从玉米中分离的组织特异性启动子及其应用

摘要

本发明公开了从玉米中分离的组织特异性启动子及其应用，属于植物组织特异性启动子的分离和应用领域。本发明从玉米中分离获得核苷酸序列为SEQ ID NO.1的组织特异性启动子，本发明进一步将其截短获得SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的仍具有组织特异性启动子功能的序列。本发明还公开了含有所述组织特异性启动子的重组植物表达载体以及重组宿主细胞。本发明进一步公开了所述组织特异性启动子在提高作物种子品质、改良作物性状以及培育转基因植物新品种等方面的应用。

说明书

技术领域

发明涉及一种从植物中分离的启动子，尤其涉及从玉米(Zea mays)中分离的组 织特异性启动子，本发明还涉及含有该组织特异性启动子的重组植物表达载体以及宿 主细胞，本发明进一步涉及它们在提高作物种子品质、改良作物性状、培育植物新品 种等方面的应用，属于植物组织特异性启动子的分离及其应用领域。

背景技术

启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，是重要的顺式作用元件， 一般位于结构基因5’端上游区。高等植物基因调控主要在转录水平进行，启动子控制 着基因表达的起始时间和表达程度，同时对所使用的RNA聚合酶类型也起着决定性 作用，所以启动子是理解基因表达模式和转录调控机制的关键，是植物基因转录调控 的中心。

根据启动子的转录模式及功能，可将其分为三类：组成型启动子、组织或器官 特异性启动子和诱导型启动子。目前，在植物基因工程中使用的大多数为组成型启动 子，使外源目的基因在植物各组织部位高水平表达，但是组成型启动子也有诸多缺点， 例如，不能从时间和空间上有效地调控目的基因的表达，过度消耗细胞内的物质和能 量(Gittins JR,Pellny TK,Hiles ER,Rosa C,Biricolti S,et al.(2000)Transgene  expression driven by heterologous ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase  small-subunit gene promoters in the vegetative tissues of apple(Malus pumila mill.). Planta 210:232-240.)；大量异源蛋白或代谢产物在植物体内积累，打破植物的代谢 平衡，不利于植物生长(Robinson DJ(1996)Environmental risk assessment of releases of  transgenic plants containing virus-derived inserts.Transgenic research 5:359-362.)；容 易引起基因沉默或共抑制现象(Kumpatla SP,Chandrasekharan MB,Iyer LM,Guofu L, Hall TC(1998)Genome intruder scanning and modulation systems and transgene  silencing.Trends in Plant Science 3:97-104；Mette MF,Aufsatz W,van der Winden J, Matzke MA,Matzke AJ(2000)Transcriptional silencing and promoter methylation  triggered by double-stranded RNA.EMBO J 19:5194-5201.)。因此，科学家们不断寻 找更为有效的组织或器官特异性启动子来代替组成型启动子，以期更精确的调控外源 基因的表达。

组织或器官特异性启动子调控下的基因转录过程一般只发生在某些特定的组织 或者器官中。组织或器官特异性表达启动子可以更加经济有效的调控外源基因的表 达，特异地在特定需要的部位发挥作用，这样不仅可以提高外源基因的表达丰度，而 且将生物能耗降到最低，从而不影响植株的正常生长。

玉米(Zea mays)是中国最大的粮食作物，也是重要的转基因作物。玉米组织特异性 启动子可分为根、茎、叶、花、胚、胚乳、果实、木质部、绿色组织等组织或器官特异性 启动子，每一类型的组织特异性启动子都具有一些特殊的功能元件。从玉米中分离获得组 织特异性启动子，可以利用该组织特异性启动子驱动目的基因在植物组织中进行特异性的 高效表达，这对玉米进行分子改良或生产具有特殊用途的新玉米品种等方面有重要的意 义。

发明内容

本发明目的之一是提供从玉米(Zea mays)中分离的组织特异性启动子。

本发明目的之二是提供含有上述组织特异性启动子的重组表达载体以及含有该 重组表达载体的宿主细胞。

本发明目的之三是将所述的组织特异性启动子以及含有该组织特异性启动子的 重组表达载体应用于构建转基因植物、改良农作物种子性状、培育具有优良性状的植 物新品种等。

为实现上述目的，本发明首先提供了一种从玉米(Zea mays)中分离的组织特 异性启动子，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)或(d)所示:

(a)、SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列；或

(b)、与SEQ ID NO.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多 核苷酸仍具有组织特异性启动子的功能或活性；或

(c)、与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少有60％以上同源性的多核苷酸序列，且 该多核苷酸具有组织特异性启动子的功能或活性；优选的，与SEQ ID NO.1的多核苷酸 序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有组织特异性启动子的功 能或活性；更优选的，与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷 酸序列，且该多核苷酸具有组织特异性启动子的功能或活性；最优选的，与SEQ ID NO.1 的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有组织特异性 启动子的功能或活性；或

(d)、在SEQ ID NO.1的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入获得的多 核苷酸变体，该多核苷酸变体包含SEQ ID NO.2所示序列，且该多核苷酸变体仍具有组 织特异性启动子的功能或活性。

本发明将SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列从5’端逐渐删除部分序列获得的SEQ  ID NO.2所示的181bp的启动子缺失片段(为-181—+1之间的片段)。

本发明将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的多核苷酸与GUS基因可操作的连 接，分别构建得到重组植物表达载体；以玉米为受体材料，采用基因枪转化的瞬时表 达体系对启动子进行功能验证，试验结果表明SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2驱动的GUS 基因仅在玉米种子的胚中进行特异性表达，在玉米种子胚乳、根、茎、叶等其它组织 部位里没有GUS表达活性；试验结果证实，本发明从玉米中所分离的SEQ ID NO.1或 SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为组织特异性启动子。

本发明进一步将SEQ ID NO.1所示的全长启动子从5’端开始逐渐删除得到四个截 短的启动子片段P_85502-4(SEQ ID NO.3)、P_85502-0(SEQ ID NO.4)、P_85502-2(SEQ ID NO.5)、 P_85502-6(SEQ ID NO.6)；将截短后的四个序列分别连接到带有报告基因的表达载体上构 建得到稳定表达载体p85502-4G3、p85502-0G3、p85502-2G3和p85502-6G3；将稳定 表达载体p85502-0G3和稳定表达载体p85502-2G3采用农杆菌介导的方法分别转化了 玉米材料，将稳定表达载体p85502-4G3和稳定表达载体p85502-6G3按照农杆菌介导 的方法分别转化了拟南芥，得到了稳定转化的转基因植株；功能验证结果表明，启动子 缺失片段P_85502-0仍具有在胚组织中启动报告基因表达的功能，启动子缺失片段 P_85502-0是一个启动子活性降低的在正常生理条件下的胚组织特异性启动子，但在机械 损伤诱导下在叶鞘组织表现出诱导表达的特性。从转基因拟南芥各组织染色结果可以 看出，更短的P₈₅₅₀₂缺失片段仍具有启动子活性，只是P_85502-4与P_85502-6比较而言仍 保持有诱导表达的特性。

在转基因玉米/拟南芥中驱动报告基因GUS表达的结果可以看出，这四个启动 子缺失片段仍具有启动子的活性，但其启动强度和组织特异性均发生一些改变。因此， 本发明提供了一种SEQ ID NO.2所示的组织特异启动子的缺失片段，其多核苷酸序列 为(a)、(b)、(c)或(d)所示:

(a)、SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列；或

(b)、与SEQ ID NO.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多 核苷酸仍具有启动子的功能或活性；或

(c)、与SEQ ID NO.2的多核苷酸序列至少有60％以上同源性的多核苷酸序列，且 该多核苷酸具有启动子的功能或活性；优选的，与SEQ ID NO.2的多核苷酸序列至少有 80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有启动子的功能或活性；更优选的，与 SEQ ID NO.2的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有 启动子的功能或活性；最优选的，与SEQ ID NO.2的多核苷酸序列至少有95％以上同源 性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有启动子的功能或活性；或

(d)、在SEQ ID NO.2的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入获得的多 核苷酸变体，该多核苷酸变体含有SEQ ID NO.2中第47-53位的6bp碱基，且该多核苷酸 变体仍具有启动子的功能或活性。

本发明提供了SEQ ID NO.3所示的启动子缺失片段，其多核苷酸序列为(a)、 (b)、(c)或(d)所示:

(a)、SEQ ID NO.3所示的多核苷酸序列；或

(b)、与SEQ ID NO.3的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多 核苷酸仍具有启动子的功能或活性；或

(c)、与SEQ ID NO.3的多核苷酸序列至少有60％以上同源性的多核苷酸序列，且 该多核苷酸具有启动子的功能或活性；优选的，与SEQ ID NO.3的多核苷酸序列至少有 80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有启动子的功能或活性；更优选的，与 SEQ ID NO.3的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有 启动子的功能或活性；最优选的，与SEQ ID NO.3的多核苷酸序列至少有95％以上同源 性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有启动子的功能或活性；或

(d)、在SEQ ID NO.3的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入获得的多 核苷酸变体，且该多核苷酸变体仍具有启动子的功能或活性。

本发明还提供了SEQ ID NO.4所示的启动子缺失片段，其多核苷酸序列为(a)、 (b)、(c)或(d)所示:

(a)、SEQ ID NO.4所示的多核苷酸序列；或

(b)、与SEQ ID NO.4的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多 核苷酸仍具有启动子的功能或活性；或

(c)、与SEQ ID NO.4的多核苷酸序列至少有60％以上同源性的多核苷酸序列，且 该多核苷酸具有启动子的功能或活性；优选的，与SEQ ID NO.4的多核苷酸序列至少有 80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有启动子的功能或活性；更优选的，与 SEQ ID NO.4的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有 启动子的功能或活性；最优选的，与SEQ ID NO.4的多核苷酸序列至少有95％以上同源 性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有启动子的功能或活性；或

(d)、在SEQ ID NO.4的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入获得的多 核苷酸变体，且该多核苷酸变体仍具有启动子的功能或活性。

本发明进一步提供了SEQ ID NO.5所示的启动子缺失片段，其多核苷酸序列为 (a)、(b)、(c)或(d)所示:

(a)、SEQ ID NO.5所示的多核苷酸序列；或

(b)、与SEQ ID NO.5的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多 核苷酸仍具有启动子的功能或活性；或

(c)、与SEQ ID NO.5的多核苷酸序列至少有60％以上同源性的多核苷酸序列，且 该多核苷酸具有启动子的功能或活性；优选的，与SEQ ID NO.5的多核苷酸序列至少有 80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有启动子的功能或活性；更优选的，与 SEQ ID NO.5的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有 启动子的功能或活性；最优选的，与SEQ ID NO.5的多核苷酸序列至少有95％以上同源 性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有启动子的功能或活性；或

(d)、在SEQ ID NO.5的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入获得的多 核苷酸变体，且该多核苷酸变体仍具有启动子的功能或活性。

本发明提供了SEQ ID NO.6所示的启动子缺失片段，其多核苷酸序列为(a)、 (b)、(c)或(d)所示:

(a)、SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列；或

(b)、与SEQ ID NO.6的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多 核苷酸仍具有启动子的功能或活性；或

(c)、与SEQ ID NO.6的多核苷酸序列至少有60％以上同源性的多核苷酸序列，且 该多核苷酸具有启动子的功能或活性；优选的，与SEQ ID NO.6的多核苷酸序列至少有 80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有启动子的功能或活性；更优选的，与 SEQ ID NO.6的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有 启动子的功能或活性；最优选的，与SEQ ID NO.6的多核苷酸序列至少有95％以上同源 性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有启动子的功能或活性；或

(d)、在SEQ ID NO.6的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入获得的多 核苷酸变体，且该多核苷酸变体仍具有启动子的功能或活性。

本发明中所述的“替换”是指分别用不同的碱基取代另外的碱基；所述的“缺失”是指 缺少一个或多个碱基；所述的“插入”是指核苷酸的改变，相对天然分子而言，所述改变是 因添加一个或多个碱基所致。

本发明进一步提供了含有所述组织特异性启动子的重组植物表达载体以及含 有该重组植物表达载体的宿主细胞。

将本发明所述组织特异性启动子与待转录的异源性DNA序列进行可操作的连 接，即得到在农作物种子胚中特异性表达异源性DNA序列的重组植物表达载体。

所述的重组植物表达载体中还可含有选择标记基因。

另外，可以将本发明的组织特异性启动子与标记序列可操作的连接以确定标记 序列的活性，所述的标记序列通常包括提供抗生素抗性或除草剂抗性的基因，诸如： 四环素抗性基因、潮霉素抗性基因、草苷膦或草丁膦抗性基因等。

可以采用任何植物转化方法将本发明所构建的重组植物表达载体引入到目标植 物的细胞、组织或器官中，得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到 完整的植株及其无性系或其后代；所述的转化方法包括：农杆菌介导的转化、原生质 体转化、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等；所 述的目标植物包括单子叶植物、双子叶植物；优选的，所述的目标植物为禾本科植物， 例如，可以是玉米、水稻、大麦、小麦、高粱等农作物。

本发明所分离的组织特异性启动子在提高作物种子的品质、改良植物性状、培 育植物新品种等方面有广泛的应用。

将本发明的组织特异性启动子可操作的与待转化的目的异源性DNA序列相连 接，可以指导或调控待转化的目的异源性基因在植物种子的胚进行转录或表达，得到 具有预期性状的转基因植物或植物新品种；例如，将本发明的组织特异性启动子可操 作的与待转化的目的异源性DNA序列相连接(其中，该待转化的异源DNA序列还 与3′非编码区可操作的连接，所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序 列等。)得到可以在植物种子胚中表达该目的异源性DNA序列的重组植物表达载体。 待转化的目的异源性DNA序列不受限制，可以是调节基因、调节基因的反义基因或 者能干扰内源基因表达的小RNA等；所述的待转化的异源DNA序列可以是来自非 靶基因物种的核酸分子或基因，或者是起源于或存在于相同的物种中经过人工改造或 修饰的核酸分子或基因。

通常来说，待转化的异源DNA序列多为改良作物种子品质、提高作物对环境胁 迫抗性、改善作物性状或代谢的相关基因，例如，可以是：改善植物生理、生长和发 育的相关基因，提高产量的相关基因，强化营养、提高对环境胁迫抗性(抗病虫害、 耐盐碱、耐干旱、耐高温、抗冻等)等相关基因，这些基因或者为植物体提供有益的 性状，或者提高或改善作物种子品质、促进种子胚发育或提高作物种子对病虫害抗性。 还可以将促进作物种子中铁、锌、钾等微量元素的积累的有关基因可操作的与本发明 的组织特异性启动子相连接之后构建得到重组植物表达载体，将该重组植物表达载体 转化到受体植物组织或细胞中后，本发明组织特异性启动子能够驱动促进作物种子中 铁、锌、钾等微量元素的积累的有关基因在作物种子胚中进行特异性的高效表达，有 效提高作物种子中铁、锌、钾等微量元素的积累，最终达到提高作物种子品质的目的。

本发明中所述待转化的目的异源性DNA序列还可以包括具有RNA活性的序列 或产生多肽产物的序列等，例如，可以是反义序列、RNAi序列、核酶序列、剪接体、 氨基酸编码序列以及它们的片段。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域 的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文 所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常， 在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更 高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将 会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可 鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)。更 具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点 (T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处 的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3 下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)， 并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而 对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也 可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可 为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％ 甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养， 在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、 120分钟或更长时间。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用 何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知 的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组 中。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖 核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天 然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似 于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核 苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸 酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰 的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特 定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基 和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res. 19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人, (1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“启动子”指存在于目的基因编码序列的上游，提供RNA聚合酶和正确转 录起始所必需的其它因子的识别位点，启动或指导目的基因转录为mRNA。

术语“组织特异性启动子”：调控或驱动目的基因在组织或器官中特异性表达的 启动子。

术语“异源性DNA序列”指该DNA序列对该特定的宿主细胞而言属于外来的 来源，或若来自相同的原始来源但对该原始序列进行了修饰或改造。

术语“内源基因”来自宿主本身的基因，包括DNA或RNA序列。

术语“选择标记基因”：该基因在植物细胞中的表达给予该细胞选择优势，用这 些选择性标记基因所转化的这些细胞所具有的选择优势可以是由于它们与非转化细 胞的生长相比具有在阴性选择剂(如：抗菌素或除草剂)的存在下生长的能力。选择 标记基因还指多种基因的组合，它们在植物细胞中的表达给予该细胞阴性以及阳性的 选择优势。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的 元件可为邻接或非邻接的。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。

术语“植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这 些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌 介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处 理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

附图说明

图1RNA质量检测电泳图；R：根；S1,S2,S3：第4、3、2节段茎；L1，L2，L3： 第2、4、6片叶；SH1，SH2，SH3：第2、4、6片叶的叶鞘；SA：ST:茎；茎尖；T： 雄花；EN：胚乳；E：胚；K：籽粒。

图2原始验证载体pCAMBIA3301的示意图。

图3p85502-EZ的示意图。

图4pUM3G中间载体的示意图。

图5表达载体p85502G3的示意图。

图6胚特异性启动子的瞬时表达结果；胚的发育时间为20天。

图7胚特异启动子启动GUS基因在种子中的表达情况；图中1,2,3,4及5分别代 表不同的玉米种子。

图8p85502G3稳定转化的T1代转基因玉米各组织的GUS染色图，(a)：叶片； (b)：根；(c)：叶鞘。

图9不同长度启动子驱动报告基因表达的瞬时表达结果。

图10p85502-4G3稳定表达载体图。

图11p85502-0G3稳定表达载体图。

图12p85502-2G3稳定表达载体图。

图13p85502-6G3稳定表达载体图。

图14启动子各缺失片段在T1代转基因玉米各组织的GUS染色图；(a)-(e): p85502-0G3稳定转化的T1代转基因玉米各组织的GUS染色图；(f)-(k): p85502-2G3稳定转化的T1代转基因玉米各组织的GUS染色图；(l)-(n):p85502-4G3 稳定转化的T1代转基因拟南芥的各组织的GUS染色图；(o)-(q):p85502-6G3稳定 转化的T1代转基因拟南芥的各组织的GUS染色图；(a)/(b)/(f)/(g)：授粉后30天 的种子纵切，(b)/(g)为负对照；(c)/(i):叶鞘；(d)/(j):叶；(e)/(k):根；(h):图(i)着色 部分横切面放大25倍；(l)/(o):花序；(m)/(p):角果；(n)/(q):叶片。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的 细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 玉米组织特异启动子的克隆及序列分析

1、利用基因芯片数据筛选驱动玉米种子特异表达基因的启动子

基因芯片材料的准备：取玉米B73大喇叭口期的根、叶、茎和茎间，成熟期但未授 粉的幼穗和花丝，授粉后10天、15天、20天、25天的胚和胚乳等共14个样品，每个样 品类型设3个重复，利用基因芯片(Affymetrix公司的Maize GenomeArray)对42个样品 的基因表达谱进行分析。

生物信息学分析：采用生物信息学的方法对42个样品进行数据分析，分别发现了 一个基因Zm85502(该基因的启动子序列为SEQ ID NO.1所示)在胚发育的中后期，特 异性的大量表达。

表1利用基因芯片分析基因Zm85502在不同组织中的表达量

2、定量RT-PCR筛选驱动胚特异表达基因的启动子

自交系B73取材:取大喇叭口期的根、茎、叶、叶鞘、茎尖以及授粉后10天、15天、 20天、25天的胚和胚乳。其中茎采取了形态学上端的三个节段，叶与对应的叶鞘分别取 从形态学下端数起的第2片、4片、6片叶及叶鞘，每个样品设3个重复。

RNA的提取以及cDNA获得：将组织样品在用液氮预冷的研钵磨成粉末后，采取 通用的TRIzol试剂提取方法提取RNA。RNA的质量用1.5％的琼脂糖胶电泳检测，电泳 图见图1。按反转录试剂盒(Promega公司)的要求的RNA用量先除DNA，而后反转录 成cDNA。反转录在PCR仪上42℃温育1小时后，加25mM EDTA到每个反应体系里 终止反应。各个组织的cDNA样本母液均稀释25倍后使用，每个反应使用5微升的稀释 后的cDNA。内参基因使用actin，目标基因与内参基因每个反应均做三个平行点。验证 引物见表2。

表2验证引物

采用实时定量RT-PCR来进一步验证基因芯片分析的结果，并验证基因Zm85502(该 基因的启动子序列为SEQ ID NO.1)在胚中的表达特异性及表达强度。发现定量RT-PCR 的结果和基因芯片分析的实验结果基本一致，该基因主要表达于胚中。

表3利用RT-PCR分析基因Zm85502在不同组织中的表达量

3、启动子的克隆

以SEQ ID NO.1所示的2.0kb序列作为包含“组织特异性高表达”启动子全长的序 列设计克隆引物，所设计的克隆引物如下：

85502f 5-cccgggAGAGCACAGTAACATCAACACT-3；

85502r 5-ctgcagCTCGGCTCCACTACCGCGCGCGTT-3；

以自交系B73基因组DNA为模板，通过高保真DNA聚合酶KOD扩增获得目的 启动子克隆，PCR扩增程序如下：1、94℃4min，2、98℃10sec，3、61℃30sec，4、 68℃2min，2-4部分循环30次，而后68℃10mi。PCR克隆片段加载到克隆载体 pEASY-Blunt(购自北京全式金生物技术有限公司)上，经测序验证序列无误，将新载体命 名为p85502-EZ。

试验例1 候选启动子驱动报告基因在玉米胚中特异性表达试验

植物表达载体构建：为了验证SEQ ID NO.1所示的2.0kb左右的片段是否具有组织 特异性启动子功能，将SEQ ID NO.1所示的片段克隆到植物表达载体pCAMBIA3301 (购自Cambia公司，http://www.cambia.org)(图2)来验证启动子的功能。为了便 于克隆，本试验将pCAMBIA3301载体的多克隆位点进行改造，用EcoR Ⅰ和Bgl  Ⅱ对其进行双酶切，并在此插入一个合成的含有多个酶切位点小片段(序列为如下所 示)，来替代原有的多克隆位点构成中间载体pUM3G：

5-GAATTCGGTACCCGGG(EcoR Ⅰ/Hind III/Kpn Ⅰ/Sma Ⅰ) ctattgcggtgcaggctgccagagcggcggctgtgacgctgtctttgccggcgccatcaccgccaactccactcttctcgcagaa tgatgatagatccaccatggttaacctagacttgtccatcttctggattggccaacttaattaatgtatgaaataaaaggatgcacaca tagtgacatgctaatcactataatgtgggcatcaaagttgtgtgttatgtgtaattactagttatctgaataaaagagaaagagatcatc catatttcttatcctaaatgaatgtcacgtgtctttataattctttgatgaaccagatgcatttcattaaccaaatccatatacatataaata ttaatcatatataattaatatcaattgggttagcaaaacaaatctagTCTAGACTGCAGCCATGGTAGATCT (Xba Ⅰ/Pst Ⅰ/Nco Ⅰ/BglⅡ)-3；

利用Sma I和Pst I对p85502-EZ(图3)进行酶切处理，将启动子片段连入用Sma  I酶切和Pst I酶切处理的pUM3G中间载体(图4)，获得表达载体p85502G3(图5)， 报告基因为GUS。

转化材料的获得：考虑到绝大多数候选基因的转录本均是在玉米授粉后20天左右 达到最高值，因此取玉米授粉后20天的幼穗，去掉苞叶和花丝，用5％的次氯酸钠浸泡 消毒灭菌30分钟，而后用无菌水清洗三次。在超净工作台中，无菌条件下用解剖刀剥取 幼胚，并将幼胚集中浸泡在液体MS培养基中以便除去胚表面上的淀粉和保持胚的活力。 取完足够胚后再用液体MS培养基清洗一次，而后转移到固体高渗培养上高渗处理4小时 备用。每皿放置9-12颗幼胚，三个胚一行放置3-4行。

转化：微弹的制作及基因枪轰击方法参考文献(Rumei Chen et.al.,2008,Transgenic  Res.17(4):633-43)，只是将可裂膜换成1100psi的规格。每皿轰击一次，每个构建2-3个 平行，质粒用量为1微克/枪。轰击完后一小时，再将幼胚转移到恢复培养基上28℃暗培 养24小时。

GUS组织化学染色:在超净工作台中将暗培养的玉米转化材料转移到无菌2毫升离 心管中(1枪/管)，每管加400微升GUS染液，扣上管盖，将离心管水平放置在37℃恒 温箱中保温至少8小时。观察分析幼胚的着色斑点的有无和深浅来验证SEQ ID NO.1所 示的候选启动子的功能。从试验结果可见(图6)，SEQ ID NO.1所示启动子驱动GUS报 告基因在玉米胚中具有高强度的表达。

稳定转化玉米进一步鉴定胚特异性启动子的功能：将稳定转化载体p85502G3(图5) 以农杆菌介导的方法转化了玉米材料Hi Ⅱ，得到了稳定转化的植株，玉米稳定转化流程 如下：

(1)、取授粉后10天的Hi Ⅱ幼穗，首先用无菌水配制5％的次氯酸钠溶液对幼 穗进行浸泡灭菌15min,而后用无菌水浸泡清洗三次。

(2)、在无菌条件下，剥取长度在1.5mm-2.0mm左右的幼胚置于加有乙酰丁 香酮的液体侵染培养基(培养基配方详见论文Molecular Breeding，2001年，第8卷， 页码:323–333)中。

(3)、将事先在具有相应抗性的YEB固体培养基上在28℃培养4天的含有目 的表达载体的重组克隆菌体刮取适量重悬在加有乙酰丁香酮的液体侵染培养基中， 28℃恒温摇床低速恢复培养至OD₂₆₀到0.4-0.6。

(4)、用液体侵染培养基清洗剥好的幼胚两次，吸弃清洗液，加入OD₂₆₀＝0.4-0.6 的菌体颠倒混匀20次，置于黑暗条件下静置5min。

(5)、吸弃菌液，并用液体侵染培养基清洗浸染的幼胚两次，连带第二次清洗 液和幼胚一起倾倒在无筛选压的固体共培养基(培养基配方详见论文Molecular  Breeding，2001年，第8卷，页码:323–333)上，将幼胚均匀分布在培养基上，并将 幼胚的平滑面紧贴培养，弧形面朝上。

(6)、吸弃清洗液，将培养物置于25℃恒温箱黑暗条件下培养3天。将共培养 3天后的幼胚在无菌条件下转移到无筛选压的固体恢复培养基上，28℃黑暗条件下 培养7-10天。

(7)、将恢复培养长势良好且无菌的幼胚衍生物转移到具有basta筛选压的筛 选培养基上筛选28℃黑暗条件下培养1-2个月，每2周继代一次。

(8)、待有生长速度显著高于一般愈伤组织的抗性愈伤出现后，将其繁殖到一 定后，将一定量的抗性愈伤转移到具有多种激素的分化培养基(培养基配方详见论文 Molecular Breeding，2001年，第8卷，页码:323–333)上28℃黑暗条件下培养2 周左右，诱导形成胚状体。

(9)、将胚状体转移到固体生根培养基中，28℃光照条件下培养1周左右。生 根成苗，将小苗转移到盛有固体生根培养基的圆柱状培养管中，28℃光照条件下培养 1周左右。

(10)、再将展开2-3片幼叶的试管苗转移到有营养土的营养钵中在光照培养箱 培养1周左右后即可转移到温室进一步培养并最终移栽到大田中。

图7为SEQ ID NO.1所示启动子在玉米种子驱动GUS基因表达的情况，从图7中 可以发现SEQ ID NO.1所示启动子可以驱动GUS基因在玉米胚中特异性的高表达，。

图8是全长启动子P₈₅₅₀₂(SEQ ID NO.1)在T1代转基因玉米三叶一心时期的 各组织的GUS染色图；图8(a)-(c)右半部分是同时期阴性对照材料，可以明显看出转 基因叶片截面的边缘(左右两侧)有着色，但叶片的自然生长的边缘(上下两侧)没 有着色，而对照叶片任何部位均无着色。说明P₈₅₅₀₂₂(SEQ ID NO.1)全长启动子在 正常生理条件下是在营养组织是不表达的，但在机械损伤诱导条件下，在营养组织表 现出诱导表达的特性。

试验例2 最短启动子的分离及其功能验证试验

将SEQ ID NO.1所示启动子从5’端开始逐渐删除得到多个截短的启动子片段，其 长度分别为1.4kb、0.81kb、0.31kb、0.18kb和0.14kb；然后再分别将各个截短的片 段连入瞬时验证载体pCAMBIA3301(购自Cambia公司，http://www.cambia.org)，来 验证各个截短的片段是否仍具有启动子的功能，以确定具有表达功能的最短启动子序列。

从图9可以看出，将SEQ ID NO.1所示启动子从5’端开始逐渐删除所得到的1.4kb、 0.81kb、0.31kb以及0.18kb的截短序列均能驱动GUS基因在玉米种子胚中进行表达，； 其中0.18kb(最短的启动子片段)为-181—+1之间的片段(SEQ ID NO.2)：

-181CTGACGCGCC ACGTCCCGCG CCACCGCCGA GCCGCTTCT-138

-139GTAC TACACCGCAG CCGGCGCAGC GGAATACACG CCAGAAACTA ATCCAGATAG

-81CTAGCCTTTG ATTTCTCACT TCAATCTGAC GAAGTGCACA CCTAGGCAAC AAACTCGAAC

-21GCGCGCGGTA GTGGAGCCGAG+1

-181—+1为具有功能的最小片段；

-138—+1为没有功能的最大片段；两者相差43bp，这43bp中包含一个TATAbox。

试验结果证实，SEQ ID NO.2所示的截短的启动子片段能够驱动GUS基因在玉米 胚中进行高效表达，证明SEQ ID NO.2所示的截短的片段仍具有启动子功能。

试验例3 截短启动子稳定转化玉米的功能验证试验

将SEQ ID NO.1所示的全长启动子从5’端开始逐渐删除得到四个截短的启动子片 段P_85502-4(SEQ ID NO.3)、P_85502-0(SEQ ID NO.4)、P_85502-2(SEQ ID NO.5)、P_85502-6(SEQ ID NO.6)；参照试验例1中稳定转化载体p85502G3的构建方法，分别构建获 得稳定表达载体p85502-4G3(图10)、p85502-0G3(图11)、p85502-2G3(图12) 和p85502-6G3(图13)；

将稳定表达载体p85502-0G3和稳定表达载体p85502-2G3按照试验例1中农杆 菌介导的方法分别转化了玉米材料Hi Ⅱ，得到了稳定转化的植株，玉米稳定转化流程同 试验例1。

将稳定表达载体p85502-4G3和稳定表达载体p85502-6G3按照农杆菌介导的方法 分别转化了拟南芥，得到了稳定转化的转基因植株，转基因拟南芥获得的方法如下：

1、制备转化用的农杆菌菌液，将用于转化的农杆菌菌种接种到有Kan和Rif 抗性的液体YEP培养基中进行活化，28℃，200rpm摇过夜。而后按1:400的体积比 转接活化的菌种到200mL有Kan和Rif抗性的液体YEP培养基中培养，28℃，200 rpm。当菌液达到OD600为1.5～3.0之内时，4℃，4000g离心10min收集菌体。用 10％蔗糖含0.02％silwet L-77(GE公司生产)稀释至OD600约为0.8--1.0左右备用。

2、浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。

3、用剪刀将植株上已完成授粉的角果剪掉，取一些托盘，将其底部铺上吸水纸 并用水湿透备用。

4、将植株平放在一个大的平皿旁，将花序部分集中置于皿中。

5、倒入备用的农杆菌菌液，带上一次性手套将花序轻轻压入菌液中，计时30秒。

6、转化完毕后，将植株迅速转移到备用的托盘中，并在托盘上部再倒扣一个托 盘将所有的转化植株遮光处理24小时。

7、将遮光处理的植株重新置于正常的光照培养条件下培养。

8、每隔一周可重复上述转化步骤，但不能再将新出现的教过剪掉。每个构建一 般转化2-3次即可。

从图13(a)可以看出启动子缺失片段P_85502-0仍具有在胚组织中启动报告基因表 达的功能，但其活性较全长启动子P₈₅₅₀₂(SEQ ID NO.1)明显下降。而从图13(c)可 以看出启动子缺失片段P_85502-0保持了在叶鞘中诱导表达的特性，图13(d)和(e)说明其 在叶片和根中丧失了全长启动子在的营养组织中诱导表达的特性。综合以上各结果可 以看出，启动子缺失片段P_85502-0是一个启动子活性降低的在正常生理条件下的胚组 织特异性启动子，但在机械损伤诱导下在叶鞘组织表现出诱导表达的特性。

从图13(f)可以看出启动子缺失片段P_85502-2丧失了在胚组织中启动报告基因表达 的功能。但从(h)-(k)可以看出P_85502-2保持了在营养组织中诱导表达的特性。综合以 上各结果可以看出，启动子缺失片段P_85502-2是一个在正常生理条件下在各组织中均 不具有启动子活性，但在机械损伤诱导下在营养组织表现出诱导表达的特性。

从转基因拟南芥各组织染色结果可以看出，更短的P₈₅₅₀₂缺失片段仍具有活性 ((l)/(o)/(m)/(p))，只是P_85502-4与P_85502-6比较而言仍保持有诱导表达的特性(n)/(q)。

从以上四个缺失片段在转基因玉米/拟南芥中驱动报告基因GUS表达的结果可以 看出，这四个缺失片段仍具有启动子活性，但其启动强度和组织特异性均发生一些改 变。