一种利用食用菌菌渣固体发酵产γ-聚谷氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用食用菌菌渣固体发酵产γ-聚谷氨酸的方法，该方法包括如下步骤：(1)固体菌剂的制备：收集γ-聚谷氨酸发酵液中的菌体，并与载体混合，干燥，即得固体菌剂；(2)固体发酵：将步骤(1)得到的固体菌剂接种到发酵培养基中，混合均匀，发酵制备γ-聚谷氨酸；所述的发酵培养基由固体基质和外源添加物组成，所述的固体基质为食用菌菌渣与味精粕的混合物。与现有的固体发酵生产γ-聚谷氨酸技术相比，本发明不仅能高效地生产γ-聚谷氨酸，而且农业废弃物的利用大大降低了生产成本，同时也为这些废弃物的处理找到了新的出路，避免带来的环境污染问题。因此，本发明是一种高效率、低成本、绿色环保的生物反应过程，具有良好的工业化应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及到一种利用食用菌菌渣固体发酵高产γ-聚谷氨酸的方法。

背景技术

γ-聚谷氨酸(γ-poly-glutamic acid，简称γ-PGA)是谷氨酸单体以γ-羧基与α-氨基相缩合的一种聚氨基酸(结构如下)。分子量分布在100KDa到10000KDa之间。

γ-PGA的分子链上有大量的活性较高的游离侧链羧基，可在分子内部或分子之间形成氢键，具有极佳的生物可降解性、成膜性、成纤维性、可塑性、粘结性、保湿性等许多独特的理化和生物学特性，在注重环保、强调可持续发展的今天，γ-PGA及其衍生物有十分广阔的应用前景，可用于化妆品、食品、农业肥料、医药敷料、分散剂、螯合剂、建筑涂料、防尘等领域。

目前，国内外对γ-PGA的发酵生产工艺进行了广泛的研究，主要以微生物液体深层发酵生产为主，但仍然存在很多不足的地方和难以解决的问题：(1)、随着发酵的进行，发酵液粘度增大，限制了氧气的供应和质量的传递；(2)、发酵过程中产生大量泡沫，加重了控制难度和染菌的几率；(3)、原料成本昂贵，极大增加了γ-PGA的生产成本；(4)、水资源消耗严重，特别在水源紧缺的北方，使γ-PGA的大规模生产带来严重的阻碍。固体发酵是指在微生物以固体基质为载体，在没有或少量游离水的存在下进行的生物反应过程；与液体发酵相比，固体发酵展现出了巨大的优势，包括生产成本低、能源和水资源消耗少、设备要求简单，而且排放的废水少。沙长青等人利用纳豆杆菌，以大豆为原料固体发酵，能产生89.5g/kgγ-PGA(专利申请号：200410043690.5)；孙伟中等人利用农副产品固体发酵低成本生产γ-PGA的方法，产量达到100g/kg(专利公开号：CN 1908178A)；乔长昇等人发明了一种惰性吸附载体材料固态发酵生产γ-PGA的工艺，最高产量达到17.4g/L(专利公开号：CN 101705260A)。以上研究证明了γ-PGA的固体发酵生产时可行的，但是存在生产周期较长，生产效率低下，原料成本昂贵等问题；因此，一种成本低、效率高的固体发酵生产γ-PGA的方法亟待研究开发，这也将给γ-PGA的发酵工业带来全新的发展前景和应用平台！

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种原料成本低、能耗小、污染少、效率高的γ-PGA的固体发酵生产方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种利用食用菌菌渣固体发酵产γ-聚谷氨酸的方法，该方法包括如下步骤：

(1)固体菌剂的制备：将γ-聚谷氨酸生产菌经液体发酵后得到的发酵液进行处理(例如过滤或离心)，收集菌体，并与载体混合，干燥，即得固体菌剂；

(2)固体发酵：将步骤(1)得到的固体菌剂接种到固体发酵培养基中，混合均匀，继续进行固体发酵制备γ-聚谷氨酸；

所述的固体发酵培养基由固体基质和外源添加物组成，所述的固体基质为食用菌菌渣与味精粕的混合物。

其中，步骤(1)中，所述的菌体为B.subtilis PG-8，该菌株的保藏编号为CGMCCNO.6324。

其中，步骤(1)中，所述的载体为粉碎成粉末的麦麸和甘蔗渣的混合物，其中，麦麸和甘蔗渣的质量比为0.7～1.2:1～1.5，优选为1～1.2:1.4～1.5。

其中，步骤(1)中，菌体与载体添加质量比为0.8～2.4:1.5～3，优选为1.5～2:2.2～2.8，最优选1.5:2.4。

其中，步骤(1)中，所述的固体菌剂中含活菌数为5～6.5×10¹⁰cfu/g，优选5.0×10¹⁰cfu/g。

其中，步骤(1)中，所述的固体菌剂含水量低于10％，固体菌剂含水量为优选8％。

其中，步骤(2)中，所述的固体发酵，其发酵温度为30～35℃，发酵时间为48～56h，每隔8小时翻转培养物一次。

其中，步骤(2)中，食用菌菌渣与味精粕的质量比为1～1.6:0.5～1，优选为1.3～1.5:0.5～0.6。

其中，所述的食用菌菌渣为金针菇菌渣、平菇菌渣、香菇菌渣中的一种或几种的混合物；优选香菇菌渣及三种食用菌渣的混合物；最优选三种食用菌渣的混合物，更进一步优选三种食用菌渣的混合物中平菇菌渣、金针菇菌渣、香菇菌渣的比例为2.9～3.21:4.8～5.:5.8～6.1，优选三种平菇菌渣、金针菇菌渣、香菇菌渣的比例3:5:6。

其中，固体发酵培养基中外源添加物及其含量为：菊粉150～400g/kg、玉米芯粉50～200g/kg、MnSO₄·H₂O 50～200mg/kg、MgSO₄·7H₂O0.5～3g/kg。

其中，所述发酵培养基的pH为7.0，用水调节固体发酵培养基的湿度为50％以上。

其中，γ-聚谷氨酸的提取与检测方法如下：

取5-10g发酵物，加入10倍体积的蒸馏水，100-200rpm搅拌1～1.5h，5000rpm离心5min，上清液采用0.22μm滤膜过滤，用HPLC检测；HPLC的检测条件为：色谱柱：Shodex Ohpak SB-806M HQ；流动相：0.2M Na₂SO₄溶液，醋酸调pH 4.0；流速：1.0mL/min。

其中，所述的外源添加物菊粉按如下方法制备得到：首先收获新鲜的菊芋快根，快速清洗以除去泥土、石沙等杂物，此过程中浸泡清洗的时间不易过长，不超过30min，否则会加大菊芋中糖的损失；接着将洗净的菊芋切成块，大小在1～3cm左右，并置于沸水浴中加热5min以灭活PPO酶；然后将切块的菊芋放入65℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥8h至含水量在15％以下；最后经粉碎机粉碎，过40目筛，即为菊芋粉末，与4℃冰箱中保持备用。

其中，所述的外源添加物玉米芯粉按如下方法得到：脱粒的玉米芯晒干后经粉碎成细粒后备用。

有益效果：本发明具有如下突出的效果：

(1)本发明以农业废弃物食用菌渣作为固体发酵基质，不仅可以节约资源、低成本大量地生产γ-PGA，而且可有效地减少菌渣带来的环境污染问题。

(2)本发明中使用谷氨酸发酵废弃物-味精粕作为γ-PGA发酵生产的谷氨酸前体，与直接使用味精前体相比较，大大降低了γ-PGA的生产成本，还能有效合理地处理谷氨酸发酵废弃物。

(3)本发明中添加的菊粉中含有果糖、葡萄糖和大量的低聚果糖，为微生物的生长代谢提供了大量的碳源，而且菊粉吸湿性强，与菌渣混合后能延缓水分蒸发，防止培养基水分的散失。

(4)本发明中添加的玉米芯粉可作为优质氮源，有利于枯草芽孢杆菌氮代谢的进行，可从微生物细胞内合成谷氨酸为γ-PGA的合成提供大量的前体。

(5)本发明中发酵后的培养物含有γ-PGA和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，可以直接作为有机肥料应用于农业生产中，这又减少了提取γ-PGA所需的工艺，为农业级γ-PGA的开发提供了新的思路和广泛的前景。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例中所用的γ-PGA生产菌为B.subtilis PG-8，该菌株已经保藏在中国普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.6324。

实施例1：500mL三角瓶中利用金针菇菌渣固体发酵生产γ-PGA。

(1)、B.subtilis PG-8固体菌剂的的制备：在10吨发酵罐上发酵生产γ-PGA结束后，收集发酵液中的微生物菌体，并按照质量比1.5:2.4添加载体，混合均匀后置于回转真空双锥干燥机中在50℃下烘干至含水量约为8％，最后用铝箔袋包装防止吸潮，即可得到B.subtilis PG-8固体菌剂，所含活菌数为5.0×10¹⁰cfu/g。

(2)、固体发酵：固体发酵培养基组分(固体基质20g)为金针菇菌渣10g，味精粕10g，菊粉5g,玉米芯粉2.4g，MnSO₄·H₂O 0.002g，MgSO₄·7H₂O 0.05g；培养基初始水分为60％，pH为7.0；121℃灭菌15min。称取步骤(1)中制备的B.subtilisPG-8固体菌剂0.5g接种到灭过菌的发酵培养基中，混合均匀后，置于摇床中静息培养48h,发酵温度设为30℃，发酵过程中每隔8h在超净台中用无菌玻璃棒搅拌数次。

(3)、γ-PGA的提取与检测：取发酵后的培养物5g，加入10倍体积的蒸馏水(v/w)与培养物混合并于150rpm的摇床下搅拌1.5h，接着将混合物在5000rpm下离心5min，取上清液稀释15倍，用0.22μm滤膜去除菌体后进行HPLC检测，上样品为20μL，色谱柱为Shodex Ohpak SB-806M HQ，流动相为0.2M Na₂SO₄溶液，醋酸调pH 4.0，流速为1.0mL/min。将HPLC测定的γ-PGA浓度(g/L)置换成g/kg固体培养基。

采用金针菇菌渣在500mL三角瓶中固体发酵能产生146g/kgγ-PGA。

实施例2：500mL三角瓶中利用平菇菌渣固体发酵生产γ-PGA。

(1)、此实施例中关于B.subtilis PG-8固体菌剂的的制备和γ-PGA的提取方法，与实施例1中操作方法相同。

(2)、固体发酵：发酵培养基组分(固体基质20g)为平菇菌渣13g，味精粕7g，菊粉7.5g,玉米芯粉1.6g，MnSO₄·H₂O 0.004g，MgSO₄·7H₂O 0.05g；培养基初始水分为65％，pH为7.0；121℃灭菌15min。称取步骤(1)中制备的B.subtilis PG-8固体菌剂0.8g接种到灭过菌的发酵培养基中，混合均匀后，置于摇床中静息培养48h,发酵温度设为32℃，发酵过程中每隔8h在超净台中用无菌玻璃棒搅拌数次。

(3)、γ-PGA的提取与检测：提取得到的γ-PGA上清液液稀释20倍，进行HPLC检测，检测条件同实施例1中所述。

采用平菇菌渣在500mL三角瓶固体发酵生产γ-PGA浓度可达到153g/kg。

实施例3：500mL三角瓶中利用香菇菌渣固体发酵生产γ-PGA。

(1)、此实施例中关于B.subtilis PG-8固体菌剂的的制备和γ-PGA的提取方法，与实施例1中操作方法相同。

(2)、固体发酵：发酵培养基组分(固体基质20g)为香菇菌渣15g，味精粕5g，菊粉3g,玉米芯粉2g，MnSO₄·H₂O 0.001g，MgSO₄·7H₂O 0.03g培养基初始水分为70％，pH为7.0；121℃灭菌15min。称取步骤(1)中制备的B.subtilis PG-8固体菌剂1g接种到灭过菌的发酵培养基中，混合均匀后，置于摇床中静息培养56h,发酵温度设为35℃，发酵过程中每隔8h在超净台中用无菌玻璃棒搅拌数次。

(3)、γ-PGA的提取与检测：提取得到的γ-PGA上清液液稀释25倍，进行HPLC检测，检测条件同实施例1中所述。

采用香菇菌渣在500mL三角瓶固体发酵生产γ-PGA浓度可达到164g/kg。

实施例4：500mL三角瓶中利用混合菌渣固体发酵生产γ-PGA。

(1)、此实施例中关于B.subtilis PG-8固体菌剂的的制备和γ-PGA的提取方法，与实施例1中操作方法相同。

(2)、固体发酵：发酵培养基组分(固体基质20g)为平菇菌渣6g，香菇菌渣6g，味精粕8g，菊粉4g,玉米芯粉2.5g，MnSO₄·H₂O 0.003g，MgSO₄·7H₂O 0.03g培养基初始水分为70％，pH为7.0；121℃灭菌15min。称取步骤(1)中制备的B.subtilisPG-8固体菌剂1g接种到灭过菌的发酵培养基中，混合均匀后，置于摇床中静息培养48h,发酵温度设为35℃，发酵过程中每隔8h在超净台中用无菌玻璃棒搅拌数次。

(3)、γ-PGA的提取与检测：提取得到的γ-PGA上清液液稀释25倍，进行HPLC检测，检测条件同实施例1中所述。

采用混合菌渣在500mL三角瓶固体发酵生产γ-PGA浓度可达到150g/kg。

实施例5：500mL三角瓶中利用混合菌渣固体发酵生产γ-PGA。

(1)、此实施例中关于B.subtilis PG-8固体菌剂的的制备和γ-PGA的提取方法，与实施例1中操作方法相同。

(2)、固体发酵：发酵培养基组分(固体基质20g)为平菇菌渣3g，金针菇菌渣5g，香菇菌渣6g，味精粕6g，菊粉6g,玉米芯粉2.5g，MnSO₄·H₂O 0.004g，MgSO₄·7H₂O0.05g；培养基初始水分为70％，pH为7.0；121℃灭菌15min。称取步骤(1)中制备的B.subtilis PG-8固体菌剂1g接种到灭过菌的发酵培养基中，混合均匀后，置于摇床中静息培养56h,发酵温度设为35℃，发酵过程中每隔8h在超净台中用无菌玻璃棒搅拌数次。

(3)、γ-PGA的提取与检测：提取得到的γ-PGA上清液液稀释25倍，进行HPLC检测，检测条件同实施例1中所述。

采用混合菌渣在500mL三角瓶固体发酵生产γ-PGA浓度可达到175g/kg。

实施例6：5L抽滤瓶中利用混合菌渣固体发酵生产γ-PGA。

(1)、此实施例中关于B.subtilis PG-8固体菌剂的的制备和γ-PGA的提取方法，与实施例1中操作方法相同。

(2)、固体发酵：发酵培养基组分(固体基质200g)为金针菇菌渣55g，香菇菌渣85g，味精粕60g，菊粉65g,玉米芯粉25g，MnSO₄·H₂O 0.03g，MgSO₄·7H₂O 0.6g；培养基初始水分为65％，pH为7.0；121℃灭菌15min。称取步骤(1)中制备的B.subtilis PG-8固体菌剂8g接种到灭过菌的发酵培养基中，混合均匀后，置于摇床中静息培养56h,发酵温度设为35℃，发酵过程中每隔8h在超净台中用无菌玻璃棒搅拌数次。

(3)、γ-PGA的提取与检测：提取得到的γ-PGA上清液液稀释25倍，进行HPLC检测，检测条件同实施例1中所述。

采用混合菌渣在5L抽滤瓶中固体发酵生产γ-PGA浓度可达到162g/kg。

实施例7：5L抽滤瓶中利用混合菌渣固体发酵生产γ-PGA。

(1)、此实施例中关于B.subtilis PG-8固体菌剂的的制备和γ-PGA的提取方法，与实施例1中操作方法相同。

(2)、固体发酵：发酵培养基组分(固体基质200g)为平菇菌渣35g，金针菇菌渣60g，香菇菌渣60g，味精粕45g，菊粉50g,玉米芯粉20g，MnSO₄·H₂O 0.04g，MgSO₄·7H₂O 0.6g；培养基初始水分为65％，pH为7.0；121℃灭菌15min。称取步骤(1)中制备的B.subtilis PG-8固体菌剂8g接种到灭过菌的发酵培养基中，混合均匀后，置于摇床中静息培养56h,发酵温度设为35℃，发酵过程中每隔8h在超净台中用无菌玻璃棒搅拌数次。

(3)、γ-PGA的提取与检测：提取得到的γ-PGA上清液液稀释25倍，进行HPLC检测，检测条件同实施例1中所述。

采用混合菌渣在5L抽滤瓶中固体发酵生产γ-PGA浓度可达到168g/kg。

实施例8：3m²野外堆肥固体发酵生产γ-PGA。

此实施例选用通风良好、空旷的露天进行，堆肥实验规模为长度2m，宽度1.5m,总面积3m²，培养物堆积厚度大约为5cm。

(1)、此实施例中关于B.subtilis PG-8固体菌剂的的制备和γ-PGA的提取方法，与实施例1中操作方法相同。

(2)、固体发酵：发酵培养基组分(固体基质15kg)为平菇菌渣3.5kg，金针菇菌渣4kg，香菇菌渣4kg，味精粕3.5kg，菊粉3.5kg,玉米芯粉1.5kg，MnSO₄·H₂O1g，MgSO₄·7H₂O 30g；培养基初始水分为65％，pH为7.0；称取步骤(1)中制备的B.subtilis PG-8固体菌剂0.5kg接种到发酵培养基中，混合均匀后，置于摇床中静息培养48h,发酵温度为20-40℃，发酵过程中每隔8h在翻转数次。

(3)、γ-PGA的提取与检测：提取得到的γ-PGA上清液液稀释25倍，进行HPLC检测，检测条件同实施例1中所述。

采用混合菌渣在野外堆肥固体发酵生产γ-PGA浓度可达到160g/kg。