具有良好水溶性和抗菌活性的壳聚糖季铵盐衍生物及其制备方法

摘要

本发明涉及五种具有良好水溶性和抗菌活性的壳聚糖季铵盐衍生物及其制备方法，属于壳聚糖抗菌材料及其制备方法技术领域。制备方法：N-甲基-N-长链烷基-N,N-二羟乙基卤化铵的单磺酸酯与氨基保护的N-苯亚甲基-壳聚糖反应，经过氨基去保护反应得到O-季铵盐-壳聚糖衍生物。本发明的五种壳聚糖季铵盐衍生物合成简单、取代度高、成本低、提纯方法简便、性质稳定，具有良好水溶性和抗菌活性，以及低的细胞毒性。本发明的五种壳聚糖季铵盐衍生物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等各种细菌和黑曲霉等各种真菌均具有较好的抗菌能力，很适合作为抗菌材料、药物载体、医用器械材料，具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及五种具有良好水溶性和抗菌活性的壳聚糖季铵盐衍生物及其制备方法，属于壳聚糖抗菌材料及其制备方法技术领域。

背景技术

壳聚糖(Chitosan，CS)是甲壳素N-脱乙酰基的产物，也是天然存在的唯一的碱性多糖，因提取方法不同相对分子量有数千到数百万不等，所以水溶性比较差 ^[1]。医药行业中，壳聚糖虽然用途广泛，但受其溶解性能差的限制，在应用上受到很大的影响，因此对壳聚糖进行化学结构修饰，改善其物理化学性能，特别是溶解性能非常重要。壳聚糖的结构修饰主要对分子结构中的氨基和羟基进行修饰，而对壳聚糖进行季氨化修饰是壳聚糖改性的主要手段。季氨化修饰的壳聚糖季铵盐不仅继承了壳聚糖良好的生物相容性、低毒性、可降解性等优点，而且还具有新的性能，如良好的水溶性、更强的静电吸附性和抑菌性能，使其在医药、纺织、水处理等领域有了广泛的应用^[2-4]。

目前，壳聚糖的季铵化改性主要在-NH₂^[5-10]上进行，在-OH^[11-13]上进行季铵化改性的报道较少。在壳聚糖的-NH₂上接上季氨化基团或将氨基直接季铵化，会使壳聚糖氨基失去聚阳离子性，导致壳聚糖的天然抑菌活性被屏蔽。如果只在-OH上进行季铵化改性，保留壳聚糖上的-NH₂，这样就会在壳聚糖分子中形成了氨基和季铵基双重抑菌活性中心，不仅增强了壳聚糖的水溶性，而且，能够提高壳聚糖衍生物的抑菌性能。据文献报道^[11-13]，在壳聚糖-OH上进行季铵化改性的方法 主要是采用环氧基季铵盐中间体与氨基保护的壳聚糖上的-OH反应，得到O-季氨化的壳聚糖衍生物，但是环氧基季铵盐中间体的理化性质不稳定，极易吸湿潮解、水解而失活，因此必须现制现用，其应用受到一定限制。另外，长链烷基季铵盐具有很强的抗菌性能，如十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基取代的双羟基季铵盐表现了比较强的抗细菌和抗真菌性能^[14-17]，但是其具有较强的细胞毒性，如果能将该类季铵盐连接到壳聚糖的-OH上，那么既能避免环氧基季铵盐现制现用的问题，又能降低长链烷基季铵盐的细胞毒性问题，而且又能保留壳聚糖的优良性能。该类壳聚糖季铵盐必将在抗菌材料、药物载体、医用器械材料领域展现其广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一是提供具有良好水溶性和抗菌活性的壳聚糖季铵盐衍生物；目的之二在于提供壳聚糖季铵盐的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

具有良好水溶性和抗菌活性的壳聚糖季铵盐衍生物，命名为O-(N-甲基-N-长链烷基-N,N-二羟乙基卤化铵)-壳聚糖，即QAS-CS，结构如下：

(1)式中R为芐基，X为氯时，具体化合物名称为O-(N-甲基-N-苄基-N,N-二羟乙基氯化铵)-壳聚糖，即BNQAS-CS；

(2)式中R为十二烷基，X为溴时，具体化合物名称为O-(N-甲基-N-十二烷基-N,N-二羟乙基溴化铵)-壳聚糖，即C12QAS-CS；

(3)式中R为十四烷基，X为溴时，具体化合物名称为O-(N-甲基-N-十四烷基-N,N-二羟乙基溴化铵)-壳聚糖，即C14QAS-CS；

(4)式中R为十六烷基，X为溴时，具体化合物名称为O-(N-甲基-N-十六烷基-N,N-二羟乙基溴化铵)-壳聚糖，即C16QAS-CS；

(5)式中R为十八烷基，X为溴时，具体化合物名称为O-(N-甲基-N-十八烷基-N,N-二羟乙基溴化铵)-壳聚糖，即C18QAS-CS。

本发明的五个具有良好水溶性和抗菌活性的壳聚糖季铵盐衍生物，其合成路线如下：

本发明的合成路线是采用N-甲基-N-长链烷基-N,N-二羟乙基卤化铵为原料，首先经磺酰化反应得到季铵盐的单磺酸酯中间体，然后与氨基保护的N-苯亚甲基-壳聚糖发生醚化反应，再经过氨基脱保护反应得到最终产物O-(N-甲基-N-长链烷基-N,N-二羟乙基卤化铵)-壳聚糖，即O-季铵盐-壳聚糖衍生物。

本发明具有良好水溶性和抗菌活性的壳聚糖季铵盐的制备方法如下：

(1)对甲基苯磺酸酯季铵盐的合成

季铵盐原料用适量氯仿溶解，加入少量催化剂和等摩尔量的缚酸剂，冰水浴 冷却，搅拌下将对甲基苯磺酰氯的氯仿溶液缓慢滴加到上述混合溶液中，在冰浴条件和室温条件反应一段时间，TLC跟踪反应完全，减压蒸除溶剂得到白色固体，即对甲基苯磺酸酯季铵盐，真空干燥后备用。

所述季铵盐原料分别采用N-甲基-N-苄基-N,N-二羟乙基氯化铵、N-甲基-N-十二烷基-N,N-二羟乙基溴化铵、N-甲基-N-十四烷基-N,N-二羟乙基溴化铵、N-甲基-N-十六烷基-N,N-二羟乙基溴化铵、N-甲基-N-十八烷基-N,N-二羟乙基溴化铵。

所述催化剂可以是4-二甲氨基吡啶或4-(N,N-二烯丙基氨基)吡啶。

所述缚酸剂一般是三乙胺、吡啶。

所述季铵盐原料、对甲基苯磺酰氯、三乙胺和4-二甲氨基吡啶的最佳摩尔量之比为2:1:1.5:0.03。

(2)O-季铵盐-苯亚甲基-壳聚糖的合成 

将N-苯亚甲基-壳聚糖溶于异丙醇中，加入40％NaOH溶液搅拌溶胀，然后将足量对甲基苯磺酸酯季铵盐加入到上述溶液中，升温至一定温度反应足够时间，冷却，加入无水乙醇沉淀，抽滤，用丙酮与乙醇混合溶液洗涤3次，真空干燥得土黄色固体O-季铵盐-苯亚甲基-壳聚糖。

所述足量对甲基苯磺酸酯季铵盐指对甲基苯磺酸酯季铵盐与所述N-苯亚甲基-壳聚糖的摩尔比大于等于1，一般情况下，所述对甲基苯磺酸酯季铵盐的用量是所述N-苯亚甲基-壳聚糖用量的6倍以上。

所述的一定温度反应足够时间指反应温度控制在70～85℃，反应时间控制在24～48小时。

所述丙酮可以用乙醚、氯仿或苯代替。

(3)O-季铵盐-壳聚糖的合成 

将O-季铵盐-苯亚甲基-壳聚糖溶于适量0.25mol/L的盐酸/乙醇溶液，室温下 搅拌反应24小时以上。抽滤，丙酮洗涤3次，干燥得粗品O-季铵盐-壳聚糖。

所述丙酮可以用乙醚、氯仿或苯代替。

(4)O-季铵盐-壳聚糖的精制 

将上述粗品悬于少量水中，放入透析袋中，用超纯水透析24小时，40℃真空干燥24小时得到精制的O-季铵盐-壳聚糖。

所述少量水是指尽量少的水，一般每克粗品悬于2～5mL水中。

本发明的壳聚糖季铵盐衍生物合成产率高，成本低，合成线路简便。

附图说明

图1：壳聚糖及壳聚糖季铵盐的核磁图谱；

图2：壳聚糖及壳聚糖季铵盐的红外光谱；

图3：壳聚糖和五种壳聚糖季铵盐随浓度变化的抑菌率(a：CS，b：BNQAS-CS，c：C12QAS-CS，d：C14QAS-CS，e：C16QAS-CS，f：C18QAS-CS)；

图4：在2500ppm浓度下，壳聚糖和五种壳聚糖季铵盐随时间变化的抗菌率(a：CS,b：BNQAS-CS,c：C12QAS-CS,d：C14QAS-CS,e：C16QAS-CS,f：C18QAS-CS)；

图5：壳聚糖和五种壳聚糖季铵盐随浓度、时间变化的抑菌率；(a)对黑曲霉的随浓度变化的抑菌率。(b)对黑曲霉的随时间变化的抑菌率。(c)对白色念珠菌的随浓度变化的抑菌率。(d)对白色念珠菌的随时间变化的抑菌率；

图6：(a-e)不同浓度下，C14QAS-CS对AT2细胞的细胞毒性[(a)空白，(b)20ppm，(c)100ppm，(d)500ppm，(e)2500ppm]，(f)壳聚糖和五种壳聚糖季铵盐的细胞毒性。

具体实施方式

以下给出本发明的具体实施方式，用来对本发明的构成作进一步的说明，但 并不认为本发明仅局限于下述的实施方式。

具有良好水溶性和抗菌活性的壳聚糖季铵盐，具体的制备方法如下：

(1)对甲基苯磺酸酯季铵盐的合成

季铵盐原料用适量氯仿溶解，加入少量4-二甲氨基吡啶，加入过量三乙胺，冰水浴冷却，然后将对甲基苯磺酰氯用适量的氯仿溶解后缓慢滴加到上述混合溶液中，其中季铵盐原料、对甲基苯磺酰氯、三乙胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔量之比为2:1:1.5:0.03。冰浴反应后室温搅拌至充分反应,TLC跟踪反应完全，减压蒸除氯仿得到白色固体，即对甲基苯磺酸酯季铵盐，真空干燥后备用。

(2)O-季铵盐-苯亚甲基-壳聚糖的合成 

将0.4g N-苯亚甲基-壳聚糖溶于20mL异丙醇中，加入2mL 40％NaOH溶液，搅拌溶胀0.5小时，然后将足量对甲基苯磺酸酯季铵盐加入到上述溶液中，升温至一定温度反应足够时间，冷却，加入100mL无水乙醇，抽滤，用丙酮：乙醇＝4:1的混合溶液洗涤3次，在40℃下真空干燥24小时得土黄色固体O-季铵盐-苯亚甲基-壳聚糖。

(3)O-季铵盐-壳聚糖的合成 

将0.4g O-季铵盐-苯亚甲基-壳聚糖溶于10mL 0.25mol/L的盐酸/乙醇溶液，室温下搅拌反应24小时。抽滤，丙酮洗涤3次，干燥得到粗品O-季铵盐-壳聚糖。

(4)O-季铵盐-壳聚糖的精制 

将上述O-季铵盐-壳聚糖粗品悬于少量水中，放入透析袋中，用超纯水透析24小时，40℃真空干燥24小时得到精制的O-季铵盐-壳聚糖。

通过红外光谱、核磁共振、元素分析等方法证明其结构的正确性及测定其取代度。

(1)合成反应温度，反应时间，产率，元素分析和取代度

表1 壳聚糖季铵盐合成的条件、元素分析和取代度

(2)¹H NMR分析

原料壳聚糖和五个壳聚糖季铵盐的¹H NMR采用重水为溶剂，在Bruker 400的仪器上进行测试。如图1所示，化学位移3.74～3.60、2.98、1.93ppm是壳聚糖上的质子峰。本发明的五个壳聚糖季铵盐上均包含上述质子峰，只是化学位移值稍有变化。在化学位移4.03、3.55ppm处分别对应乙醇胺上亚甲基(N-CH₂CH₂-O)的质子峰，化学位移3.15ppm对应N-CH₃的质子峰。另外，化学位移3.36、1.67、1.18、0.77ppm处的峰分别是长链烷基的质子峰。对于BNQAS-CS，化学位移7.45和4.55ppm分别是单取代苯基的质子峰。并且季铵盐部分的质子峰与文献中报道的BNQAS、C12QAS、C14QAS、C16QAS、C18QAS的质子峰基本符合[14]。然而，–OH和–NH₂基团上的质子峰在重水中没有出现，可能是因为在重水中该质子峰被D取代的结果。以上分析证明了本发明的壳聚糖季铵盐的结构的正确性，并且质子峰之间的比值能够与元素分析得到的取代度基本符合。

(3)红外光谱分析 

图2所示为原料壳聚糖和五个壳聚糖季铵盐的红外光谱，采用KBr压片，在Nicolet MAGNA-IR 550型红外光谱仪上测得。从图中能够看出，3500–3300cm^-1之间的宽峰是氨基和羟基的伸缩振动吸收峰。3000-2800cm^-1对应-CH₃和-CH₂-的伸缩振动峰，特别是长链烷基上-CH₃和-CH₂-的吸收峰。1635、1384cm^-1为 壳聚糖的特征吸收峰，1152、1086cm^-1是壳聚糖和壳聚糖季铵盐中C-O的伸缩振动峰。与壳聚糖相比，本发明中的五个壳聚糖季铵盐在1464、1410cm^-1出现新的吸收峰，是季铵基团的特征吸收峰。另外，本发明中壳聚糖季铵盐的长链中-CH₂-的吸收峰大约在722cm^-1，强度比较弱。BNQAS-CS在760和706cm^-1有单取代苯环的特征吸收峰，此吸收峰与文献中报道的苄基季铵盐中苯环的特征吸收峰基本一致[14]。

(4)溶解性

分别测试原料壳聚糖和五个壳聚糖季铵盐在水中及其有机溶剂中的溶解度，从表2能够看出，壳聚糖季铵盐的溶解度明显比原料壳聚糖有很大提高，特别是在水中的溶解度得到很大的改善，其中，常温下BNQAS-CS的溶解度能够达到5.6g/100g，这为后期的抗菌活性和实际应用提供了有利条件。

表2 原料壳聚糖和五个壳聚糖季铵盐在水中及有机溶剂中的溶解性(常温)

(5)抗菌性能测试：

季铵盐的抗菌性能的测试分为定性测试方法和定量测试方法

①定性测试方法—抑菌圈法

抑菌圈法是定性测试所合成的壳聚糖季铵盐的抗菌性能的方法。抗菌性能测定：将滤纸剪成圆片(直径5mm)，灭菌，干燥，备用；取0.1mL菌液置于固体培 养基上，用涂布器涂布均匀；然后用镊子将滤纸片小心地平铺在固体培养基上，分别在不同的滤纸片上加入等体积不同浓度的壳聚糖及壳聚糖季铵盐溶液(0、100ppm、500ppm、1000ppm、2500ppm)中；最后将培养皿翻转，使底向上，置于37℃的恒温培养箱中培养。24小时后计量滤纸片周围抑菌圈直径的大小，以此作为评价壳聚糖及壳聚糖季铵盐抑菌性能的依据。

表3 壳聚糖及其壳聚糖季铵盐的抑菌圈直径(直径单位：mm，浓度单位ppm)。

由表3可知，壳聚糖及其所合成的壳聚糖季铵盐衍生物BNQAS-CS、C12QAS-CS、C14QAS-CS、C16QAS-CS和C18QAS-CS浓度在100ppm、500ppm、1000ppm、2500ppm时，对金黄色葡萄球菌、甲型链球菌、乙型链球菌等革兰氏 阳性菌，大肠杆菌、绿脓杆菌和变形杆菌等革兰氏阴性菌，黑曲霉、白色念珠菌等真菌时，滤纸片周围出现直径不同的抑菌圈，说明壳聚糖及其这五种壳聚糖季铵盐对这些菌种具有一定的抗菌能力，且抗菌效果随着溶液浓度的增加而明显增大。其中，C12QAS-CS和C14QAS-CS对上述各种细菌和真菌的抗菌效果较好，明显高于壳聚糖及其其它衍生物。

②定量测试方法—振荡培养法

振荡培养法是定量测试季铵盐的抗菌性能的方法。抗菌性能测定：先在250mL三角瓶中加入50mL蒸馏水，高压蒸汽灭菌备用；再于上述三角瓶中，加入壳聚糖季铵盐及2mL金黄色葡萄球菌、甲型链球菌、乙型链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和变形杆菌等菌液，使壳聚糖季铵盐溶液的浓度分别为100ppm、500ppm、1000ppm、2500ppm，然后，空白样不加壳聚糖和壳聚糖季铵盐，其它步骤与待测样相同；最后将上述三角瓶固定于振荡摇床上，37℃恒温振荡一段时间后，取0.1mL三角瓶内的试样经两次稀释后再取0.1mL加入固体培养基，迅速轻轻摇动混匀，翻转培养皿，使底朝上，置37℃恒温箱内培养。18小时后观察菌落数(即剩余的活菌数量)，测出培养后待测样品的菌落数与空白样品的进行比较，计算抗菌率。

从图3中看出，壳聚糖季铵盐的抗菌活性随着浓度的升高不断增强。在2500ppm时，对照组壳聚糖的抑菌率均低于70％。与壳聚糖相比，本发明中的四种壳聚糖季铵盐(BNQAS-CS、C12QAS-CS、C14QAS-CS、C16QAS-CS)对不同的细菌和真菌表现出较好的抗菌活性，而C18QAS-CS的抗菌活性却较差。原因可能是C18QAS-CS中季铵盐的取代度较低和C18QAS单体本身的抗菌活性较低引起的。从上述的结果中得出，其抗菌活性与其烷基链的长度和季铵盐的取代度有很大关系。具有合适长度烷基链的和较高取代度的C12QAS-CS和C14QAS-CS 的抗菌活性明显高于有较长链和低取代度的C16QAS-CS和C18QAS-CS的抗菌活性。

如图4所示C12QAS-CS,C14QAS-CS和C16QAS-CS的抗菌率在短时间内(1-3小时)迅速提高，在4小时时抗菌率达到最高。而BNQAS-CS和C18QAS-CS的抗菌活性达到最大则需要大约5小时。这也说明C12QAS-CS,C14QAS-CS和C16QAS-CS比BNQAS-CS和C18QAS-CS具有较好的抗菌活性。

为验证五种壳聚糖季铵的抗真菌性能，我们选择黑曲霉、白色念珠菌用于本发明中。如图4所示，与壳聚糖相比，C12QAS-CS,C14QAS-CS和C16QAS-CS的抗真菌活性较好，在浓度100ppm时，抗菌率几乎能达到100％。而BNQAS-CS的抗菌活性较差，浓度达到500ppm时，抑菌率却只有70％。并且，它们随时间变化的抑菌率显示，在比较长的时间内(8-10小时)抗菌率达到最高。

为了研究本发明中壳聚糖季铵盐的细胞毒性，本发明中用CCK-8法检测了它们对大鼠肺上皮细胞(AT2)的细胞毒性[18]。壳聚糖及壳聚糖季铵盐溶解在20mM PBS缓冲液中(pH＝7.4)。AT2细胞用100μL CS和QAS-CS药物作用24小时，然后用CCK-8溶液(20μL,5mg/mL)作用4小时。最后在450nm处测试其吸光度，得到它们对细胞的毒性大小。如图6所示，不同浓度(20,100,500,2500ppm)下，不同药物对细胞的细胞毒性，如图6a-6e,C14QAS-CS对AT2的细胞成像显示，细胞毒性随着浓度的增大，其毒性也显著增加。图6f为壳聚糖和五种壳聚糖季铵盐的细胞毒性比较，C16QAS-CS和C18QAS-CS的半数致死量(IC₅₀)大约在100-500ppm之间，然而C12QAS-CS和C14QAS-CS的IC₅₀大于2500ppm，BNQAS-CS的IC₅₀是远远超过2500ppm。通过比较分析得到，BNQAS-CS,C12QAS-CS和C14QAS-CS的细胞毒性较小，其IC₅₀>500ppm。仅仅C16QAS-CS和C18QAS-CS对AT2细胞具有较大的细胞毒性。和季铵盐单体相 比^[14]，特别是在具有良好的抗菌活性的前提条件下，壳聚糖季铵盐的细胞毒性得到显著改善。这归因于壳聚糖季铵盐的本身的性质，如没有毒性和良好的生物相容性。

以上所述仅为本发明的优选实例，并不用于限制本发明。凡在本发明的基础之上的任何改动、修改、替换等，均应包含在本发明的保护范围内。

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