闭花木酮的O-(三唑基)乙基衍生物及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及闭花木酮Cleistanone衍生物、制备方法及其在制备抗肝纤维化药物上的用途。本发明合成了一个新的闭花木酮Cleistanone衍生物，并公开了其制备方法。药理学实验表明，本发明的闭花木酮Cleistanone衍生物具有抗肝纤维化的作用，具有开发抗肝纤维化药物的价值。

说明书

技术领域

本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及闭花木酮Cleistanone衍 生物、制备方法及其用途。

背景技术

肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的动态过程，表现为细胞外基质(ECM) 大量合成、分泌，而降解绝对或相对不足，使ECM在肝脏内弥漫沉积。其起始 于肝细胞(HC)坏死，随之是炎症反应、纤维生成介质释放，肝星状细胞(FSC) 激活，最终以肝脏结缔组织成分的合成与降解明显失去平衡。肝纤维化是多种慢 性肝病共同的病理过程，是影响预后的重要因素。

过去的20年间，肝纤维化的研究取得了长足进展，证实肝纤维化与一定程 度的肝硬化都是可逆的。近年来陆续出现了一些抗肝纤维化治疗方法，包括化学 药、生物制剂、中药与基因疗法等，但是理想的临床治疗手段仍然缺乏(刘平.加 强抗肝纤维化作用机制的研究.中华肝病杂志，2005,8(13)：561)。目前防治肝 纤维的关键是针对与肝星状细胞激活相关的环节，主要是：减轻肝损伤；抑制星 状细胞激活，减少细胞外基质产生；调节细胞因子紊乱，促进活化肝星状细胞凋 亡；抑制肝脏成纤维细胞的增殖以及星状细胞激活大量分泌诱导肝脏成纤维细胞 的增殖。

从天然产物中寻找化合物或先导化合物并进行结构修饰获得其衍生物，从而 得到高效低毒的潜在药物最有重要价值。

本发明涉及的化合物闭花木酮Cleistanone是一个2011年发表(Van Trinh Thi  Thanh et al.,2011.Cleistanone:A Triterpenoid from Cleistanthus indochinensis with a  New Carbon Skeleton.Volume 2011,Issue 22,pages 4108–4111,August 2011)的化 合物，我们对化合物闭花木酮Cleistanone进行了结构修饰，获得了一个新的闭 花木酮Cleistanone衍生物，并对其抗肝纤维化活性进行了评价，其具有抗肝纤 维化活性。

由于肝脏星状细胞的激活，从而引起了多种生长因子的大量分泌，这些生长 因子会诱导肝脏成纤维细胞的快速增殖，从而加速纤维化，其中最重要的生长因 子之一就是TGF。因此，筛选抗肝纤维化药物的一个重要思路就是筛选能够抑制 肝脏成纤维细胞增殖的药物或者筛选能够抑制TGF等生长因子诱导的成纤维细 胞的增殖，筛选常常在成纤维细胞上进行，NIH/3T3细胞是最常用的细胞株。

发明内容

本发明公开了一个闭花木酮Cleistanone衍生物，其结构为：

本发明闭花木酮Cleistanone衍生物(III)可通过下面方法制备：

(1)闭花木酮Cleistanone(I)与1,2-二溴乙烷反应得到闭花木酮Cleistanone 的O-溴乙基衍生物(II)；

(2)闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)与1,2,3-三氮唑发生取代 反应制得闭花木酮Cleistanone衍生物(III)。

进一步的闭花木酮Cleistanone衍生物(III)的制备方法为：

(1)将440mg化合物闭花木酮Cleistanone(I)溶于10mL苯，向溶液中加入 0.04g的四丁基溴化铵，3.760g的1,2-二溴乙烷和6mL的50％氢氧化钠溶液； 混合物在25摄氏度搅拌24h；24h之后将反应液倒入冰水中，立即用二氯甲烷 萃取两次，合并有机相溶液；然后对有机相溶液依次用水和饱和食盐水洗涤3 次，再用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩去除溶剂得到产物粗品；产物粗品用硅 胶柱层析纯化，流动相为：石油醚/丙酮＝100:1，v/v，收集黄色集中洗脱带即得 到闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)的黄色固体。

(2)将273mg的闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物溶于20mL乙腈当 中，向其中加入345mg的无水碳酸钾，84mg的碘化钾和2760mg的1,2,3-三氮 唑，混合物加热回流4h；反应结束后将反应液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃 取三次，合并有机相；依次用水和饱和食盐水洗涤合并之后的有机相，再用无水 硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产物粗品；产物粗品用硅胶柱层析纯化，流 动相为：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v，收集淡黄色集中洗脱带即得到闭花木酮 Cleistanone衍生物(III)的淡黄色胶状固体。

本发明公开的化合物可以制成药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。

药效学实验表明，本发明的闭花木酮Cleistanone衍生物(III)具有较好的抗 肝纤维化作用。本发明的药学上可接受的盐与其化合物具有同样的药效。

进一步的，化合物III的体外实验表明，化学物III具有很强的抗成纤维细胞 增殖的活性，因此本发明的化学物III有望被用于制备新型抗肝纤维化药物。

进一步的，化合物III的体外实验表明，化合物III具有很强的抗生长因子诱 导的成纤维细胞增殖的活性，化合物III是一个极具开发潜力的化合物,它可直接 用于相应疾病的治疗以及相关药物的制备。

以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具 体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。

具体实施方式

实施例1化合物闭花木酮Cleistanone的制备

化合物闭花木酮Cleistanone(I)的制备方法参照Van Trinh Thi Thanh等人发表 的文献(Van Trinh Thi Thanh et al.,2011.Cleistanone:A Triterpenoid from  Cleistanthus indochinensis with a New Carbon Skeleton.Volume 2011,Issue 22, pages 4108–4111,August 2011)的方法。

实施例2闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)的合成

将化合物I(440mg，1.00mmol)溶于10mL苯，向溶液中加入四丁基溴化 铵(TBAB)(0.04g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氢氧 化钠溶液。混合物在25摄氏度搅拌24h。24h之后将反应液倒入冰水中，立即 用二氯甲烷萃取两次，合并有机相溶液。然后对有机相溶液依次用水和饱和食盐 水洗涤3次，再用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩去除溶剂得到产物粗品。产物 粗品用硅胶柱层析纯化(流动相为：石油醚/丙酮＝100:1，v/v)，收集黄色集中洗 脱带即得到化合物II的黄色固体(344mg，63％)。

1H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ5.04(s,1H),4.82(s,1H),3.94(d,J＝26.5Hz, 1H),3.87(d,J＝26.5Hz,2H),3.57(s,2H),2.40(d,J＝14.0Hz,1H),2.39(d,J＝ 14.0Hz,1H),2.27(s,1H),2.21(s,1H),2.15(s,1H),1.82(s,1H),1.62(s,2H),1.57 (d,J＝3.3Hz,1H),1.54(d,J＝3.3Hz,1H),1.50(d,J＝1.2Hz,1H),1.47(d,J＝1.2 Hz,1H),1.39(d,J＝15.3Hz,2H),1.34(d,J＝15.3Hz,1H),1.26(dd,J＝32.6,13.7 Hz,4H),1.13(d,J＝18.0Hz,2H),1.05(s,6H),0.98(s,1H),0.88(s,12H),0.78(s, 3H),0.74(s,1H)。

13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ216.59(s),154.50(s),105.23(s),74.63(s), 69.85(s),59.71(s),52.55(s),51.21(s),47.92(s),44.10(s),42.25(s),41.73(s), 40.64(s),40.16(s),38.88(s),38.65(s),37.21(s),36.23(s),33.34(d,J＝1.1Hz), 32.96(s),29.91(s),27.18(s),26.03(s),24.23(s),23.96(s),20.77(s),18.48(s), 17.98(s),16.93(s)。

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for C₃₂H₅₂BrO₂:547.3151；found 547.3159.

实施例3闭花木酮Cleistanone的闭花木酮的O-(三唑基)乙基衍生物衍生物 (III)的合成

将化合物II(273mg，0.5mmol)溶于20mL乙腈当中，向其中加入无水碳 酸钾(345mg，2.5mmol)，碘化钾(84mg，0.5mmol)和1,2,3-三氮唑(2760mg， 40mmol)，混合物加热回流4h。反应结束后将反应液倒入冰水中，用等量二氯 甲烷萃取三次，合并有机相。依次用水和饱和食盐水洗涤合并之后的有机相，再 用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯 化(流动相为：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v)，收集淡黄色集中洗脱带即得到化合 物III的淡黄色胶状固体(184.6mg,67％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.05(d,J＝5.7Hz,2H),4.63(s,1H),4.53(s,1H), 4.47(s,1H),4.26(s,1H),4.19(s,1H),3.91(s,2H),2.69(s,1H),2.37(s,1H),2.26(d, J＝13.4Hz,2H),2.20(s,1H),1.89(s,2H),1.81(s,1H),1.64(d,J＝3.5Hz,3H), 1.56(s,1H),1.54–1.39(m,3H),1.39–1.35(m,2H),1.30(d,J＝14.4Hz,2H),1.23 (d,J＝9.3Hz,2H),1.04(s,6H),0.96(d,J＝1.9Hz,13H),0.86(s,3H),0.78(s,1H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ216.58(s),154.48(s),136.30(s),120.62(s), 105.20(s),74.64(s),65.63(s),59.74(s),52.54(s),51.19(s),47.89(s),46.70(s), 44.11(s),42.27(s),41.76(s),40.63(s),40.14(s),38.85(s),38.66(s),37.23(s), 36.26(s),33.33(s),32.94(s),29.88(s),27.19(s),26.05(s),24.26(s),23.95(s), 20.75(s),18.45(s),17.99(s),16.95(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₃₄H₅₄N₃O₂:536.4216；found:536.4223。

实施例4化合物III抗肝纤维化活性

由于肝脏星状细胞的激活，从而引起了多种生长因子的大量分泌，这些生长 因子会诱导肝脏成纤维细胞的快速增殖，从而加速纤维化，其中最重要的生长因 子之一就是TGF。因此，筛选抗肝纤维化药物的一个重要思路就是筛选能够抑制 肝脏成纤维细胞增殖的药物或者筛选能够抑制TGF等生长因子诱导的成纤维细 胞的增殖，筛选常常在成纤维细胞上进行，NIH/3T3细胞是最常用的细胞株。

实验例1：化合物III对成纤维细胞NIH/3T3增殖的抑制作用

一、实验方法：

NIH/3T3细胞株购自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院 上海细胞所细胞库。

将对数生长期的亚融合的NIH/3T3细胞用0.25％胰酶消化，洗涤，离心后， 用DMEM培养液(含10％FCS)制成1×10⁴cell/ml的细胞悬液，台盼蓝染色鉴定 存活率大于95％，按每孔100ul加入96孔板中，在37℃、5％CO₂培养24h同步 处理后，弃上清，加入含有药物的DMEM培养液(含10％FCS)200ul，培养48h， 每孔加入MTT溶液孵育4h。弃去培养液，加入150ulDMSO，振荡10分钟，使 结晶溶解，酶标仪490nm处读取OD值，结果以OD₄₉₀表示。

二、实验结果：

1、形态学观察

NIH/3T3在用药前伸展良好，折光性较弱，有方向性，呈放射状，细胞增殖 的速度快；而加药物24h后，成纤维细胞数目减少，形状变得不规则，突起变短， 细胞排列混乱，细胞内代谢产物增多。

MTT法检测化合物III对NIH/3T3细胞增殖的抑制作用。

表1：MTT法检测化合物III对NIH/3T3增殖的抑制作用

注：*，与细胞阴性对照P<0.05；**，与细胞阴性对照P<0.01

结果：化合物III在20ug/ml对成纤维细胞NIH/3T3的细胞增殖有显著的抑 制作用。表明化合物III体外对成纤维细胞的增殖有显著抑制作用。

实验例2：化合物III对转化生长因子-β₁(TGF-β₁)诱导的成纤维细胞增殖 的抑制作用

TGF-β₁是促进细胞增殖和胶原生成的强活性因子，在细胞中加入TGF-β ₁10ng/ml刺激细胞增殖，再检测药物对TGF-β1诱导的细胞增殖的抑制作用，以 分析判断化合物III的作用机理。

表2：MTT法检测化合物III对TGF诱导NIH/3T3增殖的抑制作用

注：*，与细胞+TGF对照P<0.05；**，与细胞+TGF对照P<0.01

结果：化合物III在20ug/ml对成纤维细胞NIH/3T3在TGF-β₁的诱导下的细 胞增殖有显著的抑制作用。表明化合物III体外对纤维细胞增殖的抑制作用可能 是通过干预TGF信号通路实现的。

结论：化合物III对成纤维细胞NIH/3T3在10％小牛血清的刺激下的细胞增 殖有显著的抑制作用；化合物III对成纤维细胞NIH/3T3在TGF-β₁的诱导下的细 胞增殖有显著的抑制作用。化合物III可以用来制备抗肝纤维化药物。

实施例5本发明所涉及化合物III片剂的制备

取20克化合物III或者其药学上可接受的盐当中的一种，加入制备片剂的常 规辅料180克，混匀，常规压片机制成1000片。

实施例6本发明所涉及化合物III胶囊的制备

取20克化合物III或者其药学上可接受的盐当中的一种，加入制备胶囊剂的 常规辅料如淀粉180克，混匀，装胶囊制成1000粒。