一种测定药用植物中有机酸解离平衡常数的方法

摘要

本发明涉及一种基于分析型反相高效液相色谱保留模型和保留时间数据高效测定药用植物提取物复杂化合物混合体系中有机酸解离平衡常数（pKa）的方法。该方法是针对药用植物提取物混合体系，将化合物分离（separation）、结构鉴定（structure identification）以及物性参数pKa的测定（pKa determination）集成在一个过程中实现的方法。具体是由富含有机酸类物质的提取、有机酸类物质的判定、有机酸类物质的结构鉴定、有机酸类物质的保留时间采集以及有机酸类物质的pKa拟合计算这五个步骤组成。该方法具有良好的推广性，可以成为药用植物资源开发利用的有力辅助工具。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于分析型反相高效液相色谱保留模型和保留时间数据高 效测定药用植物提取物复杂化合物混合体系中有机酸解离平衡常数(pKa)的方 法。该方法可以在无需获得纯品的前提下同时测定多种有机酸的解离平衡常数， 适用于不易得到纯品的天然产物中的有机酸的解离平衡常数的高效测定。

背景技术

随着现代生活水平的提高，人们对健康日益重视，回归自然的呼声高涨， 天然药物在世界范围内得到了前所未有的重视和应用，其研制开发也成为了各 国新药研发的热点。药用植物提取物成分复杂，化合物种类繁多，有机酸便是 其中具有多种生物活性的一类重要物质。

有机酸广泛存在于动植物以及微生物体内，数量众多，是一类重要的天然 产物。现有研究表明，有机酸大多具有显著的生物活性，如抗癌、止咳平喘、 抑菌、抗内毒素、抗炎、抗氧化活性，还可以治疗血液和心血管系统疾病。它 们是药用植物中重要的有效成分，但是它们在植物中的含量一般都较低，大多 不高于1％。因此，如何合理有效地制备取得这些有机酸便成为了一个值得研究 的问题。

有机酸是弱电解质，其固有的物性参数——解离平衡常数决定了它们在不 同的溶液和酸碱性条件下的存在形态，如分子型亦或离子型。通过了解化合物 的这一重要物性参数，可以有效地指导化合物的提取分离过程。解离平衡常数 (pKa)是溶液中具有一定离解度的溶质的极性参数，是弱酸和弱碱性化合物的一 个重要物性参数。在临床用药中，大约有95％的药物属于微酸或微碱性。这些 药物在生物体内以离子状态或者分子状态存在，而其解离程度取决于该化合物 的解离平衡常数以及体内微环境的pH值。一般而言，在生物体内，分子型药物 较离子型药物有更好的脂溶性、更易吸收。根据药物分子的解离平衡常数，可 以预测药物在体内的吸收部位和药理作用强度。对于结构非特异性药物，如局 部麻醉药、巴比妥类镇静催眠药，解离平衡常数决定了在生理状态下，药物的 分子态与离子态的比例，进而决定了药物是否能在靶位达到有效浓度。除此之 外，解离平衡常数反映了药物分子酸碱性的强弱，对于判定其对皮肤、粘膜、 肌肉、内脏等是否有刺激性具有重要意义。因此，在药物化学中，解离平衡常 数是药物的一个重要物性参数。另外，解离平衡常数还可以在液相色谱分离化 合物的过程中指导分离条件的选择，在产品开发中作为最佳工艺和质量选择的 依据。

传统的测定解离平衡常数的方法主要有pH滴定法、电位滴定法和紫外分光 光度法等。这些方法都是建立在获得了一定量的待测定化合物纯品的基础上的。 然而，植物中的化学成分复杂，各化合物的含量差异巨大，要得到一定量的单 一化合物纯品并不是一件容易的事情。因此，至今为止仍然有许多天然产物的 解离平衡常数不为人们所知。由此可见，开发一种快速、高通量、可靠的测定 植物提取物复杂化合物混合体系中有机酸/碱化合物解离平衡常数的方法显得尤 为必要。

随着近现代色谱技术的发展，其逐渐成为取代传统的解离平衡常数测定方 法的新手段。自1958年，Debska等人首次采用纸层析法测定了白屈菜碱和原鸦 片碱的pKb值，De Wit、Xie和Dyrssen、Cleveland分别采用离子交换色谱、气 相色谱、毛细管电泳法测定了简单有机酸、生物碱的解离平衡常数。1977年， Horváth的研究小组在以疏水介质为填料的高效液相色谱柱上，采用有机相等度 洗脱的方法测定了人工混合样品中7种有机酸：安息香酸、肉桂酸、2-甲基安息 香酸、2-氯肉桂酸、4-溴苯甲酸、4-氯肉桂酸和2,6-二氯肉桂酸的pKa值。这是 反相高效液相色谱法首次用于化合物解离平衡常数的测定。随着反相高效液相 色谱技术的进一步发展，有机相梯度洗脱、pH梯度洗脱和有机相/pH双梯度洗 脱等方法逐渐用于同时分析组成和结构更为复杂的人工混合样品中有机酸碱的 解离平衡常数的测定，使得反相高效液相色谱法在测定化合物解离平衡常数上 进一步具备了快速、高通量和高精度的优点。

不过，现有的利用反相高效液相色谱法测定化合物混合体系中各成分的解 离平衡常数的研究主要还停留在对人工混合的已知有机酸或生物碱类化合物样 品解离平衡常数的测定阶段，混合物体系相对简单可控。然而，天然产物提取 物中的有机酸类化合物不仅在含量和种类上差别巨大，而且混合物体系中往往 还有大量其他种类的化合物与之共存。因此，如何在繁杂的化学成分混合物体 系中判定有机酸的类物质，让它们逐一实现理想的色谱分离，并且在此基础上 同时平行地测定多种有机酸的解离平衡常数还是一个亟待研究的问题。

发明内容

本发明的目的是针对先有技术的不足，提供一种测定药用植物中有机酸解 离平衡常数的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种测定药用植物中有机酸解 离平衡常数的方法，该方法包括如下步骤：

(1)通过水提醇沉的方法对药用植物中有机酸类物质进行粗提，得到粗提 物。

(2)通过反相液相色谱法对步骤1得到的粗提物进行色谱分离，判定其中 的有机酸类物质。

(3)鉴定步骤2中被判定为有机酸类物质的各物质的化学结构；

(4)通过反相液相色谱法对步骤1得到的粗提物在不同的色谱分离条件下 进行色谱分离，采集步骤3鉴定为有机酸类物质的各物质在不同色谱分离条件 下的保留时间t_R数值；

(5)根据步骤4的采集得到的一系列保留时间t_R数值，通过公式1拟合计 算各有机酸类物质的pKa值：

${\int }_0^{t_R-t_0}\frac{\mathrm{dt}}{t_0{k}_{\mathrm{obs}}\left(t\right)}=1---\left(1\right)$

其中，t为时间，t₀为柱子死体积对应的死时间，t_R为步骤4采集到的各有 机酸类物质在不同色谱分离条件下的保留时间；

针对一元酸，

$k_{\mathrm{obs}}\left(t\right)=\frac{k_{w0}·{10}^{-S_0\phi \left(t\right)}+k_{w1}·{10}^{{}_w{}^s\mathrm{pH}\left(t\right)-{}_w{}^{w}p{K}_a\left(1\right)-S_1\phi \left(t\right)-{\alpha }_1\phi \left(t\right)}}{1+{10}^{{}_w{}^s\mathrm{pH}\left(t\right)-{}_w{}^{w}p{K}_a\left(1\right)-{\alpha }_1\phi \left(t\right)}}---\left(2\right)$

其中，pH(t)为流动相在时刻t时的pH值；是指以水相标准溶液为参照 溶液，在水相和有机相混合前测定的水相缓冲液中的pKa值，α是斜率参数； 是有机酸的一级解离平衡常数；α₁为一级解离离子的斜率参数；是t 时刻流动相中有机相的百分含量；k_w0和k_w1分别表示弱酸分子和酸根离子在流 动相为纯水时的保留因子；S₀和S₁分别表示弱酸分子和酸根离子与色谱系统相 关的常数；是指t时刻，以水相标准溶液为参照溶液，在水相缓冲液和有 机相的混合后的流动相中测定的pH值；

针对多元酸，通过公式3～5拟合计算多元有机酸的pKa值：

$k_{\mathrm{obs}}\left(t\right)=\frac{k_0+\underset{r=1}{\overset{n}{\Sigma }}\frac{k_r\times {}_w{}^{s}K_a\left(r\right)}{{\left[H^{+}\right]}^r}}{1+\underset{r=1}{\overset{n}{\Sigma }}\frac{{}_w{}^{s}K_a\left(r\right)}{{\left[H^{+}\right]}^r}}---\left(3\right)$

${}_w{}^{s}K_a={}_w{}^{w}K_a·{10}^{-\mathrm{\alpha \phi }\left(t\right)}---\left(4\right)$

${}_w{}^{w}p{K}_a=-{\lg }^{{}_w{}^{w}K_a}---\left(5\right)$

式中，n为有机酸的元数(一元酸，n＝1；二元酸，n＝2……)，r＝1,2,……,n； k₀是未解离的弱酸分子的保留因子，k_r是弱酸分子解离后的各级 离子的保留因子，k_r＝k_wr·10^-Sφ(t)；是各级离子的解离平衡常数，[H⁺]为氢离 子浓度。

本发明的有益效果在于：首先，与现有方法比较，该方法可以在无需制备 得到化合物纯品的前提下，同时测定多个有机酸的pKa值，具有高通量的特点； 其次，该方法具有良好的推广性，可以较容易的推广到生物碱解离平衡常数的 测定。

附图说明

图1为本发明的技术路线图；

图2为丹参水提醇沉粗提物的反相分析液相色谱图；RP-HPLC分析条件： 流速为0.8ml/min,初始有机相含量为5％，线性洗脱梯度为1％/min，色谱柱温 度为30℃,检测波长为280nm。

图3为流动相pH值对丹参水提醇沉粗提物中各物质保留时间的影响；

RP-HPLC分析条件为：流速为0.8ml/min,初始有机相含量为5％，线性洗脱梯 度为1％/min，色谱柱温度为30℃,检测波长为280nm。两条曲线分别表示两个 pH条件下的分析结果：曲线1代表流动相曲线2代表流动相

图4为有机酸标准品与丹参水提醇沉粗提物经RP-HPLC分离出的有机酸； 类物质的光谱对照图；左侧光谱图为标准品光谱图，自上而下依次为丹参素、 咖啡酸、迷迭香酸和丹参酚酸B；右侧光谱图自上而下依次为丹参水体醇沉样品 峰1、3-5的光谱图。

图5为丹参水提醇沉提粗物经RP-HPLC分离后的色谱峰6对应的一级负离 子HPLC-ESI-MS质谱图；

图6为丹参水提醇沉粗提物经RP-HPLC分离后的色谱峰6对应的¹H NMR 谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，以下实施例用来解释说明本发明， 而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发 明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

实施例1

在本实例中，选取了丹参中的有机酸作为研究对象。测定丹参中有机酸的 解离平衡常数，如图1所示，包括如下步骤：

(1)将干燥的中药材丹参和水按1:30的固液比进行回流提取，提取温度为 100℃；重复提取2次。提取液经旋转蒸发浓缩后，将浓缩液与95％的乙醇按1： 4的比例进行醇沉。将经醇沉后的丹参水提液样品，经10000rpm，10min离心 后备用。

(2)通过反相高效液相色谱法对步骤1得到的粗提物进行色谱分离， RP-HPLC分析条件如下：流速为0.8ml/min,初始有机相含量为5％，线性洗脱 梯度为1％/min，色谱柱温度为30℃,检测波长为280nm。结果如图2所示，图 中标识出主要的6个色谱峰。将上述粗提物在不同的流动相下(和 )进行色谱分离，结果如图3所示，保持其它色谱分离条件一致，仅改 变流动相的pH，除了峰2的保留时间不随流动相pH的变化而改变，其余5个 峰的保留时间均随pH的增大而减小。因此，初步判定该5个峰为酸性化合物， 选为研究对象。

(3)鉴定步骤2中被判定为有机酸类物质的各物质的化学结构。通过比较 步骤2中选定的5个色谱峰对应的物质与各标准品的光谱图(如图4所示)，确 定了峰1、3～5分别为化合物丹参素、咖啡酸、迷迭香酸和丹参酚酸B。由于色 谱峰6的光谱没有相应的标准品与之对应，因此采用液质联用(LC-MS)和核 磁共振氢谱(¹H NMR)对化合物6进行结构鉴定，结果如图5所示。最终确定 色谱峰6对应的物质为丹参酚酸A。其中，丹参素、咖啡酸、迷迭香酸和丹参 酚酸A为一元酸，丹参酚酸B为二元酸。

(4)通过改变流动相pH和梯度变化速率，5种化合物均得到20组保留时 间t_R数值。如表1所示

表1 反相分析液相色谱上不同色谱分离条件下各有机酸类物质的保留时间t_R

(5)根据步骤4的采集得到的一系列保留时间t_R数值，通过公式1拟合计 算各有机酸类物质的pKa值。五种酚酸的拟合值和文献报导值如表2所示。 结果表明，拟合值与文献值能较好地吻合。因此，该方法具有良好的推广性， 可以成为药用植物资源开发利用的有力辅助工具。

表2 丹参水提醇沉粗提物中5种有机酸的拟合值

其中，的下标exp表示试验值，lit表示报导文献值。