拟黑多刺蚁中棕榈酸和油酸含量的测定方法

摘要

本发明涉及一种拟黑多刺蚁中棕榈酸和油酸含量的测定方法，其特征在于：将棕榈酸和油酸与甲醇在碱催化甲酯化后，采用气相色谱法，以色谱柱为Rtx

说明书

技术领域

 本发明涉及药用昆虫中特定成分含量的测定方法，特别是一种拟黑多刺蚁中棕榈酸和油酸含量的测定方法。

背景技术

拟黑多刺蚁(Poryrhaehis vicina Roger) 为药用昆虫拟黑多刺蚁的干燥虫体。收载于《中华本草》、《中药大辞典》等，产于广西，云南等地。其性平、微温、味咸酸、微腥。拟黑多刺蚁富含锌、硒、锰、铜、铁等量元素B1、B2、B6、A、E以及28种人体必须的氨基酸，具有补益肝肾、调理奇经、行气和血、消肿止痛、抗风湿、镇静、消炎、降脂、降糖、抗疲劳、解痛镇静、改善睡眠的功能及抑制肿瘤等药理作用，能改善全身营养状况，强身益寿。

研究表明，拟黑多刺蚁有降低痛风模型血清尿酸水平及抗炎作用，而拟黑多刺蚁脂溶性成分为其降低高尿酸血症模型小鼠血清尿酸水平的成分。拟黑多刺蚁中脂溶性成分中的主要成分为棕榈酸及油酸，棕榈酸和油酸均为长链脂肪酸，挥发性较差，若直接采用气相色谱法法对其进行含量测定，则有可能气化不完全，导致测量出现偏差。

目前，尚无拟黑多刺蚁中棕榈酸和油酸含量测定等方面的研究内容报道。为了促进拟黑多刺蚁的深入开发与利用，急需研发一种灵敏度高、重现性好的拟黑多刺蚁中棕榈酸和油酸含量的测定方法，为拟黑多刺蚁质量标准提供了研究基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便，准确度高，重复性好的拟黑多刺蚁中棕榈酸和油酸含量的测定方法。

本发明是这样实现的：

一种拟黑多刺蚁中棕榈酸和油酸含量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）内标储备液的制备：

取正十八烷250mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，加60～90℃石油醚溶解并稀释至100ml，即得内标储备液。

（2）对照品溶液的制备：

A）精密称取对照品棕榈酸甲酯100mg、油酸甲酯100mg，置于同一25ml容量瓶中，用60～90℃石油醚溶解并稀释至25ml，摇匀，即得对照品储备液。

B）精密量取对照品储备液2ml，置于25ml容量瓶中，用60～90℃石油醚溶解并稀释至25ml，摇匀，即得对照品溶液。

（3）供试品溶液的制备：

C）取拟黑多刺蚁样品适量，研碎，精密称取样品1g，置于100ml塞锥形瓶中，加入60～90℃石油醚10ml，摇匀，置于90℃水浴中回流60min，然后放置冷却。

D）用60～90℃石油醚补足水浴回流中减失的重量，然后滤过，取2ml滤液至容量为10ml具塞试管中，加入含有1mol/L氢氧化钾的甲醇溶液2ml，在50℃水浴中震荡加热15min，取出冷却，加入超纯水3ml，然后将滤液放入离心机进行离心，取上清液，即得供试品储备液；

E）精密量取内标储备液、供试品储备液各0.5ml置于同一5ml容量瓶中，加60～90℃石油醚稀释至5ml，摇匀，即得供试品溶液。

（4）用气相色谱仪、检测器及色谱检测软件配套使用，精密吸取1μL供试品溶液和对照品溶液分别注入气相色谱仪中，测定棕榈酸和油酸的色谱分析图，即得拟黑多刺蚁中棕榈酸和油酸的含量。

（5）设定色谱测定条件为：色谱柱为Rtx^R-5毛细管色谱柱，色谱柱规格为30m×0.32mm×0.25μm；柱温采用程序升温方式，以15oC/min的方式从80℃升温到220℃后保持5分钟；柱流量为2.0 ml/min；载气为高纯氦气；进样口温度230 °C；进样量1μL，分流比10:1。

F）线性关系的测定：精密吸取对照品储备液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml于10ml容量瓶中，加入内标储备液1.0ml，用石油醚稀释至10ml，摇匀；按步骤（5）的色谱条件下测定，以对照品与内标物的峰面积比（A_对照品 /A_内标）为纵坐标，以对照品与内标物浓度比（C_对照品/C_内标）为横坐标，绘制标准曲线；棕榈酸甲酯的回归方程为Y=0.9808X-0.1563 (γ=0.9994）；油酸甲酯的回归方程为Y=1.1033X＋0.1467（γ=0.9994）。结果显示，棕榈酸甲酯、油酸甲酯分别在0.0399~1.597μg、0.0394～1.576μg范围内线性良好。

G）精密度的测定：取同一批适量供试品溶液，精密吸取供试品溶液1μL，按步骤（5）的色谱条件连续进样6次，测定各种成分的峰面积，计算对照品与内标物的峰面积比（A_对照品/A_内标），测得A_棕榈酸酯/A_正十八烷 的RSD=1.7% ；A_油酸甲酯/A_正十八烷的RSD=0.17%，表明仪器精密度良好。

H）稳定性的测定：取同一批适量供试品溶液，按步骤（5）的色谱条件于0、2、4、8、24h分别测定各种成分的峰面积；结果显示，棕榈酸甲酯、油酸甲酯的峰面积RSD分别为0.26%、0.22%，表明供试品溶液在24h内基本稳定。

I）重复性的测定：取同一批拟黑多刺蚁样品适量，按步骤（3）平行制备6份供试品溶液，分别吸取1μl，在步骤（5）的色谱条件下进样测定各种成分的峰面积，计算棕榈酸甲酯及油酸甲酯的平均含量、相对标准偏差（RSD）；结果表明棕榈酸甲酯平均含量为22.0 mg/g；油酸甲酯平均含量为51.3mg/g，RSD分别为2.9%、2.9%，表明该方法重现性良好。

J）加样回收的测定：精密量取浓度为3.887mg/ml的棕榈酸甲酯对照品储备液3ml和浓度为3.869mg/ml的油酸甲酯对照品储备液7ml，置于水浴上挥干溶剂，平行制备6份，然后在每1份中加入棕榈酸甲酯含量为22.0 mg/g及油酸甲酯含量为51.3mg/g的样品0.5g，然后按步骤（3）制备供试品溶液，在步骤（5）的色谱条件下测定各种成分的峰面积，计算回收率。结果见表1、表2。

表1棕榈酸甲酯加样回收率试验结果（n=6）

表2油酸甲酯加样回收率试验结果（n=6）

以上所述的气相色谱仪为日本岛津有限公司生产的GC2010PLUS气相色谱仪。

以上所述的检测器为FID检测器。

以上所述的正十八烷的纯度为98%。

本发明的有益效果是：

1、由于本发明采用GC2010PLUS气相色谱仪、FID检测器及色谱检测软件配套使用，分别对对照品溶液及供试品溶液在本发明色谱条件下进行测定棕榈酸和油酸的色谱分析图，并通过对棕榈酸和油酸的峰面积响应值的线性关系、精密度、稳定性、重复性及加样回收率等方面的测定，从而掌握拟黑多刺蚁中棕榈酸和油酸含量的测定方法。本测定方法操作简单、准确度高、重复性好，值得在拟黑多刺蚁棕榈酸和油酸含量测定方面推广应用。

2、本发明测定方法将棕榈酸和油酸进行甲酯化，降低其沸点，使棕榈酸和油酸在气相色谱仪测定过程中能气化充分，从而保证本发明的测定方法具有良好的准确度和重复性。

附图说明

图1是对照品中棕榈酸和油酸的色谱分析图。

图2是横县拟黑多刺蚁样品中棕榈酸和油酸的色谱分析图。

图3是灵山拟黑多刺蚁样品中棕榈酸和油酸的色谱分析图。

图4是上林拟黑多刺蚁样品中棕榈酸和油酸的色谱分析图。

图5是都安拟黑多刺蚁样品中棕榈酸和油酸的色谱分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

拟黑多刺蚁中棕榈酸和油酸含量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）内标储备液的制备：

取正十八烷250mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，加60～90℃石油醚溶解并稀释至100ml，即得内标储备液；

（2）对照品溶液的制备：

A）精密称取对照品棕榈酸甲酯100mg、油酸甲酯100mg，置于同一25ml容量瓶中，用60～90℃石油醚溶解并稀释至25ml，摇匀，即得对照品储备液；

B）精密量取对照品储备液2ml，置于25ml容量瓶中，用60～90℃石油醚溶解并稀释至25ml，摇匀，即得对照品溶液；

（3）供试品溶液的制备：

C）分别取横县、灵山、上林、都安等地的拟黑多刺蚁样品适量，研碎，精密称取各地样品1g，分别置于100ml塞锥形瓶中，加入60～90℃石油醚10ml，摇匀，置于90℃水浴中回流60min，然后放置冷却；

D）用60～90℃石油醚补足水浴回流中减失的重量，然后滤过，取2ml滤液至容量为10ml具塞试管中，加入含有1mol/L氢氧化钾的甲醇溶液2ml，在50℃水浴中震荡加热15min，取出冷却，加入超纯水3ml，然后将滤液放入离心机进行离心，取上清液，即得供试品储备液；

E）精密量取内标储备液、供试品储备液各0.5ml置于同一5ml容量瓶中，加60～90℃石油醚稀释至5ml，摇匀，即得供试品溶液；

（4）用气相色谱仪、FID检测器及色谱检测软件配套使用，精密吸取1μL供试品溶液和对照品分别溶液注入气相色谱仪中，测定各地拟黑多刺蚁样品中棕榈酸和油酸的色谱分析图，即得拟黑多刺蚁中棕榈酸和油酸的含量；

（5）设定色谱测定条件为：色谱柱为Rtx^R-5毛细管色谱柱，色谱柱规格为30m×0.32mm×0.25μm；柱温采用程序升温方式，以15oC/min的方式从80℃升温到220℃后保持5分钟；柱流量为2.0 ml/min；载气为高纯氦气；进样口温度230 °C；进样量1μL，分流比10:1。

计算各地拟黑多刺蚁样品中棕榈酸甲酯和油酸甲酯的含量，并根据分子量换算得到样品中所含的棕榈酸及油酸的含量，结果见表3。

换算公式如下：棕榈酸含量= W₁ × M₃ / M₁ ； 油酸含量 = W₂ × M₄ / M₂

W₁：棕榈酸甲酯含量；W₂：油酸甲酯含量；M₁：棕榈酸甲酯分子量（270.45）； M₂：油酸甲酯分子量（296.50）；M₃：棕榈酸分子量（256.42）；M₄ ：油酸分子量（280.44）。  

表3 不同产地拟黑多刺蚁中棕榈酸和油酸的含量

序号产地采收时间棕榈酸含量 （mg/g，n=2）油酸含量（mg/g，n=2）1横县2014091022.051.302灵山2014102022.6653.753上林2014102521.6150.364都安2014102822.2352.48