一种遗传性视锥细胞营养不良疾病的致病突变及其检测试剂

摘要

本发明公开了一种遗传性视锥细胞营养不良疾病的致病突变及其检测试剂。一种用于检测遗传性视锥细胞营养不良疾病的突变的LCA5基因，突变的LCA5基因为双等位基因杂合突变LCA5p.[Ala212Pro]；[Tyr441Cys]。一种检测遗传性视锥细胞营养不良疾病的试剂盒包括：检测LCA5基因物理位置为80223015和80197493核苷酸位点的试剂；或检测LCA5蛋白第212位或第441位氨基酸位点的试剂；(b)说明书。本发明获得遗传性视锥细胞营养不良疾病的致病突变LCA5p.[Ala212Pro]；[Tyr441Cys]，通过检测该突变可以进行遗传性视锥细胞营养不良疾病的诊断。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种遗传性视锥细胞营养不良疾病的致病突变及其检测试 剂。

背景技术

视锥细胞营养不良(cone dystrophy；CD)是一组由遗传缺陷引起的进行性视网膜退行性 疾病，这类疾病以视锥细胞的不可逆性凋亡为主要病理特征，疾病晚期部分患者可合并有视杆 细胞的损害。CD患者的临床表现为幼年发生的中心视力的进行性下降，严重者可致盲。CD是 临床上常见且危害较为严重的一类遗传性致盲疾病，是严重危害世界范围内工作年龄人群的一 大类致盲眼病，CD在我国乃至世界范围内均有较高的发病率。我国是CD遗传资源大国，但目 前CD相关的遗传学信息多来自西方国家，因此对我国CD患者进行深入的遗传学研究，探寻潜 在的CD相关的新致病基因及致病突变显得尤为重要。

CD多为单基因遗传病，具有显著的临床及遗传异质性。CD的遗传异质性表现在众多基因 缺陷均可致病，其常见的遗传模式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传及X连锁隐性遗传。 迄今，全世界已鉴定出28个CD相关致病基因和32个连锁位点(www.RetNet.org)，且随着研究 深入，该数目正逐年递增。与此同时，携带有相同致病基因突变甚至是相同致病突变的患者， 其临床表现亦可能存在较大差异，即显著的临床异质性。目前仍有40％到50％(西方国家统计 结果，我国比率更高)CD患者的致病基因尚未找到，提示存在大量CD的新致病基因有待挖掘。

针对CD的分子遗传学研究必须建立在一定的分子生物学技术的基础上。研究CD致病基因 的一个重要目的是进行CD的分子诊断，鉴于其显著的遗传异质性，如何检测众多致病基因突 变是目前的难题之一。基于连锁分析的定位克隆策略是鉴定单基因遗传病致病基因的经典方 法，但是同时也面临一些困难：①通常需要多代家系，难以分析小家系和散发病例。②有时多 代家系也不能定位致病位点。③难以在连锁区域内筛选出正确的致病基因。因此，鉴于CD疾 病本身的性质及传统分析技术的局限性，寻求一种全新的CD致病基因的研究方法显得尤为迫 切。

Leber congenital amaurosis 5(LCA5；MIM 611408)基因位于6号染色体长臂6q14.1位置， 该基因含有9个外显子，其编码的LCA5蛋白是一种高度保守、广泛表达的纤毛蛋白。现有研究 表明，LCA5基因突变可以引起雷伯氏先天性黑矇(Leber congenital amaurosis；LCA)、视网膜 色素变性(retinitis pigmentosa；RP)及早发视网膜萎缩(early-onset retinal dystrophy；EORD)， 然而LCA5基因突变与CD间的关系却从未被报道或得到证实。

发明内容

本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种遗传性视锥细胞营养不良疾病的致病突变。

本发明的另一目的是提供该致病突变的应用。

本发明的又一目的是提供该致病突变的检测试剂。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种用于检测遗传性视锥细胞营养不良疾病的突变的LCA5基因，突变的LCA5基因为双等 位基因杂合突变LCA5 p.[Ala212Pro]；[Tyr441Cys]。

野生型LCA5基因在Ensemble数据库中的基因编号为：ENSG00000135338，所述的突变的 LCA5基因在物理位置为8022301的碱基由G突变为C，在物理位置为80197493的碱基由A突 变为G，其他部分与野生型相同。

一种突变的LCA5蛋白，野生型LCA5蛋白在Ensemble数据库中的基因转录本编号为： ENST00000392959，突变的LCA5蛋白在该野生型蛋白的第212位氨基酸由丙氨酸突变为脯氨酸， 第441位氨基酸由酪氨酸突变为半胱氨酸，其他部分与野生型相同。

本发明所述的突变的LCA5基因或者所述的突变的LCA5蛋白在制备遗传性视锥细胞营养 不良疾病检测试剂或检测设备中的应用。

其中所述的检测试剂优选自：引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片中的一种或多种。

所述的检测设备优选包括含有检测突变的LCA5基因的基因芯片的检测平台。

一种检测遗传性视锥细胞营养不良疾病的试剂盒，所述的试剂盒包括：

(a)检测LCA5基因物理位置为80223015和80197493核苷酸位点的试剂；或检测LCA5蛋白第 212位或第441位氨基酸位点的试剂；

(b)说明书。

其中，所述的试剂优选选自引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片中的一种或多种。

作为本发明的一种优选，所述的试剂为基于深度测序为平台的基因芯片杂交探针。

检测80223015核苷酸位点的杂交探针序列优选为chr6|80222784-80223585，序列如SEQ  ID NO.7所示；检测80197493核苷酸位点的杂交探针序列优选为chr6|80196291-80198213， 序列如SEQ ID NO.2所示。

作为本发明的另一种优选，所述的试剂为检测80223015核苷酸位点和80197493核苷酸 位点的引物对。

检测80223015核苷酸位点的正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQ ID  NO.12；检测80197493核苷酸位点的正向引物序列为SEQ ID NO.13，反向引物序列为SEQ ID  NO.14。

一种以深度测序为平台筛查CD患者中LCA5基因突变的方法，包括以下步骤：

(1)建立CD患者家系临床与遗传资源库，收集CD家系的临床资料及血液标本，提取基因组 DNA；

(2)设计SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示的用于检测LCA5基因突变的杂交探针，并将其整 合到基因芯片上；

(3)利用制备的基因芯片捕获目标区域并进行深度测序；

(4)对测序结果进行优化的生物信息学分析，筛选到一个新的CD新的致病突变为双等位基因 杂合突变LCA5p.[Ala212Pro]；[Tyr441Cys]。突变LCA5p.Ala212Pro位于6号染色体，物理 位置为80223015(Ensemble数据库)的碱基由G突变为C；RNA水平：LCA5基因编码 RNA第634位碱基由G突变为C；蛋白水平：LCA5基因编码蛋白第212位氨基酸由丙氨 酸突变为脯氨酸；突变LCA5 Tyr441Cys位于6号染色体，物理位置为80197493(Ensemble 数据库)的碱基由A突变为G；RNA水平：LCA5基因编码RNA第1322位碱基由A突变 为G；蛋白水平：LCA5基因编码蛋白第441位氨基酸由酪氨酸突变为半胱氨酸

步骤(2)所述的基因芯片优选Roche Nimblegen公司生产的基因芯片。

步骤(3)所述的利用制备的基因芯片捕获目标区域并进行深度测序优选利用美国Illumina 公司的Hi-seq2000仪器完成。

步骤(3)所述的利用制备的基因芯片捕获目标区域并进行深度测序优选流程为：将基因组 DNA片段化，在DNA末端标记“A”并与Illumina PE接头-寡核苷酸混合物相连接；连接产物 经PCR富集，获得DNA文库，并将DNA文库与已知致病基因捕获芯片杂交、洗脱、纯化， 获得编码序列；创建配对末端，在Illumina HiSeqTM 2000平台上对目标序列进行测序。

有益效果

1.CD是常见的、严重的遗传性致盲疾病，在我国发病率较高，严重危害了国民健康。挖 掘CD的新致病突变和新致病基因有利于进一步探索CD的分子遗传学病因，是充分利用我国 的眼科遗传病资源，造福CD患者的现实需要，是后基因组时代最重要的研究方向之一。本专 利旨在探索CD的遗传学病因，从而帮助了解发病机制、辅助临床诊断、产前诊断和转基因治 疗。

2.大量研究证实，LCA5基因的功能异常能够引起LCA、RP及EORD，但是目前并没有 研究指出LCA5基因突变与CD间的关系，因此，针对LCA5基因与CD的相关研究显得尤为 必要。本专利的选择LCA5基因作为CD的候选基因，是由申请人在多年从事临床医疗、遗传 学研究的基础上所筛选出的，通过本发明方法进一步明确了LCA5基因与CD的关系。

3.一个基因可以对应多个不同的转录本，且不同转录本所编码的RNA及蛋白有所不同。 本专利中申请人根据长期从事遗传学研究的经验，筛选出LCA5基因的最优转录本，并根据不 同的转录本设计相应的探针，从而使筛查效益达到最高，最终获得遗传性视锥细胞营养不良疾 病的致病突变LCA5 p.[Ala212Pro]；[Tyr441Cys]。

4.CD具有显著的遗传异质性，目前已知致病基因28个，已连锁位点32个，且仍存在大量 未知的致病基因。本发明提供了新的致病基因的致病位点，为该疾病的诊断提供了新的分子生 物学基础。

附图说明

图1家系图

图2先证者眼底照

图3先证者双眼眼底荧光血管造影

图4先证者双眼光学相干断层成像

图5 LCA5突变及野生型序列测序图

图6保守性分析

图7野生型及携带有突变的LCA5蛋白晶体结构

具体实施方式

实施例1

对一个二代的患有视锥视杆细胞营养不良(cone dystrophy；CD)的家系的LCA5基因突 变进行检测。

实验方法：

1.该家系临床资源的采集及遗传资源库的建立：

收集该家系中各成员的临床资料及血液样本，家系图见图1。临床资料主要包括个人病史、 家族史、最佳矫正视力(best corrected visual acuities；BCVAs)、裂隙灯检查、眼底照、色觉检 查、视野检查(Humphrey视野计)、视觉诱发电位检测(visual-evoked potentials；VEP)、全 视野电生理检查(electroretinography；ERG)、眼底荧光血管造影检查(fundus fluorescein  angiography；FFA)及光学相干断层成像检查(optical coherence tomography；OCT)等。并用 血液基因组DNA提取试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)对家系各成员的血液基因组DNA进 行提取。

2.借助于高通量二代测序挖掘该家系的致病突变：

2.1设计并订制捕获芯片：

2.1.1 LCA5基因及转录本序列信息：

该基因捕获芯片涵盖了221个由RetNet(www.retnet.org)公布的视网膜疾病相关基因， 其中包括我们筛选出的CD的候选基因LCA5基因，该基因捕获芯片可对目前所有已知的CD 相关的致病基因进行检测。我们所参照的LCA5基因在Ensemble数据库中的基因编号为： ENSG00000135338，选择LCA5基因作为CD的候选基因是由申请人在多年从事遗传学研究的 基础上查阅大量文献所得出的。(注：该编号来自Ensemble数据库，www.ensembl.org，可输 入基因编码检索基因详细信息及基因序列)。

2.1.2转录本的选择：

针对不同基因选择特定的转录本，每个基因均含有多个转录本，在选择转录本时，我们的 原则是：首先考虑拥有CCDS编码蛋白的转录本，若一个基因有多个转录本均编码蛋白，则 首选含氨基酸数最多的蛋白相对应的转录本，若多个转录本氨基酸含量相同，则进一步选择含 碱基数最多的转录本。据以上原则，我们所筛选出的LCA5基因转录本编号为： ENST00000392959。(注：该编号来自Ensemble数据库，www.ensembl.org，可输入转录本编 码检索转录本详细信息及转录本序列)。

2.1.2杂交探针的设计：

申请人根据挑选出的LCA5转录本设计杂交探针，并由Roche-NimbleGen公司定制。杂交 探针的设计标准为：(1)探针覆盖所有候选基因的目标区域，即外显子区域以及外显子和内含 子拼接处(外显子上下游各100个bp)；(2)去除重复序列：对于在基因组出现的高度重复序列以 及在人类基因组中出现2-5倍的较低频率的重复片段，我们予以去除，避免捕获其他同源基因， 增加假阳性，从而降低检测效率。申请人将所有候选基因的目标区域与人类基因组DNA序列 进行比对，共移除了2.5％的重复序列；(3)在探针设计过程中，我们对临近的外显子进行了特 定的整合，其相邻探针整合标准为：当相邻外显子的综合目标区域(即前个外显子的上游100bp 起至后一个外显子的下游100bp止)总和小于600bp，即将其整合为一个探针，以求通过一对探 针完成多对外显子区域的捕获；(4)当所设计探针序列小于250bp时，在其两端各包含上下游 100bp的内含子的基础上，各继续增加相同bp数的内含子，使探针大小达到250bp。根据以上 设计原则，我们针对LCA5基因所设计的探针序列如下：

用于筛选CD致病基因LCA5的杂交探针序列共10条，序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10 所示；

2.2目标区域捕获及深度测序：

首先将基因组DNA片段化，并在DNA末端标记“A”，与Illumina PE接头-寡核苷酸混合 物相连接，连接产物经PCR富集，获得DNA文库。然后将DNA文库与已知致病基因捕获芯 片杂交、洗脱、纯化，获得编码序列。最后创建配对末端，在HiSeqTM 2000(Illumina,Inc.,San  Diego,CA,USA)平台上对目标序列进行测序。

2.3对测序数据进行生物信息学分析，筛选出候选致病基因：

2.3.1采用Mosaik软件(http://bioinformatics.bc.edu/marthlab/Mosaik)处理Illumina原始测序数据 (配对末端数据)，产生.bam类型文件。将.bam文件输入GATK，利用GATK检测单核苷酸变 异体(single nucleotide variant)和小的插入或缺失(insertion/deletions)，同时进行质量评估，便于 下游的生物信息学分析，最后产生.vcf类型文件。

2.3.2将患者的测序结果在包括dbSNP132 (http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp132.txt.gz.)，HapMap计划 (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)，1000Genome Project (ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)，炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)以及Exome  Variant Server(http://evs.gs.washington.edu/EVS/)在内的五个单核苷酸多态性(SNP)数据库中筛 查，滤过所有已知的SNP位点；

2.3.3将患者的测序结果所对应的基因序列进行比较和分析，优先分析插入/缺失突变、无义突 变和错义突变，结果可分为三类，包括已知突变、已知基因的新突变和新基因的突变。

2.4经Sanger测序验证，鉴定致病基因：

PCR法分别针对筛选出的突变位点及邻近DNA序列在相应家系中进行扩增，所用引物序 列采用Primer 3(http://frodo.wi.mit.edu/)引物设计软件设计。所用PCR的反应体系(20μL体系) 为：5*buffer 4μL，25mM MgCl₂ 2μL，DNA 1μL，正向引物F 1μL，反向引物R 1μL，10mM dNTP 0.4μL，Taq酶0.1μL，ddH₂O 10.5μL。PCR反应程序：98℃5min，35个循环(98℃10s，60℃ 15s，72℃1min)，72℃7min，4℃5min。3％琼脂糖凝胶电泳检测，与紫外线切胶仪下切取PCR 产物凝胶并纯化。对所有的PCR产物分别以正、反向引物测序，并对测序结果进行进一步分 析，使用NCBI在线对比工具BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，排除假阳性结果，并筛选 出在家族中共分离的突变位点。其中检测80223015核苷酸位点的正向引物序列为SEQ ID  NO.11，反向引物序列为SEQ ID NO.12；检测80197493核苷酸位点的正向引物序列为SEQ ID  NO.13，反向引物序列为SEQ ID NO.14。

实验结果：

1.家系临床资料：

眼科临床专家对该家系中的两名患者II：1和II：4进行了详细全面的临床检查后，对该 两名患者作出“视锥细胞营养不良”的临床诊断，下面以先证者为例，对其详细临床资料进行 说明：

1)BCVAs：右眼指数20/200，左眼20/200；

2)裂隙灯检查：未见明显异常；

3)眼底照：双眼黄斑区萎缩，后极部周边部未见明显异常(图2)；

4)色觉检查：双眼色弱；

5)视野检查：双眼中心暗点；

6)VEP：双眼P100波峰下降，潜伏期延长；

7)ERG：双眼视锥细胞反应消失，呈熄灭波，视杆细胞反应轻度下降；

8)FFA：双眼黄斑区可见异常高荧光，余未见明显异常(图3)；

9)OCT：双眼黄斑区感光细胞层消失(图4)。

2.该家系遗传检测结果：

通过对家族中的两名患者II：1和II：4进行目标区域捕获测序及生物信息学分析后，我 们发现了两位患者均携带有可疑的双等位基因杂合突变LCA5 p.[Ala212Pro]；[Tyr441Cys]，其对 应核苷酸改变为LCA5 c.[634G>C]；[1322A>G]，未发现其他可疑的致病基因突变位点。经Sanger 测序验证证实该突变位点在该家族中表现为共分离，测序结果见图5。突变LCA5 p.Ala212Pro 位于6号染色体，物理位置为80223015(Ensemble数据库)的碱基由G突变为C；RNA水平： LCA5基因编码RNA第634位碱基由G突变为C；蛋白水平：LCA5基因编码蛋白第212位氨 基酸由丙氨酸突变为脯氨酸；突变LCA5 Tyr441Cys位于6号染色体，物理位置为80197493 (Ensemble数据库)的碱基由A突变为G；RNA水平：LCA5基因编码RNA第1322位碱基 由A突变为G；蛋白水平：LCA5基因编码蛋白第441位氨基酸由酪氨酸突变为半胱氨酸，该 基因相关的突变从未在CD患者中发现。

根据我们所设计的筛选流程，借助我们所设计的基因芯片及深度测序技术，我们成功证实 所检测到的该LCA5基因双等位基因杂合突变LCA5为CD新致病基因， p.[Ala212Pro]；[Tyr441Cys]为该疾病的新致病位点。

实施例2：

针对实施例1中所检测出的致病基因进行功能学研究，此处以上述检测到的LCA5基因新突变 p.[Ala212Pro]；[Tyr441Cys]为例。

实验方法：

1.保守性分析：

采用NCBI HomoloGene数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene)对所筛选得到突变 在多个物种中进行保守性评估及预测。

2.根据SIFT和PolyPhen值预测突变的致病能力：

采用两款主流在线预测软件：PolyPhen-2(Polymorphism Phenotyping,version 2； http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)以及SIFT Human Protein DB(http://sift.bii.a-star.edu.sg/)，预 测错义突变及无义突变对蛋白水平的影响，从而预测突变的致病能力。

3.蛋白晶体结构改变研究：

采用SWISS MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)预测软件对LCA5野生型蛋白及携带有 p.Ala212Pro突变的突变蛋白结构分别进行预测，评估突变所引起的蛋白结构改变。

实验结果：

1.保守性分析：

LCA5 p.Ala212Pro及p.Tyr441Cys这两个位点在鼠、猪、牛、狼、猩猩及人类等多个物种中 均高度保守，即该位点在进化过程中高度保守，从而进一步证明该位点的突变可能会引起较为 严重的病理现象(图6)。

2.SIFT和PolyPhen值预测：

LCA5 p.Ala212Pro其SIFT值为0.181，PolyPhen值为0.999；LCA5 p.Tyr441Cys其SIFT值为 0.111，PolyPhen值为0.003，高度提示这两个突变位点均拥有较大的致病可能性。

3.蛋白晶体结构改变研究：

蛋白晶体结构预测结果显示，野生型LCA5蛋白的212号氨基酸位点丙氨酸可与209号位 点的异亮氨酸以及213号位点的精氨酸分别作用产生氢键，而突变型LCA5蛋白的212号氨基 酸位点脯氨酸仅可与213号位点的精氨酸作用产生氢键，其与209号位点的异亮氨酸间的氢键 则因为该突变的氨基酸改变而消失，因此，该突变可以引起明显的蛋白结构改变，从而对蛋白 功能产生影响(图7)。