一种新型糖化酶普鲁兰酶复合产品及其生产方法

摘要

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种新型糖化酶普鲁兰酶复合产品及其生产方法。所述新型糖化酶普鲁兰酶复合产品，其每1kg复合产品中，含400－800g液体糖化酶和200－600g液体普鲁兰酶，其中，液体糖化酶活力6－11万U/mL，液体普鲁兰酶活力600－1800U/mL。本发明高产高效复合酶产品由液体糖化酶和液体普鲁兰酶组合而成，可分别用于糖化淀粉α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键两种液体单体系生物制品，如用于葡萄糖浆转化生产葡萄糖、麦芽糖等，糖化液DX值达99%以上。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种新型糖化酶普鲁兰酶复合产品及其生产方法。

背景技术

糖化酶又称葡萄糖淀粉酶，是世界上产量最大和用途最广的酶类。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解α-1,4糖苷键。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解α-1,6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶水解α-1,4糖苷键的速度最快，能微弱水解α-1,3连接的碳链。

普鲁兰酶是一类淀粉脱支酶，因其能专一性水解普鲁兰糖（麦芽三糖以α-1,6糖苷键连接起来的聚合物）而得名。能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1,6糖苷键，切下整个分支结构形成直链淀粉。普鲁兰酶能够将最小单位的支链分解，最大限度的利用淀粉原料，所以在以淀粉为原料的工业生产中具有重要的作用。

目前，糖化酶广泛应用于酿造业、制糖业、食品加工及有机酸、氨基酸等发酵工业和轻工纺织业，但其生产应用中仍存在两个弊端：

1）糖化酶产品中存在的葡萄糖转苷酶（简称转苷酶）严重影响糖化生产中产品的纯度和产率。工业中生产应用的糖化酶主要是通过黑曲霉（Asp.niger）发酵生产获得。黑曲霉发酵生产糖化酶具有酶活力稳定性高，能在较高温度和较低pH条件下应用等优点，但是纯度不高，在黑曲霉发酵过程中除了有葡萄糖淀粉酶外，还混有少量其它酶种，如葡萄糖转苷酶、蛋白酶、纤维素酶等，而这些酶的存在对糖化酶的作用效果产生负影响。

2）葡萄糖淀粉酶对α-1,4糖苷键的水解非常有效，但对α-1,6键的水解速率大大降低。因此有效降低糖化酶生产中转苷酶的含量，完善糖化酶产品水解作用效果具有重要的实际意义。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种新型糖化酶普鲁兰酶复合产品及其生产方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种新型糖化酶普鲁兰酶复合产品，每1kg复合产品中，含400－800g液体糖化酶和200－600g液体普鲁兰酶，其中，液体糖化酶活力6－11万U/mL，液体普鲁兰酶活力600－1800U/mL。

所述新型糖化酶普鲁兰酶复合产品的生产方法，其包括如下步骤：

1）生产液体糖化酶：将黑曲霉菌株先进行液体培养，然后在32－35℃、pH 4.0－5.0的条件下按3－12%（优选5－10%）的接种量接种于发酵培养基中发酵培养120－180h（转速100－200转/分钟）；所述发酵培养基组成为（w/v，g/L）：玉米淀粉1.5－3.0%，豆粕0.5－2.0%，硫酸铵0.1－0.30%，磷酸二氢钾0.1－0.2%，发酵培养结束后添加助滤剂过滤，滤液经超滤浓缩后，取浓缩液备用；

2）生产液体普鲁兰酶：将枯草芽孢杆菌菌株先进行液体培养，然后在34－38℃、pH 6.0－7.5的温度条件下按2－6%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养35－45h（转速150－250转/分钟）；所述发酵培养基组成为（w/v，g/L）：玉米淀粉1.0－3.0%，豆粕0.1－2.0%，硫酸铵0.1－0.3%，磷酸氢二钾0.05－0.2%；发酵培养结束后添加助滤剂过滤，滤液经超滤浓缩后，取浓缩液备用；

3）将步骤1）和2）所得滤液按比例混合均匀即得。

具体地，步骤1）中所述的液体培养条件为：在温度32－35℃、pH 4.0－5.0的条件下培养2－3天（转速100－200转/分钟）；液体培养基组成为（w/v，g/L）：玉米淀粉1.5－3.0%，蛋白胨0.5－2.0%，硫酸铵0.1－0.30%，磷酸二氢钾0.1－0.2%。

步骤2）中所述的液体培养条件为：在温度34－38℃、pH 6.0－7.5的条件下培养1－2天（转速150－250转/分钟）；液体培养基组成为（w/v，g/L）：玉米淀粉1.0－3.0%，蛋白胨0.1－2.0%，硫酸铵0.1－0.3%，磷酸氢二钾0.05－0.2%。

步骤1）中助滤剂的添加量为0.6－2.0%（w/v，g/L），所述助滤剂的各原料重量百分比组成为：珍珠岩20－35%，硅藻土35－45%，膨润土20－45%。

步骤2）中助滤剂添加量为0.6－2.0%（w/v，g/L），所述助滤剂的各原料重量百分比组成为：珍珠岩35－70%，硅藻土30－65%。

本发明中，黑曲霉菌株（Asp.niger）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CGMCC 3.1858。枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subtilis）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC 20872。步骤1）中添加助滤剂过滤用以除去菌体、葡萄糖转苷酶等，所得滤液为糖化酶，经浓缩后其活力达10－14万U/mL，葡萄糖转苷酶活性在50U/mL以下。步骤2）中过滤用以除去菌体等其它杂质，所得滤液为普鲁兰酶，经浓缩后其活力达1000－5000U/mL。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明高产高效复合酶产品由液体糖化酶和液体普鲁兰酶组合而成，可分别作用淀粉α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键两种液体单体系生物制品。本发明中所用糖化酶中所含转苷酶活性在50U/mL以下，而其他市售糖化酶所含转苷酶活性则在7000U/mL左右。本发明高效复合酶产品作用于淀粉液化后的葡萄糖浆转化生产结晶葡萄糖、果葡糖浆等，按GB/T20880-2007中6.2条款测定糖化液DX值达99%以上，高于市售其他糖化酶产品（糖化液DX值最高仅达96%）的作用效果。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。

下述实施例中，黑曲霉菌株（Asp.niger）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CGMCC 3.1858。枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subtilis）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC 20872。

实施例1

一种新型糖化酶普鲁兰酶复合产品，每1kg复合产品中，含600g液体糖化酶和400g液体普鲁兰酶，其中，液体糖化酶活力6万U/mL，液体普鲁兰酶活力720 U/mL。

上述新型糖化酶普鲁兰酶复合产品的生产方法，其包括如下步骤：

1）生产液体糖化酶：将黑曲霉菌株先进行液体培养，然后在34℃、pH 4.8的条件下按8%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养160h（转速120转/分钟）；所述发酵培养基组成为（w/v，g/L）：玉米淀粉2.5%，豆粕1.0%，硫酸铵0.2%，磷酸二氢钾0.15%，发酵培养结束后添加助滤剂过滤，滤液经超滤浓缩后，取浓缩液备用；

上述的液体培养条件为：在温度34℃、pH 4.8的条件下培养2天（转速120转/分钟）；液体培养基组成为（w/v，g/L）：玉米淀粉2.5%，蛋白胨1.0%，硫酸铵0.20%，磷酸二氢钾0.15%；所述助滤剂的添加量为1.0%（w/v，g/L），助滤剂的各原料重量百分比组成为：珍珠岩25%，硅藻土40%，膨润土35%。

2）生产液体普鲁兰酶：将枯草芽孢杆菌菌株先进行液体培养，然后在37℃、pH 6.7的条件下按5%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养40h（转速200转/分钟）；所述发酵培养基组成为（w/v，g/L）：玉米淀粉1.5%，豆粕1.8%，硫酸铵0.15%，磷酸氢二钾0.05%；发酵培养结束后添加助滤剂过滤，滤液经超滤浓缩后，取浓缩液备用；

上述的液体培养条件为：在温度37℃、pH 6.7的条件下培养1天（转速200转/分钟）；液体培养基组成为（w/v，g/L）：玉米淀粉1.5%，蛋白胨1.8%，硫酸铵0.15%，磷酸氢二钾0.05%；所述助滤剂的添加量为1.2%（w/v，g/L），助滤剂的各原料重量百分比组成为：珍珠岩65%，硅藻土35%。

3）将步骤1）和2）所得滤液按比例混合均匀即得。

上述所得糖化酶普鲁兰酶复合产品作用于淀粉液化后的葡萄糖浆生产结晶葡萄糖，添加量0.06%（v/v），葡萄糖浆的pH 4.2，于58℃反应48h后，所得产品中糖化液DX值达99.2%。

实施例2

一种新型糖化酶普鲁兰酶复合产品，每1kg复合产品中，含500g液体糖化酶和500g液体普鲁兰酶，其中，液体糖化酶活力7万U/mL，液体普鲁兰酶活力800 U/mL。

上述新型糖化酶普鲁兰酶复合产品的生产方法，其包括如下步骤：

1）生产液体糖化酶：将黑曲霉菌株先进行液体培养，然后在35℃、pH 4.3的条件下按10%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养120h（转速150转/分钟）；所述发酵培养基组成为（w/v，g/L）：玉米淀粉3.0%，豆粕0.5%，硫酸铵0.1%，磷酸二氢钾0.2%，发酵培养结束后添加助滤剂过滤，滤液经超滤浓缩后，取浓缩液备用；

上述的液体培养条件为：在温度35℃、pH 4.3的条件下培养3天（转速150转/分钟）；液体培养基组成为（w/v，g/L）：玉米淀粉3.0%，蛋白胨0.5%，硫酸铵0.10%，磷酸二氢钾0.2%；所述助滤剂的添加量为0.6%（w/v，g/L），助滤剂的各原料重量百分比组成为：珍珠岩20%，硅藻土35%，膨润土45%。

2）生产液体普鲁兰酶：将枯草芽孢杆菌菌株先进行液体培养，然后在34℃、pH 6.0的条件下按2%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养40h（转速200转/分钟）；所述发酵培养基组成为（w/v，g/L）：玉米淀粉1.0%，豆粕2.0%，硫酸铵0.1%，磷酸氢二钾0.05%；发酵培养结束后添加助滤剂过滤，滤液经超滤浓缩后，取浓缩液备用；

上述的液体培养条件为：在温度34℃、pH 6.0的条件下培养1天（转速200转/分钟）；液体培养基组成为（w/v，g/L）：玉米淀粉1.0%，蛋白胨2.0%，硫酸铵0.1%，磷酸氢二钾0.05%；所述助滤剂的添加量为1.6%（w/v，g/L），助滤剂的各原料重量百分比组成为：珍珠岩70%，硅藻土30%。

3）将步骤1）和2）所得滤液按比例混合均匀即得。

上述所得糖化酶普鲁兰酶复合产品用于果葡糖浆的生产，添加量0.2%（v/v），葡萄糖浆pH 4.5，60℃反应52h，所得糖化液DX值达99%以上。糖化液再经葡萄糖异构酶反应最终所得果葡糖浆中糖分组成为果糖55%以上，葡萄糖45%左右。