一种裸花紫珠中黄酮类成分的分析鉴定方法

摘要

本发明涉及一种裸花紫珠中黄酮类成分的分析鉴定方法。本发明采用液质联用法分析鉴定裸花紫珠中的黄酮类成分，建立了一种快速分析鉴定裸花紫珠中各种黄酮类成分的方法，为裸花紫珠制剂的质量控制提供可行依据。

说明书

技术领域

本发明涉及中药领域，具体涉及一种快速分析鉴定裸花紫珠中各种黄酮类成分的方法， 为裸花紫珠制剂的质量控制提供可行依据。

背景技术

裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.)为马鞭草科(Verbenaceae)紫珠属植物，主要产 于广东、海南、广西等地。具有止血、祛瘀、止痛之功效，主要用于肺咯血、胃肠出血、鼻 衄、牙龈出血、外伤出血、跌打损伤、风湿肿痛等。裸花紫珠的主要成分为黄酮、鞣质类。 目前主要通过紫外分光光度法测定总黄酮的含量，但该方法非常有限，不够全面；现有的对 裸花紫珠化学成分研究中，也没有单独对黄酮类成分的分析鉴定研究。液质联用技术 （HPLC-MS)是目前广泛应用的分析方法之一，它利用液相色谱的高效分离能力对被分析样 品进行分离。再以质谱为检测器在线提供化合物的分子量信息，特别是电喷雾（ESI）软电离 质谱技术的出现，为研究热不稳定和极性较大的化合物提供了简捷快速的分析方法，而多级 串联质谱技术还可以提供被分析成分的结构信息。本发明利用液质联用技术（HPLC-ESI-MS） 对裸花紫珠药材中的黄酮类成分进行分离及结构鉴定，有利于进一步提高裸花紫珠药材以及 裸花紫珠制剂的质量控制标准。

发明内容

本发明的目的是建立一种有效的裸花紫珠中黄酮类成分的分析鉴定方法。

本发明所述的裸花紫珠中黄酮类成分的分析鉴定方法包括下列步骤：

（一）样品制备

取裸花紫珠药材，加水浸泡0.5～2h，煮提1～2h，过滤，药渣再加水煮提1～2h，合并两次 滤液，减压浓缩至相对密度1.1～1.3（60℃）；准确称取2～2.5g于离心管中，加入甲醇5～10ml， 混匀，超声提取0.5～2h后离心，转速为8000～10000rad/min，取上清液加入2～2.5g聚酰胺粉， 水浴挥干；将挥干的聚酰胺粉置于砂芯漏斗，纯水洗涤2～4次，每次5～20ml，再用20～30%% 甲醇洗涤2～3次，每次5～20ml，弃去洗涤液，用70～80%甲醇分3次洗脱，前两次加入甲醇 8～10ml，第三次加入甲醇3～5ml，洗脱液加入70%甲醇定容至25ml，摇匀过膜上机分析；

（二）仪器条件

（1）液相色谱条件

ThermoFisher Hypersil Gold C₁₈色谱柱（3μm，2.1x150mm）；流动相为甲醇和0.1%的甲 酸水溶液，梯度洗脱（0～2min，甲醇75％；2～47min，甲醇75％→45％；47～52min，甲醇45 ％→10％；52～57min，甲醇10％；57～58min，甲醇10％→75％；58～70min，甲醇75％）；流 速：0.2ml/min；柱温：30°C；进样体积：5μl。

（2）质谱条件

（I）全扫描电喷雾电离（ESI），正/负离子方式，扫描范围200－1500M，扫描时间1s， 分辨率Q1=0.7FWHM,喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛细管加热温度350℃，辅 助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压0V。

（II）二级质谱扫描电喷雾电离（ESI），正/负离子方式，扫描时间0.5s，分辨率 Q1=0.7FWHM,Q3=0.7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛细管加热温度 350℃，辅助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压0V，碰撞气（Ar） 压力1.5mTorr，碰撞能量15/30eV。

（III）三级质谱扫描电喷雾电离（ESI），正/负离子方式，扫描时间0.5s，分辨率 Q1=0.7FWHM,Q3=0.7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛细管加热温度 350℃，辅助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压30V，碰撞气（Ar） 压力1.5mTorr，碰撞能量15/30eV。

（IV）中性丢失扫描电喷雾电离（ESI），负离子方式，扫描范围350－1500M，扫描时 间0.6s，分辨率Q1=0.7FWHM,Q3=0.7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛 细管加热温度350℃，辅助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压0V， 碰撞气（Ar）压力1.5mTorr，碰撞能量15/30eV，中性丢失基团分子量132、146、162、176、 308。

步骤（一）样品制备可优选为：

取裸花紫珠药材，加15倍量水浸泡30min，煮提2h，过滤，药渣再加15倍量水煮提2h， 合并两次滤液，减压浓缩至相对密度1.2（60℃）；准确称取2g于离心管中，加入甲醇7ml， 混匀2min，超声提取30min后离心5min，转速10000rad/min，取上清液加入2g聚酰胺粉， 水浴挥干；将挥干的聚酰胺粉置于G3砂芯漏斗，纯水洗涤4次，每次10ml，再用20%甲醇 洗涤2次，每次10ml，弃去洗涤液，用70%甲醇分3次洗脱，前两次加入甲醇10ml，第三 次加入甲醇5ml，洗脱液加入70%甲醇定容至25ml，摇匀过膜上机分析。

按实施例1所得制备液按实施例1的液相色谱条件和质谱条件进行全扫描分析得到其总离 子流图（见附图1），参照NCBI和文献报道黄酮类化合物的分子量，确定其分子离子，然后从 总离子流图中提取该化合物的分子离子，若存在，并对其进行二级、三级和中性丢失分析， 确认其结构。通过化合物的一级质谱、二级质谱、三级质谱图及中性丢失基团与文献的比对， 鉴定出31种黄酮类成分，见表1。

表1裸花紫珠叶黄酮类组分鉴定情况

发明人利用液质联用技术（HPLC-ESI-MS）对裸花紫珠药材中的黄酮类成分进行分离及 结构鉴定，共发现黄酮类化合物31种，它们大多为木犀草素、芹菜素、异鼠李素、山奈素、 矢车菊素、柚皮素和糖基结合形成的苷类化合物和部分苷元。

目前，裸花紫珠的含量测定主要有总黄酮、总糖、酚酸类，毛蕊花糖苷、齐墩果酸、熊 果酸、木犀草素、芦丁、槲皮素、阿亚黄素。然而中药特有的多成分、多靶点作用模式决定 其药效并非是某几个“指标成分”或“主要成分”在起作用，而是多种成分共同作用的结果。 本发明通过利用液质联用技术（HPLC-ESI-MS），筛选出合适的样品制备条件和质谱条件，对 裸花紫珠药材中的黄酮类成分进行分离及结构鉴定，建立了裸花紫珠提取物的多维指纹图谱， 可同时得到各个成分的保留时间、一级质谱图(各个成分的相对分子质量)和二级质谱图(某成 分的特征碎片)，同时检测裸花紫珠中31种黄酮类成分。与裸花紫珠现有的分析鉴定方法相比， 具有以下优势：（1）不仅可以快速鉴定裸花紫珠中的已知化学成分，而且能快速鉴定未知化 学成分，解决传统成分分离技术手段费时、成本高、微量成分难以分离获知的缺点，避免已 知化合物的重复工作；（2）克服现有含量测定方法仅以单个成分或几个成分作为质控标准， 不能全面反映裸花紫珠质量的缺点，建立全面考察裸花紫珠31种黄酮类成分的分析鉴定方法， 有效判断裸花紫珠药材及制剂真伪，保证产品质量。

附图说明

图1为裸花紫珠黄酮制备液总离子流色谱图。

具体实施方式

实施例一

（一）样品制备

取裸花紫珠药材1kg，加15倍量水浸泡30min，煮提2h，过滤，药渣再加15倍量水煮 提2h，合并两次滤液，减压浓缩至相对密度1.2（60℃）；准确称取2g于离心管中，加入甲 醇7ml，混匀2min，超声提取30min后离心5min，转速10000rad/min，取上清液加入2g聚 酰胺粉，水浴挥干；将挥干的聚酰胺粉置于G3砂芯漏斗，纯水洗涤4次，每次10ml，再用 20%甲醇洗涤2次，每次10ml，弃去洗涤液，用70%甲醇分3次洗脱，前两次加入甲醇10ml， 第三次加入甲醇5ml，洗脱液加入70%甲醇定容至25ml，摇匀过膜上机分析。

（二）仪器条件

（1）液相色谱条件

ThermoFisher Hypersil Gold C₁₈色谱柱（3μm，2.1x150mm）；流动相为甲醇和0.1%的甲 酸水溶液，梯度洗脱（0～2min，甲醇75％；2～47min，甲醇75％→45％；47～52min，甲醇45 ％→10％；52～57min，甲醇10％；57～58min，甲醇10％→75％；58～70min，甲醇75％）；流 速：0.2ml/min；柱温：30°C；进样体积：5μl。

（2）质谱条件

（I）全扫描电喷雾电离（ESI），正/负离子方式，扫描范围200－1500M，扫描时间1s， 分辨率Q1=0.7FWHM,喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛细管加热温度350℃，辅 助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压0V。

（II）二级质谱扫描电喷雾电离（ESI），正/负离子方式，扫描时间0.5s，分辨率 Q1=0.7FWHM,Q3=0.7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛细管加热温度 350℃，辅助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压0V，碰撞气（Ar） 压力1.5mTorr，碰撞能量15/30eV。

（III）三级质谱扫描电喷雾电离（ESI），正/负离子方式，扫描时间0.5s，分辨率 Q1=0.7FWHM,Q3=0.7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛细管加热温度 350℃，辅助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压30V，碰撞气（Ar） 压力1.5mTorr，碰撞能量15/30eV。

（IV）中性丢失扫描电喷雾电离（ESI），负离子方式，扫描范围350－1500M，扫描时 间0.6s，分辨率Q1=0.7FWHM,Q3=0.7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛 细管加热温度350℃，辅助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压0V， 碰撞气（Ar）压力1.5mTorr，碰撞能量15/30eV，中性丢失基团分子量132、146、162、176、 308。

实施例二

（一）样品制备

取裸花紫珠药材1kg，加15倍量水浸泡1h，煮提1h，过滤，药渣再加15倍量水煮提1h， 合并两次滤液，减压浓缩至相对密度1.1（60℃）；准确称取2.5g于离心管中，加入甲醇10ml， 混匀2min，超声提取2h后离心5min，转速8000rad/min，取上清液加入2.5g聚酰胺粉，水 浴挥干；将挥干的聚酰胺粉置于G3砂芯漏斗，纯水洗涤2次，每次5ml，再用20%甲醇洗涤 3次，每次5ml，弃去洗涤液，用70%甲醇分3次洗脱，前两次加入甲醇8ml，第三次加入甲 醇5ml，洗脱液加入70%甲醇定容至25ml，摇匀过膜上机分析。

（二）仪器条件

（1）液相色谱条件

ThermoFisher Hypersil Gold C₁₈色谱柱（3μm，2.1x150mm）；流动相为甲醇和0.1%的甲 酸水溶液，梯度洗脱（0～2min，甲醇75％；2～47min，甲醇75％→45％；47～52min，甲醇45 ％→10％；52～57min，甲醇10％；57～58min，甲醇10％→75％；58～70min，甲醇75％）；流 速：0.2ml/min；柱温：30°C；进样体积：5μl。

（2）质谱条件

（I）全扫描电喷雾电离（ESI），正/负离子方式，扫描范围200－1500M，扫描时间1s， 分辨率Q1=0.7FWHM,喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛细管加热温度350℃，辅 助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压0V。

（II）二级质谱扫描电喷雾电离（ESI），正/负离子方式，扫描时间0.5s，分辨率 Q1=0.7FWHM,Q3=0.7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛细管加热温度 350℃，辅助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压0V，碰撞气（Ar） 压力1.5mTorr，碰撞能量15/30eV。

（III）三级质谱扫描电喷雾电离（ESI），正/负离子方式，扫描时间0.5s，分辨率 Q1=0.7FWHM,Q3=0.7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛细管加热温度 350℃，辅助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压30V，碰撞气（Ar） 压力1.5mTorr，碰撞能量15/30eV。

（IV）中性丢失扫描电喷雾电离（ESI），负离子方式，扫描范围350－1500M，扫描时 间0.6s，分辨率Q1=0.7FWHM,Q3=0.7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛 细管加热温度350℃，辅助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压0V， 碰撞气（Ar）压力1.5mTorr，碰撞能量15/30eV，中性丢失基团分子量132、146、162、176、 308。

实施例三

（一）样品制备

取裸花紫珠药材1kg，加15倍量水浸泡2h，煮提2h，过滤，药渣再加15倍量水煮提2h， 合并两次滤液，减压浓缩至相对密度1.3（60℃）；准确称取2g于离心管中，加入甲醇10ml， 混匀2min，超声提取2h后离心5min，转速10000rad/min，取上清液加入2g聚酰胺粉，水浴 挥干；将挥干的聚酰胺粉置于G3砂芯漏斗，纯水洗涤4次，每次20ml，再用30%甲醇洗涤 2次，每次20ml，弃去洗涤液，用70%甲醇分3次洗脱，前两次加入甲醇10ml，第三次加入 甲醇3ml，洗脱液加入70%甲醇定容至25ml，摇匀过膜上机分析。

（二）仪器条件

（1）液相色谱条件

ThermoFisher Hypersil Gold C₁₈色谱柱（3μm，2.1x150mm）；流动相为甲醇和0.1%的甲 酸水溶液，梯度洗脱（0～2min，甲醇75％；2～47min，甲醇75％→45％；47～52min，甲醇45 ％→10％；52～57min，甲醇10％；57～58min，甲醇10％→75％；58～70min，甲醇75％）；流 速：0.2ml/min；柱温：30°C；进样体积：5μl。

（2）质谱条件

（I）全扫描电喷雾电离（ESI），正/负离子方式，扫描范围200－1500M，扫描时间1s， 分辨率Q1=0.7FWHM,喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛细管加热温度350℃，辅 助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压0V。

（II）二级质谱扫描电喷雾电离（ESI），正/负离子方式，扫描时间0.5s，分辨率 Q1=0.7FWHM,Q3=0.7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛细管加热温度 350℃，辅助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压0V，碰撞气（Ar） 压力1.5mTorr，碰撞能量15/30eV。

（III）三级质谱扫描电喷雾电离（ESI），正/负离子方式，扫描时间0.5s，分辨率 Q1=0.7FWHM,Q3=0.7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛细管加热温度 350℃，辅助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压30V，碰撞气（Ar） 压力1.5mTorr，碰撞能量15/30eV。

（IV）中性丢失扫描电喷雾电离（ESI），负离子方式，扫描范围350－1500M，扫描时 间0.6s，分辨率Q1=0.7FWHM,Q3=0.7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气(N₂)压力25psi，毛 细管加热温度350℃，辅助气（N₂）压力2u，离子吹扫气（N₂）压力0u，源内CID电压0V， 碰撞气（Ar）压力1.5mTorr，碰撞能量15/30eV，中性丢失基团分子量132、146、162、176、 308。