ ID NO：102和103)的FAP靶向性28H1 IgG-IL2和非靶向性DP47GS IgG-IL2免疫缀合物。这种肿瘤模型在新鲜冷冻 组织上通过IHC显示为FAP呈阳性。FaDu细胞最初得自ATCC(美国典型培养 物保藏中心)并在扩充后保藏于Glycart内部细胞库。在含有10％FCS (Gibco)的DMEM中于37℃在水饱和气氛中以5％CO2例行培养该肿瘤细胞 系。将体外传代9用于舌内注射，存活率95.8％。舌内注射20μl细胞悬浮液 (AimV培养基(Gibco)中的2x 105个FaDu细胞)。将实验开始时8-9周龄 的雌性SCID小鼠(Taconics，Denmark)在无特定病原体的条件下以12小时 光照/12小时黑暗的每日周期依照承诺的原则(GV-Solas；Felasa；TierschG) 维持。实验用研究方案得到地方政府审查并批准(P 2008016)。到达后，将 动物维持1周以适应新环境并进行观察。定期地进行连续健康监测。在研究 第0天给小鼠舌内注射2x 105个FaDu细胞，随机化并称重。肿瘤细胞注射后 1周，每周一次给小鼠静脉内注射28H1IgG-IL2qm免疫缀合物、DP47GS IgG-IL2qm免疫缀合物、抗EGFR GlycoMab、28H1IgG-IL2qm免疫缀合物 和抗EGFR GlycoMab的组合、或DP47GS IgG-IL2qm免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab的组合，持续4周。给所有小鼠静脉内注射200μl恰当溶液。表2 中规定了剂量。给媒介组中的小鼠注射PBS而给处理组注射28H1IgG-IL2 qm免疫缀合物、DP47GS IgG-IL2qm免疫缀合物、抗EGFR GlycoMab、 28H1IgG-IL2qm免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab的组合、或DP47GS IgG-IL2qm免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab的组合。为了获得每200μl适当 量的免疫缀合物，在必要时用PBS稀释储备溶液。图1A显示只有FAP靶向性 28H1IgG-IL2qm免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab的组合与单独的28H1 IgG-IL2qm免疫缀合物或抗EGFR GlycoMab相比就增强的中值存活而言介 导卓越的功效。与之相反，非靶向性DP47GS IgG-IL2qm和抗EGFR GlycoMab的组合没有显示胜过单一药剂施用的卓越性(图1B)。
表2
实施例2：IL-2免疫缀合物对NK细胞杀伤能力的体外强化
为了测定免疫缀合物的NK细胞的影响，我们评估了用免疫缀合物，特 别是包含IL-2作为效应器模块的免疫缀合物处理后对肿瘤细胞的杀伤。为了 这个目的，使用Histopaque-1077(Sigma Diagnostics Inc.，St.Louis，MO， USA)依照标准规程分离外周血单个核细胞(PBMC)。简言之，用肝素化注 射器自健康志愿者采集静脉血。将血液用不含钙或镁的PBS 2:1稀释并在 Histopaque-1077上成层。在不中断的情况下将梯度于室温(RT)以450x g 离心30分钟。收集含有PBMC的中间相并用PBS清洗总共3次(350x g，继以 300x g，10分钟，室温)。
将分离的PBMC与IL-2(Proleukin)或IL-2免疫缀合物一起温育，添加至 细胞上清液，持续45小时。随后，回收PBMC并以E:T 10:1用于抗EGFR GlycoMab介导的对A549细胞的ADCC，持续4小时。通过测量进入细胞上清 液的LDH释放(Roche细胞毒性检测试剂盒LDH)来检测靶细胞杀伤。图2 显示在不同浓度的抗EGFR GlycoMab存在下，用或未用0.57nM(a)或5.7nM (b)FAP靶向性28H1IgG-IL2qm免疫缀合物或IL-2(Proleukin)预处理的 PBMC的总体A549肿瘤细胞杀伤。图显示对效应细胞的免疫缀合物预处理导 致与未处理效应细胞相比，渐增浓度的GlycoMab的靶细胞杀伤有极大升高。
实施例3：LS174T结直肠异种移植物模型
在脾内注射入SCID-人FcγRIII转基因小鼠的人结直肠LS174T细胞系中 测试CEA靶向性CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物(SEQ ID NO：136-138)、 抗EGFR GlycoMab(SEQ ID NO：102和103)和cetuximab。这种肿瘤模型在 新鲜冷冻组织上通过IHC显示为CEA呈阳性。LS174T细胞(人结肠癌细胞) 最初得自ECACC(欧洲细胞培养物保藏中心)并在扩充后保藏于Glycart内 部细胞库。在含有10％FCS(PAA Laboratories，Austria)、1％Glutamax和 1％MEM非必需氨基酸(Sigma)的MEM Eagle氏培养基中培养LS174T。于 37℃在水饱和气氛中以5％CO2培养细胞。将体外传代19或23用于脾内注 射，存活率99％。在麻醉的SCID FcγRIII转基因小鼠的左腹部位做一小切 口。穿过就在脾囊下的腹壁注射30μl细胞悬浮液(AimV培养基中的2x 106个LS174T细胞)。使用夹钳或可溶解缝合线闭合皮肤伤口。实验开始时8-9 周龄的雌性SCID FcγRIII转基因小鼠(购自Taconics，Denmark)在无特定病 原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期依照承诺的原则 (GV-Solas；Felasa；TierschG)维持。实验用研究方案得到地方政府审查并 批准(P 2008016，P2011/128)。到达后，将动物维持1周以适应新环境并进 行观察。定期地进行连续健康监测。在研究第0天给小鼠脾内注射2x 106个 LS174T细胞，随机化和称重。肿瘤细胞注射后1周，每周一次给小鼠静脉内 注射CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物、抗EGFR GlycoMab、cetuximab、 CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab的组合或CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和cetuximab的组合，持续3周。给所有小鼠静脉内注 射200μl恰当溶液。表3中规定了剂量。给媒介组中的小鼠注射PBS而给处 理组注射CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物或抗EGFR GlycoMab、 cetuximab、CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab的组合、 或CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和cetuximab的组合。为了获得每200μl适 当量的免疫缀合物，在必要时用PBS稀释储备溶液。图3和表3A和3B显示 CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab的组合与单独的 CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物、单独的抗EGFR GlycoMab、单独的 cetuximab、或CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和cetuximab的组合相比就增 强的中值和总体存活而言介导卓越的功效。
表3
表3A：与图3A对应的存活数据的汇总
表3B：与图3B对应的存活数据的汇总
实施例4：A549肺异种移植物模型
在静脉内注射入SCID-人FcγRIII转基因小鼠的人NSCLC细胞系A549中 测试CEA靶向性CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物(SEQ ID NO：136-138)、 抗EGFR GlycoMab(SEQ ID NO：102和103)和cetuximab。
A549非小细胞肺癌细胞最初得自ATCC(CCL-185)并在扩充后保藏于 Roche-Glycart内部细胞库。在含有10％FCS(Gibco)的DMEM中于37℃在 水饱和气氛中以5％CO2例行培养该肿瘤细胞系。将传代8用于移植，存活率 97-98％。在200μl Aim V细胞培养基(Gibco)中将每只动物5x 106个细胞静 脉内注射入的尾静脉。
将实验开始时8-9周龄的雌性SCID-FcγRIII小鼠(Roche-Glycart； Switzerland)(bred at Charles Rivers，Lyon，France)在无特定病原体的条件 下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期依照承诺的原则(GV-Solas； Felasa；TierschG)维持。实验用研究方案得到地方政府审查并批准(P 2011/128)。到达后，将动物维持1周以适应新环境并进行观察。定期地进行 连续健康监测。
在研究第0天给小鼠静脉内注射5x 106个A549细胞，随机化和称重。肿 瘤细胞注射后1周(图4A)或2周(图4B)，每周一次给小鼠静脉内注射 CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物、抗EGFR GlycoMab、cetuximab、 CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab的组合、或CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和cetuximab的组合，持续3周。给所有小鼠静脉内注 射200μl恰当溶液。表4中规定了剂量。给媒介组中的小鼠注射PBS而给处 理组注射CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物、抗EGFR GlycoMab、CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab的组合、或CH1A1A IgG-IL2 qm免疫缀合物和cetuximab的组合。为了获得每200μl适当量的免疫缀合 物，在必要时用PBS稀释储备溶液。
图4和表4A和4B显示CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab的组合与单独的相应免疫缀合物、抗EGFR GlycoMab或cetuximab 以及CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和cetuximab的组合相比就增强的中值 和总体存活而言介导卓越的功效。
表4
表4A：与图4A对应的存活数据的汇总
表4B：与图4B对应的存活数据的汇总
实施例5：LS174T结直肠异种移植物模型
在脾内注射入SCID-人FcγRIII转基因小鼠的人结直肠LS174T细胞系中 测试CEA靶向性CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物(SEQ ID NO：136-138)和 抗Her3GlycoMab(SEQ ID NO：142和146)。
LS174T细胞(人结肠癌细胞)最初得自ECACC(欧洲细胞培养物保藏 中心)并在扩充后保藏于Roche-Glycart内部细胞库。在含有10％FCS(PAA Laboratories，Austria)、1％Glutamax和1％MEM非必需氨基酸(Sigma)的 MEM Eagle氏培养基中培养LS174T。于37℃在水饱和气氛中以5％CO2培养 细胞。将体外传代21用于脾内注射，存活率97.9％。在麻醉的SCID-人 FcγRIII转基因小鼠的左腹部位做一小切口。穿过就在脾囊下的腹壁注射30 μl细胞悬浮液(AimV培养基中的2x 106个LS174T细胞)。使用可溶解缝合 线闭合皮肤伤口。
实验开始时8-9周龄的雌性SCID-人FcγRIII转基因小鼠(Roche-Glycart， Switzerland)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期 依照承诺的原则(GV-Solas；Felasa；TierschG)维持。实验用研究方案得到 地方政府审查并批准(P 2011/128)。到达后，将动物维持1周以适应新环境 并进行观察。定期地进行连续健康监测。
在研究第0天给小鼠脾内注射2x 106个LS174T细胞，随机化和称重。肿 瘤细胞注射后1周，每周一次给小鼠静脉内注射CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀 合物、抗Her3GlycoMab或CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和抗Her3 GlycoMab的组合，持续3周。
给所有小鼠静脉内注射200μl恰当溶液。表5中规定了剂量。给媒介组 中的小鼠注射PBS而给处理组注射CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物、抗Her3 GlycoMab或CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和抗Her3GlycoMab的组合。为 了获得每200μl适当量的免疫缀合物，在必要时用PBS稀释储备溶液。图5 和表5A显示CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物和抗Her3GlycoMab的组合与单 独的CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物或抗Her3GlycoMab相比就增强的中值 存活而言介导卓越的功效。
表5
表5A：与图5对应的存活数据的汇总
实施例6：ACHN肾癌异种移植物模型
在肾内注射入SCID-人FcγRIII转基因小鼠的人肾细胞系ACHN中测试包 含IL-2四重突变型(qm)的FAP靶向性28H1IgG-IL2免疫缀合物(SEQ ID NO： 125，126和129)和抗EGFR GlycoMab(SEQ ID NO：102和103)。
ACHN细胞(人肾腺癌细胞)最初得自ATCC(美国典型培养物保藏中 心)并在扩充后保藏于Roche-Glycart内部细胞库。在含有10％FCS的DMEM 中培养ACHN。于37℃在水饱和气氛中以5％CO2培养细胞。将体外传代22 用于肾内注射，存活率96.4％。在麻醉的SCID-人FcγRIII转基因小鼠的右体 侧和腹膜壁做一小切口(2cm)。在肾中囊下2mm注射50μl(AimV培养基 中的1x 106个ACHN细胞)细胞悬浮液。使用可溶解缝合线闭合皮肤伤口和 腹膜壁。
实验开始时8-9周龄的雌性SCID-人FcγRIII转基因小鼠(Roche-Glycart， Switzerland)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期 依照承诺的原则(GV-Solas；Felasa；TierschG)维持。实验用研究方案得到 地方政府审查并批准(P 2011/128)。到达后，将动物维持1周以适应新环境 并进行观察。定期地进行连续健康监测。
在研究第0天给小鼠肾内注射1x 106个ACHN细胞，随机化和称重。肿瘤 细胞注射后1周，给小鼠静脉内注射媒介、抗EGFR-GlycoMab、28H1IgG-IL2 免疫缀合物和抗EGFR-GlycoMab的组合、或和抗EGFR-GlycoMab 的组合。一周一次给药EGFR-GlycoMab和28H1IgG-IL2免疫缀合物，持续3 周。自周一至周五每天注射持续3周。
给所有小鼠静脉内注射200μl恰当溶液。表6中规定了剂量。给媒介组中 的小鼠注射PBS而给处理组注射抗EGFR-GlycoMab、28H1IgG-IL2免疫缀合 物和抗EGFR-GlycoMab的组合、或和抗EGFR-GlycoMab的组合。 为了获得每200μl适当量的免疫缀合物，在必要时用PBS稀释储备溶液。
图6和表6A显示28H1IgG-IL2免疫缀合物和抗EGFR-GlycoMab的组合与 单独的抗EGFR-GlycoMab和和抗EGFR-GlycoMab的组合相比就 增强的中值和总体存活而言介导卓越的功效。
表6
表6A：与图6对应的存活数据的汇总
实施例7：IL-2免疫缀合物对NK细胞杀伤能力和NK细胞CD25和CD69表达 的体外强化
就像实施例2中，我们评估了用免疫缀合物，特别是包含IL-2作为效应 器模块的免疫缀合物，和GlycoMab(这种情况中是抗Her3GlycoMab)处理 后NK细胞对肿瘤细胞(LS174T)的杀伤。通过测量进入细胞上清液的LDH 释放来检测靶细胞杀伤。
自新鲜血液分离PBMC。简言之，将血液用PBS 3:1稀释。将约30ml血 液/PBS混合物堆叠在15ml Histopaque(Sigma)上并在不中断的情况下以450 g离心30分钟。用5ml移液器将淋巴细胞收集入装有PBS的50ml管。用PBS 将管充满至50ml并以350g离心10分钟。丢弃上清液，在50ml PBS中重悬 浮团粒并以300g离心10分钟。重复清洗步骤1次。对细胞计数并在预温热的 含有1％谷氨酰胺和10％FCS的RPMI中以1x 106个细胞每ml重悬浮。将细胞 于37℃温育过夜。次日，收获细胞并计数。
LS174T(ECACC#87060401)是人高加索结肠腺癌细胞系。在含有1％ 谷氨酰胺、1％非必需氨基酸和10％FCS的EMEM中培养细胞并在达到汇合 之前2至3天拆分。使用胰蛋白酶解离LS174T细胞。对细胞计数并检查存活 率。测定法之前的细胞存活率为99.4％。将细胞在它们的相应培养基中以 0.3x 106每ml重悬浮。将100μl细胞悬浮液接种入经过处理的96孔细胞培养 平底板并于37℃温育过夜。次日，自细胞除去上清液。然后将50μl稀释的 抗Her3GlycoMab(SEQ ID NO：142和146)(1000ng/ml、100ng/ml和10 ng/ml)或培养基添加至相应孔。然后，以指定浓度(见图7)将50μl CEA 靶向性CH1A1A IgG-IL2qm免疫缀合物(SEQ ID NO：136-138)或培养基添 加至每个孔。于室温温育10分钟后，以3x 106个细胞每ml添加100μl PBMC 或培养基以达到终体积200μl每孔。将细胞在温箱中温育24小时。温育后， 将板以400g离心4分钟并收集上清液。使用50μl每孔上清液来测量LDH释 放(Roche细胞毒性检测试剂盒LDH)。将剩余上清液保存于-20℃直至别的 使用。在开始FACS染色(见下文)之前，将细胞重悬浮于FACS缓冲液并保 存于4℃
图7显示用单独的抗Her3GlycoMab(左边小图)、单独的CH1A1A IgG-IL-2qm免疫缀合物(右边小图)或CH1A1A IgG-IL-2qm免疫缀合物与 抗Her3GlycoMab的组合(右边小图)处理后PBMC所致总体LS174T细胞杀 伤。
24小时后收获PBMC并用于NK细胞CD25和CD69表达的FACS分析。将 细胞以400g离心4分钟并用含有0.1％BSA的PBS(FACS缓冲液)清洗1次。 然后将20μl每孔抗体混合物添加至细胞。将细胞在电冰箱中温育30分钟。 之后将细胞用FACS缓冲液清洗2次并重悬浮于每孔200μl含有2％PFA的 FACS缓冲液。使用BD FACS Fortessa和下述抗体混合物实施分析：CD3 PE/Cy7(BioLegend，#300420；稀释1:40)，CD56APC(BioLegend #318310；稀释1:20)，CD69亮紫421(BioLegend#310929；稀释1:40)， CD25PE(BD Bioscience#557138；稀释1:20)。
图8显示用单独的抗Her3GlycoMab(左边小图)、单独的CH1A1A IgG-IL-2qm免疫缀合物(右边小图)或CH1A1A IgG-IL-2qm免疫缀合物与 抗Her3GlycoMab的组合(右边小图)处理后NK细胞上的CD25(a)或CD69(b) 表达。
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尽管为了理解清楚已通过例示和实施例相当详细地描述了前述发明， 但该描述和实施例不应理解为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利 和科学文献的公开内容均通过提述完整明确收录。
机译： 一种包含两种抗体的组合物，该两种抗体经过工程改造以降低和增强效应子功能。
机译： 一种包含两种抗体的组合物，该两种抗体经过工程改造以降低和增强效应子功能。
机译： 包含两种可降低和增加效应子功能的抗体的组合物
