一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法

摘要

本发明公开了一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法。该方法包括如下步骤：1）根据基因组DNA上的已知序列设计三条方向一致用于扩增侧翼序列的特异性引物，按距离侧翼序列由远及近的顺序将其依次记为GSP1、GSP2和GSP3；2）以基因组DNA为模板，以引物SAP（序列1-15中任一）和所述GSP1进行第一轮PCR扩增，得到PCR产物1；3）以所述PCR产物1为模板，以引物SEP（序列16和17）和所述GSP2进行第二轮PCR扩增，得到PCR产物2；4）以所述PCR产物2为模板，以引物SNP（序列18）和所述GSP3进行第三轮PCR扩增，得到PCR产物3，从而获得所述侧翼序列。本发明所提供方法具有如下优点：操作简易、高特异性扩增、高成功率、容易得到大的片段、耗时短等。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法，特别涉及一种通过 SNM-PCR从基因组DNA中获得侧翼序列的方法。

背景技术

基因组时代的来临对生物学各领域产生了巨大的影响。对于已完成基因组测序的 少数物种（如人、拟南芥、水稻等），可直接从数据库中找到已知序列的侧翼序列。然 而，自然界中大多数生物基因组DNA序列仍未知，想要知道一个已知区域两侧的 DNA序列，染色体步移技术是一种非常有效的方法。因此，染色体步移技术（Genome  Walking）是一种重要的现代分子生物学研究技术，可以有效获取与已知序列相邻的未 知序列。

染色体步移技术主要有以下几方面的应用：1.根据基因的已知片段、分子标记等， 获取完整的基因序列，研究其表达调控。如分离克隆启动子和基因结构并对其进行功 能研究；2.鉴定T-DNA、转座子及外源基因在基因组中的插入位点；3.用于染色体 测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列。

目前，众多基于PCR技术的染色体步移方法，包括反向PCR法,随机PCR法和 接头连接法等，都有操作复杂、非特异性扩增、连接效率低等弊端。

迄今为止，利用随机引物最成功的是热不对称交错（thermal asymmetric interlaced  PCR）TAIL-PCR。这种方法成本相对较低，可直接用PCR进行克隆，不需要DNA限 制性内切酶消化或接头连接反应。随后，TAIL-PCR被广泛应用，尤其是T-DNA插入 位点侧翼序列的克隆，启动子序列的快速分离和全长功能基因的克隆。然而，TAIL-PCR 是一个十分耗时的程序，通常要经过三轮PCR扩增。由于较短的随机兼并引物和低的 退火温度，往往会出现非特异性扩增，也可能会出现目的序列的无效扩增。另外，传 统的TAIL-PCR往往会产生小片段扩增。随后,TAIL-PCR经改进为（hi）TAIL-PCR和 FPNI-PCR。但改进的高效率TAIL-PCR仍然费时费力，并且引物设计与合成的费用昂 贵。同时hi TAIL-PCR和FPNI-PCR技术也遇到了巨大的挑战，如:DNA聚合酶的活 性问题和非特异性扩增等，所以往往伴随着低效率的扩增结果。综上所述，这些改进 的方法仍然费时费力，不能发挥传统TAIL-PCR广泛的应用潜力。因此，进一步开发 快速、高效的染色体步移或侧翼序列的克隆的新方法是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法。

本发明所提供的从基因组DNA中获得侧翼序列的方法，命名为Suppression and  nested mediated PCR（SNM-PCR），具体可包括如下步骤：

（1）选择基因组DNA上位于待扩增的侧翼序列旁侧的一个已知序列区，根据所 述已知序列区的核苷酸序列设计三条方向一致用于扩增所述侧翼序列的特异性引物， 将三条所述特异性引物按照距离所述侧翼序列由远及近的顺序，依次记为GSP1、GSP2 和GSP3；

（2）以所述基因组DNA为模板，以随机兼并引物SAP和所述GSP1进行第一轮 PCR扩增，得到PCR产物1；

所述随机兼并引物SAP为如下15种引物中的任一种：核苷酸序列如序列表中序 列1所示的引物SAP1、核苷酸序列如序列表中序列2所示的引物SAP2、核苷酸序列 如序列表中序列3所示的引物SAP3、核苷酸序列如序列表中序列4所示的引物SAP4、 核苷酸序列如序列表中序列5所示的引物SAP5、核苷酸序列如序列表中序列6所示 的引物SAP6、核苷酸序列如序列表中序列7所示的引物SAP7、核苷酸序列如序列表 中序列8所示的引物SAP8、核苷酸序列如序列表中序列9所示的引物SAP9、核苷酸 序列如序列表中序列10所示的引物SAP10、核苷酸序列如序列表中序列11所示的引 物SAP11、核苷酸序列如序列表中序列12所示的引物SAP12、核苷酸序列如序列表 中序列13所示的引物SAP13、核苷酸序列如序列表中序列14所示的引物SAP14、核 苷酸序列如序列表中序列15所示的引物SAP15；

（3）以所述PCR产物1为模板，以叠套引物SEP和所述GSP2进行第二轮PCR 扩增，得到PCR产物2；

所述叠套引物SEP由引物A和引物B组成，所述引物A的核苷酸序列为序列表 中序列16，所述引物B的核苷酸序列为序列表中序列17；

（4）以所述PCR产物2为模板，以引物SNP和所述GSP3进行第三轮PCR扩增， 得到PCR产物3；从所述PCR产物3中获得所述侧翼序列；

所述引物SNP的核苷酸序列为序列表中序列18。

在上述方法中，所述叠套引物SEP中，所述引物A和所述引物B的摩尔比可为 （1-2.5）：10。

在上述方法中，进行三轮PCR扩增时各引物配比如下：

（a1）进行所述第一轮PCR扩增时，所述随机兼并引物SAP和所述GSP1的摩 尔比为（5～10）：1，如5：1；

（a2）进行所述第二轮PCR扩增时，所述叠套引物SEP中的所述引物A、所述 引物B，以及所述GSP2三者的摩尔比为（1-2.5）：10：10；

（a3）进行所述第三轮PCR扩增时，所述引物SNP和所述GSP3的摩尔比为1： 1。

在上述方法中，进行三轮PCR扩增的反应条件如下：

（b1）进行所述第一轮PCR扩增的反应条件为：94℃120s，1个循环；98℃10 s，60℃30s，68℃2min，2个循环；98℃10s，25℃2min，0.2℃/s（在25℃-68℃ 升温过程中，控制每秒上升0.2℃），68℃2min，1个循环；98℃10s，60℃30s，68 ℃2min，98℃10s，60℃30s，68℃2min，98℃10s，44℃30s，68℃2min，3-5 个循环；68℃5min，1个循环；或/和

（b2）进行所述第二轮PCR扩增的反应条件为：94℃120s；98℃10s，60℃30s， 68℃2min，30个循环；68℃5min；或/和

（b3）进行所述第三轮PCR扩增的反应条件为：94℃120s；94℃10s，60℃30 s，68℃2min，30个循环；68℃5min。

在上述方法中，进行三轮PCR扩增时的反应体系如下：

（c1）进行所述第一轮PCR扩增的反应体系为：2×PCR Buffer for KOD FX 10.0μL；2mM dNTPs4.0μL；浓度为10μmol的所述GSP10.6μL；浓度为10μmol的 所述随机兼并引物SAP3.0μL；所述基因组DNA（模板）200-500ng；KOD FX（1.0U/μl） 0.4μL；ddH₂O补足至20μL。

（c2）进行所述第二轮PCR扩增的反应体系为：2×PCR Buffer for KOD FX 25.0μL；2mM dNTPs10.0μL；浓度为10μmol的所述GSP21.5μL；混合浓度为 2.2-2.5μmol的所述叠套引物SEP（其中，引物A的浓度为0.2-0.5μmol，引物B的浓 度为2μmol）7.5μL；所述PCR产物1，即第一轮PCR反应液（模板）1.0μL；KOD FX （1.0U/μL）1.0μL；ddH₂O补足至50μL；

（c3）进行所述第三轮PCR扩增的反应体系为：2×PCR Buffer for KOD FX 25.0μL；2mM dNTPs10.0μL；浓度为10μmol的所述GSP31.5μL；浓度为10μmol 的所述引物SNP1.5μL；所述PCR产物2，即第二轮PCR反应液（模板）1.0μL； KOD FX（1.0U/μL）1.0μL；ddH₂O补足至50μL。

以上进行三轮PCR扩增时的反应体系中，所述2×PCR Buffer for KOD FX、所述 KOD FX均为东洋纺生物科技有限公司（Code No.KFX-101）。

在上述方法中，所述GSP1、所述GSP2和所述GSP3的长度为22-26nt，GC含量 45-55%，Tm值60-70℃。

在上述方法中，所述GSP1、所述GSP2和所述GSP3在所述基因组DNA上，相 邻两个引物之间的间隔距离为30-100bp。

在上述方法中，所述GSP3在所述基因组DNA上，与所述待扩增的侧翼序列之 间的间隔为40-100bp以上。

在上述方法的步骤（4）中，从所述PCR产物3中获得所述侧翼序列，具体为： 以所述GSP3对所述PCR产物3进行测序，从而获得所述侧翼序列的核苷酸序列。

在本发明中，所述基因组DNA具体为日本落叶松基因组DNA。

在本发明的一个实施例中，所述已知序列区具体为LaTCTP的5′端基因组序列（序 列19）。此时，所述GSP1、所述GSP2和所述GSP3的核苷酸序列分别为序列20、序 列21和序列22。最终通过本发明方法所获得的所述侧翼序列的核苷酸序列为序列表 中的序列23或序列24。

在本发明的另一个实施例中，所述已知序列区具体为LaNFYA1基因的5′端基因组 序列（序列26）。此时，所述GSP1、所述GSP2和所述GSP3的核苷酸序列分别为序 列27、序列28和序列29。最终通过本发明方法所获得的所述侧翼序列的核苷酸序列 为序列表中的序列30。

本发明的再一个目的是通过一种用于从基因组DNA中获得侧翼序列的试剂盒。

本发明所提供的用于从基因组DNA中获得侧翼序列的试剂盒，具体包含15条随 机兼并引物中的全部或部分、叠套引物SEP和引物SNP；

所述15条随机兼并引物如下：核苷酸序列如序列表中序列1所示的引物SAP1、 核苷酸序列如序列表中序列2所示的引物SAP2、核苷酸序列如序列表中序列3所示 的引物SAP3、核苷酸序列如序列表中序列4所示的引物SAP4、核苷酸序列如序列表 中序列5所示的引物SAP5、核苷酸序列如序列表中序列6所示的引物SAP6、核苷酸 序列如序列表中序列7所示的引物SAP7、核苷酸序列如序列表中序列8所示的引物 SAP8、核苷酸序列如序列表中序列9所示的引物SAP9、核苷酸序列如序列表中序列 10所示的引物SAP10、核苷酸序列如序列表中序列11所示的引物SAP11、核苷酸序 列如序列表中序列12所示的引物SAP12、核苷酸序列如序列表中序列13所示的引物 SAP13、核苷酸序列如序列表中序列14所示的引物SAP14、核苷酸序列如序列表中序 列15所示的引物SAP15；

所述叠套引物SEP由引物A和引物B组成，所述引物A的核苷酸序列为序列表 中序列16，所述引物B的核苷酸序列为序列表中序列17；

所述引物SNP的核苷酸序列为序列表中序列18。

本发明所提供的从基因组DNA中获得侧翼序列的SNM-PCR法，具有如下优点：

1、操作简易：经过巧妙的引物设计，免去了酶切、接头连接等繁琐的实验步骤； 模板无需经过任何特殊处理，可直接用于SNM-PCR扩增，减少受污染的几率；第一 轮和第二轮PCR产物无需稀释（大大简化操作步骤），可直接进行下一步操作。

2、高特异性扩增；利用阻抑PCR原理，在第二轮PCR过程中引入并延伸接头序 列，使非特异性扩增产物形成稳定的茎环结构而起抑制效应，极大提高了扩增结果的 特异性。

3、高成功率：所具体实施方式部分的实验中，成功的克隆了2个基因的启动子 序列，说明对于每一个基因都能够被有效的步查。一般从中选取四条SAP引物进行 SNM-PCR扩增，就可以得到阳性结果。

4、容易得到大的片段：从的实验结果中，可以看出：每次实验均可获得1000bp 以上的步移片段。

5、耗时短：传统TAIL-PCR需要12-16h才能完成PCR扩增过程，而经过我们改 进后的SNM-PCR仅需要8个小时就可以完成从PCR扩增到转化克隆的全过程，大大 节省了科研工作者的时间。

附图说明

图1为SNM-PCR技术原理及流程图。

图2为SNM-PCR特异性引物设计示意图。

图3为利用SNM-PCR克隆LaTCTP基因5′侧翼序列的电泳图和利用传统 TAIL-PCR克隆LaTCTP基因5′侧翼序列的电泳图。其中，A-1至A-3为SNM-PCR方 法，B为TAIL-PCR方法。A-1中，泳道1-3依次为SAP1组第一至三轮PCR产物； 泳道4-6依次为SAP2组第一至三轮PCR产物；泳道7-9依次为SAP3组第一至三轮 PCR产物。A-2中，泳道1-3依次为SAP4组第一至三轮PCR产物；泳道4-6依次为 SAP5组第一至三轮PCR产物；泳道7-9依次为SAP6组第一至三轮PCR产物；泳道 10-11依次为SAP7组第一至三轮PCR产物；泳道12-15依次为SAP8组第一至三轮 PCR产物；泳道16-18依次为SAP9组第一至三轮PCR产物。A-3中，泳道1-3依次 为SAP10组第一至三轮PCR产物；泳道4-6依次为SAP11组第一至三轮PCR产物； 泳道7-9依次为SAP12组第一至三轮PCR产物；泳道10-11依次为SAP13组第一至 三轮PCR产物；泳道12-15依次为SAP14组第一至三轮PCR产物；泳道16-18依次 为SAP15组第一至三轮PCR产物。B中，泳道1-3依次为第一至三轮PCR产物（箭 头所示位置为目的条带）。各图中的泳道M均为DNA分子量标准，各条带由小到大依 次为250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2250bp，3000bp，4500bp。

图4为利用SNM-PCR克隆LaNFYA1基因5′侧翼序列的电泳图。其中，泳道1-3 依次为SAP1组第一至三轮PCR产物；泳道4-6依次为SAP2组第一至三轮PCR产物； 泳道M为DNA分子量标准，各条带由小到大依次为250bp，500bp，750bp，1000bp， 1500bp，2250bp，3000bp，4500bp。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

2×PCR Buffer for KOD FX、KOD FX：东洋纺生物科技有限公司（Code  No.KFX-101）。

实施例1、用于从基因组DNA中获得侧翼序列的试剂盒的制备及其使用方法

一、用于从基因组DNA中获得侧翼序列的试剂盒的制备

本发明所提供的用于从基因组DNA中获得侧翼序列的试剂盒，包含15条随机兼 并引物SAP、叠套引物SEP和引物SNP。

根据TAIL-PCR、阻抑PCR和巢式PCR原理，设计了一批带有接头序列的随机兼 并引物（SAP1-15）用于第一轮PCR反应（如表1）；根据阻抑PCR原理，采用混合 的叠套引物（SEP），以延长接头序列，最大程度抑制非特异性扩增；根据巢式扩增的 原理，设计了引物SNP用于第三轮PCR反应。具体原理及流程见图1。

表1SNM-PCR中用到的随机兼并引物SAP、叠套引物SEP和引物SNP

注：W表示A或T；S表示G或C；N表示A、T、C或G。

二、用于从基因组DNA中获得侧翼序列的试剂盒的使用

利用步骤一制备的试剂盒从基因组DNA中获得侧翼序列的方法，命名为 Suppression and nested mediated PCR（SNM-PCR）。

1、特异性引物设计

选择基因组DNA上位于待扩增的侧翼序列旁侧的一个已知序列区，根据所述已 知序列区的核苷酸序列设计三条方向一致用于扩增所述侧翼序列的特异性引物，将三 条所述特异性引物按照距离所述侧翼序列由远及近的顺序，依次记为GSP1、GSP2和 GSP3（图2）。每两个相邻特异性引物之间的距离没有严格的规定，一般以30～100bp 为宜。特异性引物设计原则：GSP引物的长度为22～26nt，GC含量45～55％，Tm值 60～70℃；另外，引物GSP3要距离带扩增侧翼序列的5′端或3′端（起始端）有一定的 距离（一般要求40-100bp以上），这段序列用于与扩增序列的比对，当这段序列可以 和扩增的序列拼接上，即有相应的重叠区域时，就可以认为获得了有效的步移序列。 现有的步移方法也是按照这个标准。

2、基因组DNA的提取

基因组DNA的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。建议采用CTAB 法提取基因组DNA，亦可是经过简单处理的基因组DNA作为模板。由于本方法灵敏 度和特异性极高，对基因组DNA的质量要求不是很高。

其中，CTAB抽提法可按照如下步骤进行：

1）提取基因组DNA前，CTAB抽提液（3％(W/V)CTAB，0.1M Tris-HCl，20mM EDTA，1.3M NaCl）加入2%的巯基乙醇（1mL CTAB+2μLβ-巯基乙醇)，混匀后65 ℃水浴预热10min；无水乙醇4℃预冷备用；

2）取组织材料，用液氮研磨样品，装入1.5mL离心管（样品量至管1/3即可）；

3）加入600μL预热的CTAB抽提液，65℃水浴15～20min，每隔10min轻 摇一次；

4）加入600μL氯仿/异戊醇（体积比24:1），轻摇10min；

5）室温12,000rpm，离心10min；

7）取上清液转移至新的离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇和1/10体积的 NaAc（3M）；

8）轻轻混匀，-20℃放置20min；

9）4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清；

10）加入70%乙醇洗两次；

11）干燥5～10min，加入适量灭菌水溶解DNA；

12）待DNA溶解后，测定浓度。

3、第一轮PCR扩增

经OD测定准确定量后，取约400ng基因组DNA作为模板，以随机兼并引物 SAP中的任意一种作为上游引物，以GSP1为下游引物，进行第一轮PCR反应。

按下列组分配置第一轮PCR反应体系：

试剂 使用量（μL） 2×PCR Buffer for KOD FX 10.0 2mM dNTPs 4.0 10μmol GSP1 0.6 10μmol SAP中的任意一种 3.0 基因组DNA（模板） 约200-500ng KOD FX（1.0U/μl） 0.4 ddH₂O 补足至20μL

反应条件见表2。

4、第二轮PCR扩增

取第一轮PCR反应液1μL（不需要稀释）作为第二轮PCR反应的模板，以叠套 引物SEP为上游引物，以GSP2为下游引物，进行第二轮PCR反应。

按下列组份配制第二轮PCR反应体系：

试剂 使用量（μL） 2×PCR Buffer for KOD FX 25.0 2mM dNTPs 10.0 10μmol GSP2 1.5

2.2-2.5μmol SEP 7.5 第一轮PCR反应液（模板） 1.0 KOD FX（1.0U/μL） 1.0 ddH₂O 补足至50μl

注：“2.2-2.5μmol SEP”中，引物A的浓度为0.2-0.5μmol，引物B的浓度为2μmol。

反应条件见表2。

5、第三轮PCR扩增

取第二轮PCR反应液1μL（不需要稀释）作为第三轮PCR反应的模板，以引物 SNP为上游引物，以GSP3为下游引物，进行第三轮PCR反应。

按下列组份配制第三轮PCR反应体系：

试剂 使用量（μL） 2×PCR Buffer for KOD FX 25.0 2mM dNTPs 10.0 10μmol GSP3 1.5 10μmol SNP 1.5 第二轮PCR反应液（模板） 1.0 KOD FX（1.0U/μL） 1.0 ddH₂O 补足至50μL

反应条件见表2。

表2SNM-PCR反应条件和参数设置

6、切胶回收，连接测序

取第一轮PCR扩增、第二轮PCR扩增和第三轮PCR扩增所得的反应液各5μL， 使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。切胶回收清晰的电泳条带，直接以GSP3为引物， 对PCR产物进行DNA测序。

理论上，第一轮PCR扩增所得的反应液在进行琼脂糖凝胶电泳时，基本上看不到 条带（扩增产物量较低）；第二轮PCR扩增所得反应液和第三轮PCR扩增所得反应液 在进行琼脂糖凝胶电泳时，均会出现明显的扩增条带，且第三轮的扩增条带稍小于第 二轮的扩增条带。此时，只需将第三轮PCR扩增所得产物回收，直接以GSP3为引物 对PCR产物进行DNA测序或进行T载体克隆后测序，得到待扩增的侧翼序列。另 外，在有些情况下，第二轮PCR扩增所得反应液也可能会没有特异性条带的出现（扩 增产物量较低的情况下），第三轮PCR扩增所得反应液中的条带也可进行下一步的试 验操作。

实施例2、利用实施例1制备的试剂盒从落叶松基因组DNA中获得LaTCTP基 因的5′端序列

1、LaTCTP基因特异性引物的设计

依据实施例1中的特异性引物设计的原则，利用引物设计软件primer5，根据落叶 松翻译调控肿瘤蛋白LaTCTP的5′部分基因组序列（序列19）设计了三条基因特异性 引物5′LaTCTP1、5′LaTCTP2和5′LaTCTP3（表3），用于其5′侧翼序列扩增。

表3LaTCTP基因特异性引物

2、落叶松基因组DNA的提取

取日本落叶松(Larix leptolepis)胚性组织0.1-0.5g，放于液氮中迅速冷冻，采用 实施例1中所述的CTAB法提取基因组DNA。最终用50μL灭菌水溶解DNA，经 NanorDrop1000测定，DNA浓度为471.9ng/μL。

3、第一轮PCR扩增

取约200～400ng基因组DNA（约1μL）作为模板，选取SAP1至SAP15（见表 1）分别作为上游引物，5′LaTCTP1为下游引物，进行第一轮PCR反应。

第一轮PCR反应体系的配制同实施例1，反应条件见表2。

4、第二轮PCR扩增

取第一轮PCR反应液1μL（不需要稀释）作为第二轮PCR反应的模板，以SEP为 上游引物，5′LaTCTP2Primer为下游引物，进行第二轮PCR反应。

第二轮PCR反应体系的配制同实施例1，反应条件见表2。

5、第三轮PCR扩增

取第二轮PCR反应液1μL（不需要稀释）作为第三轮PCR反应的模板，以SNP 为上游引物，5′LaTCTP3Primer为下游引物，进行第三轮PCR反应。

第三轮PCR反应体系的配制同实施例1，反应条件见表2。

6、PCR产物回收及序列比对

PCR结束后，分别取第一轮PCR扩增、第二轮PCR扩增和第三轮PCR扩增的反 应液各5μL，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。

结果如图3中A-1至A-3所示，在第一轮PCR扩增中分别采用SAP1至SAP15 进行的PCR反应，第一轮PCR扩增均无条带出现（扩增产物的量较低，基本检测不 到），有些组第二轮PCR和第三轮PCR均有清晰的条带，且第三轮PCR的条带均比 第二轮PCR的条带稍小，有些组第二轮PCR没有得到清晰条带，但第三轮PCR得到 了清晰的条带。

本发明的发明人从第二轮PCR和第三轮PCR均有清晰的条带的组别中选取了 SAP1组和SAP2组。将两组的第三轮PCR产物（约1000bp）切胶回收，连接到T载 体后用于测序。SAP2组的测序结果如序列表中序列23所示，SAP1组的测序结果如 序列表中序列24所示。将测序结果进行比对后，发现扩增的序列（序列23和序列24） 的3′端与已知序列（序列19）的5′端有229bp的重叠区域，证明获取的1000bp左右 的DNA片段为落叶松基因组中LaTCTP基因的5′端序列。

同时，本发明的发明人采用传统的TAIL-PCR对落叶松基因组中LaTCTP基因的 5′端序列也进行了扩增，其中AP3引物序列如下：

AP3：5’-WGTGN AGWAN CANAGA-3’

其中，W表示A或T；N表示A、T、C或G。

结果如图3中B所示，所得片段较短仅有约400bp。测序比对后，发现扩增的序 列（序列25）的3′端与已知序列（序列19）的5′端有229bp的重叠区域。

综合以上结果，表明利用实施例1所制备的试剂盒，采用SNM-PCR方法可以有 效进行染色体步移，且其步移效率远远高于传统的TAIL-PCR方法。

实施例3、利用实施例1制备的试剂盒从落叶松基因组DNA中获得LaNFYA1基 因的5′端序列

1、LaNFYA1基因特异性引物的设计

依据实施例1中的特异性引物设计的原则，利用引物设计软件primer5，根据落叶 松的LaNFYA1基因的5′UTR序列（序列26）设计了三条基因特异性引物5′LaNFYA1-1、 5′LaNFYA1-2和5′LaNFYA1-3（表4），用于其5′侧翼序列步移。

表4LaNFYA1基因的特异性引物

2、落叶松基因组DNA的提取

同实施例2。

3、第一轮PCR扩增

取约400ng基因组DNA（约1μL）作为模板，选取SAP1和SAP2（见表1）分 别作为上游引物，5′LaNFYA1-1为下游引物，进行第一轮PCR反应。

第一轮PCR反应体系的配制同实施例1，反应条件见表2。

4、第二轮PCR扩增

取第一轮PCR反应液1μL（不需要稀释）作为第二轮PCR反应的模板，以SEP为 上游引物，5′LaNFYA1-2为下游引物，进行第二轮PCR反应。

第二轮PCR反应体系的配制同实施例1，反应条件见表2。

5、第三轮PCR扩增

取第二轮PCR反应液1μL（不需要稀释）作为第三轮PCR反应的模板，以SNP 为上游引物，5′LaNFYA1-3为下游引物，进行第三轮PCR反应。

第三轮PCR反应体系的配制同实施例1，反应条件见表2。

6、PCR产物回收及序列比对

PCR结束后，分别取第一轮PCR扩增、第二轮PCR扩增和第三轮PCR扩增的反 应液各5μL，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。

结果如图4所示，，在第一轮PCR扩增中分别采用SAP1和SAP2进行的三组PCR 反应，第一轮PCR扩增均无条带出现（扩增产物的量较低，基本检测不到），第二轮 PCR和第三轮PCR均有清晰的条带，且第三轮PCR的条带均比第二轮PCR的条带稍 小。

另外，将SAP2组的第三轮PCR产物（约1.5Kb）切胶回收，连接到T载体后用 于测序。测序结果如序列表中序列28所示。将测序结果进行比对后，发现扩增的序列 （序列30）的3′端与已知序列（序列26）的5′端有65bp的重叠区域，证明获取的1.5Kb DNA片段为落叶松基因组中LaNFYA1基因的5′端序列。

综合以上结果，表明利用实施例1所制备的试剂盒，采用SNM-PCR方法可以有 效进行染色体步移。