一种短短芽孢杆菌BBC-3及其应用与菌剂制备

摘要

本发明涉及一种用于防治西兰花真菌病害的拮抗菌及其微生物制剂制备与应用，属于农作物病害生物防治领域。本发明提供了一株保藏号为CGMCC No.9622的短短芽孢杆菌BBC-3(Brevibacillus brevis)，以及含有此短短芽孢杆菌的微生物制剂的制备，还提供了所述短短芽孢杆菌BBC-3或微生物制剂在防治西兰花真菌病害中的应用。本发明所公开的保藏号为CGMCC No.9622的短短芽孢杆菌BBC-3经平板对峙试验初筛及液体发酵液复筛所得，能有效防治西兰花灰霉病、霜霉病、菌核病、黑腐病及黑斑病等多种真菌病害，防治效率达70%以上，且环境安全性好，具有良好的开发应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于防治西兰花真菌病害的短短芽孢杆菌BBC-3(Brevibacillus brevis)及其菌剂制备与应用，属于农作物病害生物防治领域。

背景技术

西兰花为十字花科，一、二年生草本植物，属甘蓝类蔬菜。其富含维生素A、维生素C以及磷、铁、钙等无机质，且蛋白质的含量亦很高，是我国重要的出口创汇蔬菜。真菌病害是十字花科蔬菜上的一类重要病害，发生普遍且危害严重。

当前对西兰花真菌病害的防治主要通过种植抗(耐)病品种和化学防治来控制。随着有害病原菌抗性问题日益严重，且化学农药残留易造成残毒、环境污染等严重危害，对人体健康、生态环境造成了很大的威胁，不利于西兰花栽培生产的可持续发展。

利用拮抗微生物及其代谢产物来抑制或杀死病原物，是植物病害防治的有效措施之一。生物防治不仅可以避免化学农药带来的危害，而且安全有效、作用持久。在众多生防菌之中，芽孢杆菌生长旺盛，繁殖迅速，能产生抗逆性内生孢子，有着其他微生物无法媲比的优势。

目前在西兰花真菌病害生物防治方面的研究还较少，尤其是这方面的专利文献暂时未见报道。本发明的目的在于提供一种能够高效拮抗西兰花病原真菌的芽孢菌，并形成微生物制剂，为开发新型西兰花真菌病害生防产品奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够高效拮抗西兰花多种病原真菌的短短芽孢杆菌及其微生物制剂，并提供该微生物制剂的制备方法。该制剂施用后可有效防治西兰花真菌病害，减少化学农药的使用，降低环境污染，提高产品品质。

本发明所采用的技术方案如下：

本发明的短短芽孢杆菌BBC-3于2014年8月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No.9622。

本发明的短短芽孢杆菌BBC-3在植物真菌病害防治中的应用。

进一步的，本发明所述的真菌病害包括灰霉病菌、霜霉病菌、黑腐病菌、菌核病菌、黑斑病菌、疫霉菌、炭疽病菌、枯萎病菌、灰霉病菌或立枯丝核菌。

进一步的，本发明所述的植物为西兰花。

进一步的，本发明所述的短短芽孢杆菌BBC-3的菌剂的制备方法中所述短短芽孢杆菌BBC-3用液体PB培养基，28℃振荡培养得到发酵液，所述短短芽孢杆菌BBC-3菌含量≥2.0×10⁹ cfu/mL，采用喷雾干燥法制得固体粉剂。

进一步的，本发明所述喷雾干燥的基质为微粉碳酸钙、β-环糊精。

进一步的，本发明所述发酵液为10重量份，所述微粉碳酸钙为0.2~0.8重量份，所述的β-环糊精为0.7~1.3重量份。

进一步的，本发明所述固体粉剂含所述短短芽孢杆菌BBC-3总数≥2.5×10¹⁰ cfu/g。

本发明的有益效果是提供了一种能有效防治西兰花真菌病害的拮抗菌株及其菌剂与应用，该产品具有如下优点：1）本发明公布的短短芽孢杆菌具有广谱抗菌性，不仅对西兰花的多种病原菌有较强的拮抗作用，而且对其他病原菌如辣椒疫霉菌、黄瓜炭疽病菌、棉花枯萎病菌、黄瓜灰霉病菌、葡萄灰霉病菌、立枯丝核菌、西瓜霜霉病菌等也有较好的拮抗作用。2）具有良好的促生作用：本发明制备的微生物菌剂施用后，不仅能够有效抑制西兰花真菌病害的发生，而且还可以促进西兰花的营养生长，增加产量，减少产品农药残留。3）相对于化学农药，本发明制备的微生物菌剂更安全、环保，其制备和使用过程无污染、无公害、对环境友好。总之，本发明公布的短短芽孢杆菌菌剂在西兰花栽培生产中使用具有无毒、无污染、无残留的优点，是解决西兰花农药残留和病菌抗药性问题的有效途径，而且该菌剂在其他作物上也有一定的应用潜力，对促进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。

生物样品保藏信息

短短芽孢杆菌BBC-3，分类命名为Brevibacillus brevis，该菌株已于2014年8月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为：CGMCC No. 9622；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

附图说明

图1为本发明短短芽孢杆菌BBC-3的系统发育树。

具体实施方式

本发明通过大量筛选工作，得到了一株对西兰花真菌病害病菌有较强拮抗作用的菌株BBC-3，通过菌体形态、生理生化特征以及16S rDNA分子生物学鉴定，确定该菌株为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。该菌株已于2014年9月5日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为：CGMCC No. 9622；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；

本发明所述的短短芽孢杆菌菌株BBC-3在PB培养基平板形成的单菌落圆形，不透明，表面光滑湿润，边缘整齐，中间隆起，不产生可溶性色素。菌体形态为杆菌，产芽孢，芽孢中生，呈椭圆形，革兰氏染色阳性，菌体大小为(0.6-0.8) μm×(3.5-4.0) μm。

本发明所述的短短芽孢杆菌菌株BBC-3对西兰花灰霉病、霜霉病、黑腐病、菌核病、黑斑病等病原真菌具有较强的拮抗作用。

本发明所述的短短芽孢杆菌菌株BBC-3对辣椒疫霉菌、黄瓜炭疽病菌、棉花枯萎病菌、黄瓜灰霉病菌、葡萄灰霉病菌、立枯丝核菌、西瓜霜霉病菌等植物性病原真菌也具有拮抗作用。

本发明的微生物制剂含有保藏号为CGMCC No. 9622的短短芽孢杆菌菌株BBC-3。其液体菌剂细菌总数≥2.0×10⁹ cfu/mL，固体粉剂含细菌总数≥2.5×10¹⁰ cfu/g。

本发明所述的微生物制剂的制备方法包括以下步骤：

    步骤一：将保存的短短芽孢杆菌BBC-3划线转接到PB培养基平板中，置于28 ℃恒温培养2 d。将获得的短短芽孢杆菌BBC-3菌苔接种于PB种子培养基中，28 ℃摇床振荡培养24 h，制得种子液。

    步骤二：将步骤一的种子液按体积比10%的接种量接种到大量发酵培养基中，于28 ℃下培养36 h，得到发酵液。

步骤三：将步骤二的发酵液经镜检计数后，菌液浓度≥2.0×10⁹ cfu/mL，无菌分装，得到的短短芽孢杆菌微生物液体制剂。

步骤四：将步骤二所得到的液体发酵液与多种基质按一定比例混合均匀，进一步通过喷雾干燥制得固体粉剂。

   本发明的微生物制剂的制备方法步骤二中所述的大量发酵培养基包含牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，pH 7.0～7.2；本发明所述的微生物制剂的制备方法步骤四中所述的基质为微粉碳酸钙、β-环糊精；其中发酵液：微粉碳酸钙：β-环糊精=10:(0.2-0.8):(0.7-1.3)。

本发明所述的微生物制剂应用于西兰花真菌病害的防治，能够有效抑制西兰花灰霉病、霜霉病、黑腐病、黑斑病、菌核病等病原真菌的生长，其防治效率达70% 以上。

以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。

实施例1  短短芽孢杆菌BBC-3的分离、筛选以及保藏

（1）取土样：选择长势良好的西兰花田，在健康西兰花植株的根际，铲去表土层2-3 cm，取与西兰花根际临近的土壤10 g；装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。

（2）菌株分离和纯化：在PB培养基上用平板稀释法对土壤样品进行分离。具体操作如下：准确称取10 g土壤样品，加入到盛有90 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，200 rpm振荡30 min，使土样分布均匀成为土壤悬液，浓度为10^-1；依此类推逐步10倍梯度稀释至10^-2、10^-3、10^-4…10^-7；选10^-5、10^-6、10^-7三个浓度在80℃恒温水浴20 min，然后各取100 μL稀释液涂布平板，放置于30 ℃恒温培养箱倒置培养48 h；挑取不同形态的单菌落，用芽孢染色进行鉴定，各菌株用划线法纯化2-3次后转接至PB培养基试管斜面，30 ℃培养48 h，4 ℃冰箱保存备用。

（3） 活性菌株筛选：

初筛：以西兰花病原真菌为指示菌，采用传统五点对峙法测定不同菌株对西兰花病原真菌生长的抑制作用。具体操作方法如下：在PDA平板中心接种直径5 mm的病原真菌菌饼，四周等距离接种待筛选菌株，25 ℃恒温培养，每个处理3个重复。以只接种西兰花病原真菌菌块为对照。根据各筛选菌菌落边缘与病原菌菌落边缘之间的抑菌带宽度确定拮抗程度，保留效果优良的菌株。

复筛：将拮抗菌接种于PB液体培养基（50 mL/250 mL），在200 rpm，30 ℃条件下培养48 h；将发酵液离心（8000 rpm，20 min），弃沉淀，收集上清；将上清液用0.22 μm滤膜过滤除去菌体，制成无菌发酵滤液。在制备好的病原真菌平板上用灭菌打孔器打孔，平板打孔后向孔内注入100 μL拮抗菌无菌滤液，病原真菌筛选板25 ℃培养3～5 d，采用十字交叉法测量抑菌圈直径并计算平均抑制率。筛选出可产代谢活性产物对西兰花病原真菌拮抗作用最强的菌株，命名为BBC-3，对将该菌株进行了-80℃冷冻保藏。

实施例2  短短芽孢杆菌BBC-3抑菌谱的测定

选取具有代表性的西兰花灰霉病、黑斑病、菌核病、黑腐病、辣椒疫霉菌、黄瓜炭疽病菌、棉花枯萎病菌、灰霉病菌、葡萄灰霉病菌、立枯丝核菌、小麦赤霉病菌、玉米小斑病菌、番茄早疫病菌、叶霉病菌、霜霉病菌等15种植物病原真菌为靶标，采用平板扩散法测定菌株BBC-3的抑菌谱。菌株BBC-3对16种植物病原真菌均有较强的拮抗作用，其中对西兰花灰霉病菌的抑制作用最强，抑菌圈直径可达30.23 mm，其次为黑腐病菌，抑菌圈达28.79 mm。

表1 短短芽孢杆菌BBC-3对不同植物病原真菌的抑制作用

实施例3  短短芽孢杆菌BBC-3的鉴定

根据《常见细菌系统鉴定手册》中记载的实验内容及试验方法，对筛选得到菌株BBC-3进行形态学及生理生化鉴定。该菌株在PB培养基平板形成的单菌落圆形，不透明，表面光滑湿润，边缘整齐，中间隆起，不产生可溶性色素。挑取培养24 h菌落进行革兰氏染色后，于光学显微镜100倍油镜下观察，菌株为杆菌，菌体大小为(0.6-0.8) μm×(3.5-4.0)μm，产芽孢，革兰氏染色阳性，芽孢中生，呈椭圆形。以下是其生理生化鉴定指标：

表2 短短芽孢杆菌BBC-3生理生化鉴定指标

注：＋表示阳性反应(存在或有反应)；－表示阴性反应(不存在或无反应)；V表示反应可变（菌株间不稳定的反应）。

将上述各指标结合16S rDNA序列进行比对后鉴定该菌株为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)，其16S rDNA序列见序列表seq1。送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No.9622。

实施例4  微生物制剂的制备

将保存的短短芽孢杆菌BBC-3划线转接到PB培养基平板中，至于28 ℃恒温培养2 d；将获得的短短芽孢杆菌BBC-3菌苔接种于PB种子培养基中，28 ℃摇床振荡培养24 h，制得种子液；将种子液按体积比10%的接种量接种到大量发酵培养基中，于28 ℃下培养36 h，得到发酵液菌数≥2.0×10⁹ cfu/mL；将液体发酵液与粉质碳酸钙和β-环糊精按10:(0.2-0.8):(0.7-1.3)的比例混合均匀，进一步通过喷雾干燥制得固体粉剂，含细菌总数≥2.68×10¹⁰ cfu/g。

表3 短短芽孢杆菌固体菌剂制备

实施例8～12  短短芽孢杆菌BBC-3微生物制剂的田间应用试验

本发明微生物制剂的田间应用试验在河北省张家口市沽源县西兰花田中进行。将上述微生物制剂稀释成250倍、500倍、750倍、1000倍、1500倍、2000倍进行西兰花叶面喷施，以喷施清水的为空白对照，每个处理设3次重复。在西兰花花球发育期开始喷施，连续喷施3次，间隔15天，最后一次喷药之后10天内统计西兰花真菌病害的发病情况。

表4 微生物制剂不同喷施浓度对西兰花真菌病害的防治效果

由上述结果可以看出，综合考虑成本及效果，750-1000倍为该微生物制剂在西兰花叶面喷施的最佳稀释倍数。稀释750倍时对霜霉病的防治效果可达80.1%，有效降低了发病率，促进营养生长，增产8.9%；在稀释1000倍时对灰霉病的防治效果达78.8%，增产7.0%；另外该制剂在500-1000倍对西兰花黑斑病、黑腐病、菌核病的防病效果均在70%以上。

综上，本发明所筛选出的保藏号为CGMCC No.9622的短短芽孢杆菌BBC-3对西兰花多种病原真菌具有良好的拮抗作用，其微生物制剂能够有效防治西兰花多种真菌病害的发生，从而达到增加产量，减少产品农药残留的目的。