基于特异性SS-COI引物的棉长管蚜PCR快速检测方法

摘要

基于特异性SS-COI引物的棉长管蚜PCR快速检测方法，所述引物为正向引物Ag22F和反向引物Ag22R，该引物只对棉长管蚜具有特异性扩增效果，扩增产物大小为260bp，DNA最低检出浓度为0.170ng/μL。用于植保领域棉长管蚜优势天敌确定及食物链分析，特异性强，准确率高，方便快捷易操作。

说明书

一、技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种PCR检测方法，具体为基于棉长 管蚜特异性SS-COI引物的PCR检测方法。

二、背景技术

棉长管蚜(Acyrthosiphon gossypii Mordvilko)，又叫棉无网长管蚜、 大棉蚜，属同翅目，蚜科。为害棉花、骆驼刺、苦豆子、蚕豆、豇豆、绿豆、 圆叶锦葵、甘草等。

棉长管蚜群集现象较弱，分散于棉株叶背、嫩枝和花蕾上，以刺吸式口 器吸食棉花汁液。为害盛期在蕾铃期，受害部位出现失绿的细小点，叶片发 生轻微卷曲，影响棉株发育，当虫口密度大时，大量消耗棉花体内营养，造 成蕾铃脱落。

吕昭智等开展的新疆棉区棉蚜和棉长管蚜关系的研究中，文中提到棉长 管蚜在国内仅分布于新疆和甘肃，为我国西北内陆棉区的特有种。其广泛分 布在新疆的南部、北部棉区，严重地影响棉花的生产，成为新疆棉区中的主 要害虫之一(中国棉花，2002，3：11-12)。

有效利用棉田自然天敌防治棉长管蚜是现代农业生产中重要的防治手 段。棉田有许多捕食性天敌，如瓢虫类、草蛉类、食虫蝽类、蜘蛛等，明确 棉田自然天敌对棉长管蚜的捕食作用，对于构建田间节肢动物营养食物网和 确立优势天敌种类至关重要。研究天敌的捕食关系方法有直接观察法、肠胃 分析法、生态能学分析等，这些传统手段很难准确开展食物营养关系的定量 分析，且费时、费力、花费较高、不易重复等。

Species-Specific-COI PCR检测技术是在mtDNA COI技术的基础上发 展起来的特异序列扩增区域标记，是利用物种特异性COI引物(SS-COI)，根据 预期DNA条带的有无来鉴定检测样本，无需测序和序列比对，其具有灵敏度 高、特异性强、重复性好、快速、简便等优点。中国专利说明书CN103436618A 公开的棉蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法即是该方 法的具体应用。

但棉长管蚜为西北内陆棉区特有，分布区域有限，相关研究报道较少， 在Genbank上检索不到COI基因片段。因此该方法尚未在棉长管蚜的检测方面 得以应用。

三、发明内容

本发明的目的是提供一种基于特异性SS-COI引物的棉长管蚜PCR快速 检测方法。

本发明根据棉长管蚜的线粒体DNA序列，设计一对棉长管蚜的特异性 SS-COI引物，其包括：

正向引物Ag22F：5′-TCTTAATTAATAATGGTACG-3’

反向引物Ag22R：5′-ACCAGCTAAAACTGGTAGAG-3’

本发明棉长管蚜特异性快速PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)提取样品总DNA；

(2)以步骤1)提取的总DNA为模板，利用上述引物Ag22F和Ag22R进 行PCR扩增反应；PCR反应体系以20μL计为：

PCR反应条件为：94℃3分钟，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分钟，共 45个循环；之后72℃10分钟。

(3)分析PCR产物

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如出现大小为260bp的DNA 扩增条带(SEQ ID No.3)，则表明样品为棉长管蚜。

本发明还提供含有引物Ag22F和Ag22R的用于检测棉长管蚜的试剂盒， 所述试剂盒还包括棉长管蚜DNA标准阳性模板。

本发明是通过DNA条形码技术中的通用引物

LepF1：(5′-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’)和

LepR1：(5′-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’)

扩增出棉长管蚜的COI产物，经测序比对，进行引物设计，并多次筛选修 正，得到上述一对特异引物。该引物特异性强，只针对棉长管蚜扩增出清晰、 单一的长度为260bp的特异性条带，而对棉田中的其它昆虫无扩增效果。采用 SS-COI PCR技术检测棉长管蚜，该技术操作简单、快速、高效，灵敏度较 高，棉长管蚜的DNA最低检出浓度为0.170ng/μL。

本发明为棉长管蚜DNA分析提供了定性与定量分析的检测方法，用于植 保领域确定棉长管蚜优势捕食天敌及明确食物链关系，准确性高，特异性强， 操作简便快速。

四、附图说明

图1为本发明引物Ag22F/Ag22R对棉长管蚜特异性扩增效果图。其中，M： 100bp DNA Iadder；1-64为表1中序号所对应昆虫的扩增结果，-为阴性对照。

图2为本发明棉长管蚜特异性引物Ag22F/Ag22R的DNA浓度梯度检测 结果图。其中，M：100bp DNA Iadder；1-6为棉长管蚜DNA原模板浓度 174.4ng/μL依次4倍稀释浓度梯度，-为阴性对照。

五、具体实施方式

以下具体实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别 指明，实例均按照常规分子生物学实验条件，以及按照产品说明书建议的条 件进行操作。

第一部分，引物Ag22F/Ag22R对棉长管蚜的扩增

(1)棉长管蚜基因组的制备

在棉田采集棉长管蚜，将单头蚜虫放入1.5mL离心管中将其磨碎，用 OMEGA Insect Genomic DNA Kit提取试剂盒(OMEGA公司，美国)提取单 头蚜虫基因组。将DNA溶液保存于-20℃备用，进行PCR扩增时吸取1μL溶液 作为DNA模板。

(2)合成检测棉长管蚜的特异性SS-COI引物，序列为

Ag22F：5′-TCTTAATTAATAATGGTACG-3’(SEQ ID No.1)

Ag22R：5′-ACCAGCTAAAACTGGTAGAG-3’(SEQ ID No.2)

(3)PCR扩增

反应体系为20μL，包括：10×Taq缓冲液2.0μL、dNTP(2.5mM)1. 6μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL、正、反向引物(20nM)各0.3 μL、模板DNA1.0μL、ddH2O 14.6μL。

PCR反应条件为：94℃3分钟，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分钟，共 45个循环；之后72℃10分钟。

(4)PCR产物鉴定

取8μL PCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后， 于凝胶成像系统中，出现大小为260bp的DNA扩增条带(SEQ ID No.3)。

第二部分，引物Ag22F/Ag22R对棉长管蚜的特异性扩增效果

利用引物Ag22F/Ag22R，以棉长管蚜DNA为模板，以棉长管蚜同域的32 种其他昆虫(见表1)为对照进行SS-COI PCR扩增，结果如图1所示。1、2 泳道对应的棉长管蚜扩增出了260bp的目的条带，表明根据棉长管蚜线粒体 DNA COI基因设计的SS-COI引物的特异性强，其260bp序列如SEQ ID No.3 所示。

表1引物特异性检测中所涉及的昆虫种类

第三部分，引物Ag22F/Ag22R对棉长管蚜最低检出量的测定

按第一部分中的方法提取单头棉长管蚜基因组DNA，然后原模板浓度 174.4ng/μL以4倍进行递减稀释至检测不出条带，取1μL作为PCR检测的模 板，进行PCR反应，其反应体系同上。

利用引物Ag22F/22AgR做最低检出量的测定，棉长管蚜的DNA最低检 出浓度为0.170ng/μL，结果如图2所示。

序列表

SEQ ID No.1

Ag22F：5′-TCTTAATTAATAATGGTACG-3’

SEQ ID No.2

Ag22R：5’-ACCAGCTAAAACTGGTAGAG-3’

SEQ ID No.3