青龙衣中20(S)-原人参二醇的提取分离方法及用途

摘要

青龙衣中20(S)-原人参二醇的提取分离方法及用途，本发明公开了龙衣中20(S)-原人参二醇的提取分离方法及用途。以当年采收龙衣药材为原料用二氯甲烷超声提取，然后依次经过活性炭、吉拉德试剂吸附除杂、硅胶柱色谱分离等主要步骤，得到目标化合物20(S)-原人参二醇，整体工艺过程简便可行；此外，涉及20(S)-原人参二醇在制备治疗慢性胃溃疡引起的胃粘膜损伤药物中的应用，可提高龙衣综合利用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及20(S)-原人参二醇提取分离方法，特别涉及一种青龙衣中20(S)-原人参二醇的提取分离方法及用途。

背景技术

20(S)-原人参二醇为四环三萜类化合物，现代药理学研究表明多种此类二醇组人参皂苷均具有抗肿瘤作用，进一步对人参皂苷抗肿瘤构效关系和人参皂苷体内代谢的研究发现人参皂苷元——原人参二醇及其体内代谢产物具有很好的抗肿瘤活性。且与其他人参皂苷元比较，原人参二醇具有更强的抗肿瘤活性(刘娜，朴虎日，李宁等．原人参二醇及其衍生物的化学与抗癌活性研究进展，中国药物化学杂志，2008，8(5)：384-388)。以往此种成分主要从人参属植物中分离得到或者通过较复杂的化学合成获得，所用原料成本较高。但是研究发现在胡桃科植物核桃楸果实未成熟的青皮中也有存在且收率很高，该核桃青皮也被称为“青龙衣”。核桃揪主要分布于东北三省，朝鲜北部、苏联远东地区也有分布。野生核桃资源丰富，每年核桃青皮产量都在十几万吨，但大多数以废物丢弃了，这样不但污染环境，也没有对这一宝贵资源进行充分利用(杨金枝，陈锦屏．核桃资源的综合开发利用，食品与药品，2007，9(4)：71-73)。

周媛媛首次从青龙衣中分离得到20(S)-原人参二醇（已刊出，杨炳友，孟颖，刘兆熙，蒋艳秋，周媛媛．青龙衣中三萜类化合物的分析，中国实验方剂学杂志，2015，21(2)：49-52），但具体分离流程叙述不详细且工艺未进行完善，收率较低，不利于工业化生产。据文献报道青龙衣这个属植物主要含有萘醌及其苷类、黄酮及其苷类、二芳基庚烷类、酚酸及其三萜等化合物（周媛媛，王栋．胡桃属植物抗肿瘤作用化学成分研究进展，中国药房，2014，21(43)：4119-4121），这些成分中有很多都具有羰基官能团，这些物质对不具有羰基的20(S)-原人参二醇的制备和纯化干扰较大，除杂尤为重要。

发明内容

本发明所需要解决的技术问题在于，提供一种青龙衣中20(S)-原人参二醇的提取分离方法及用途。

一种青龙衣中20(S)-原人参二醇的提取分离方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）提取：以当年8月份采收青龙衣药材为原料，低温烘干，用二氯甲烷超声提取，每次提取45min，回收二氯甲烷溶剂得到药物浸膏；

（2）除杂：将步骤（1）中制备的药物浸膏加水，调至密度为1.05 g/mL的混悬液，进行如下除杂处理：①混悬液反复穿过活性炭抽滤漏斗进行减压抽滤除杂；②将抽滤液浓缩蒸干后，加入无水乙醇30ml、100g吉拉德试剂P 100g及12%（V/V）醋酸进行捏溶，在水浴50℃温热处理，反应结束后加水稀释至2000ml，加入同体积乙醚萃取三次，得到乙醚浸膏；

（3）分离：将步骤（2）中制备的乙醚浸膏再进行硅胶柱层析分离，首先石油醚和乙酸乙酯混合比例等度洗脱，3.5个柱体积后弃去，然后减少石油醚用量即更换石油醚和乙酸乙酯体积比再次进行等度洗脱，洗脱3个柱体积并收集，收集液回收溶剂得到粗品20(S)-原人参二醇；

（4）精制：用乙酸乙酯30 ml洗涤三次粗品结晶，得到精品20(S)-原人参二醇。

所述步骤（1）中二氯甲烷的用量为原料重量的5～8倍（V/W）；超声处理次数为3～8次。

所述步骤（2）中混悬液5～10次穿过活性炭抽滤漏斗进行减压抽滤；水浴温热8～24 h。

所述步骤（3）中首先石油醚和乙酸乙酯采用体积比为3:1～5:1进行等度洗脱，然后减少石油醚用量，更换石油醚和乙酸乙酯体积比为2:1～0.5:1再次进行等度洗脱。

提取分离的20(S)-原人参二醇在制备治疗慢性胃溃疡引起的胃粘膜损伤药物中的应用。

本发明的有益效果是：本发明利用超声辅助溶剂提取，有效节省了提取时间和提取溶剂的用量，对于原料药材中提出的大量叶绿素和其他杂质则结合进一步的活性炭减压柱吸附和吉拉德试剂法进行有效除杂处理，这两种除杂手段分别针对叶绿素和具有羰基的非目标成分发挥了理想的专属吸附除去效果，有效提高了目标产物的纯度，且收率较已有技术提高3倍以上，整体工艺过程简便可行。

具体实施方式

实施例1：

一种青龙衣中20(S)-原人参二醇的提取分离方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）提取：以当年8月份采收青龙衣药材为原料，低温烘干后称重5kg；按溶剂为原料重量5倍（V/W）的用量加入二氯甲烷50KHz超声提取3次，每次45min，减压回收二氯甲烷，得到二氯甲烷浸膏138g；

（2）除杂：将138g二氯甲烷浸膏加入水，调至密度为1.05 g/mL的混悬液，该混悬液反复10次穿过活性炭抽滤漏斗进行减压抽滤（活性炭颗粒粒径在40目～60目之间，活性炭体积用量不超过布氏漏斗高度的1/2体积）；抽滤结束后将抽滤液浓缩蒸干后，加入无水乙醇30ml、100g吉拉德试剂P 100g及12%（V/V）醋酸进行捏溶，在水浴50℃温热8h，反应结束后加水稀释至2000ml，加入同体积乙醚萃取三次，得到乙醚浸膏16g（以上除杂过程涉及活性炭减压抽滤，主要利用活性炭具有可以吸附除去叶绿素为主的脂溶性杂质的特性；而接下来利用吉拉德试剂P除杂并结合柱色谱进行中药成分分离制备未见报道，该过程主要利用羰基类化合物和吉拉德试剂形成水溶性产物，通过进一步萃取保留有机溶剂相而除去这些水溶性物质，达到减少此类成分对不含羰基官能团20(S)-原人参二醇的提取干扰的目的）；

（3）分离：乙醚浸膏再进行硅胶柱层析分离，乙醚浸膏与拌样硅胶重量比为1:25，二氯甲烷浸膏与装柱硅胶重量比为1:1.5，石油醚：乙酸乙酯=5:1等度洗脱，3.5个柱体积后弃去，石油醚：乙酸乙酯=2:1等度洗脱3个柱体积后回收溶剂得到粗品20(S)-原人参二醇39mg；

（4）精制：用乙酸乙酯反复洗涤结晶得到精品20(S)-原人参二醇37mg，纯度含量为97.1%。

实施例2：

一种青龙衣中20(S)-原人参二醇的提取分离方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）提取：取实施例1中制备的干药材5kg；按溶剂为原料重量8倍（V/W）的用量加入二氯甲烷50KHz超声提取8次，每次45min，减压回收二氯甲烷，得到二氯甲烷浸膏162g；

（2）除杂：将162g二氯甲烷浸膏加入水，调至密度为1.05 g/mL的混悬液，该混悬液反复8次穿过实施例1中的活性碳减压装置，此过程目的主要除去叶绿素为主的脂溶性杂质；抽滤结束后将抽滤液浓缩蒸干后，加入无水乙醇30ml、100g吉拉德试剂P 100g及12%（V/V）醋酸进行捏溶，在水浴50℃温热10h，反应结束后加水稀释至2000ml，加入同体积乙醚萃取三次，得到乙醚浸膏27g；

（3）分离：乙醚浸膏再进行硅胶柱层析分离，乙醚浸膏与拌样硅胶重量比为1:25，二氯甲烷浸膏与装柱硅胶重量比为1:1.5，石油醚：乙酸乙酯=4:1等度洗脱，3.5个柱体积后弃去，石油醚：乙酸乙酯=0.5:1等度洗脱3个柱体积后回收溶剂得到粗品20(S)-原人参二醇46mg；

（4）精制：用乙酸乙酯反复洗涤结晶得到精品20(S)-原人参二醇41mg，纯度含量为96.8%。

实施例3：

一种青龙衣中20(S)-原人参二醇的提取分离方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）提取：取实施例1中制备的干药材5kg；按溶剂为原料重量6倍（V/W）的用量加入二氯甲烷50KHz超声提取4次，每次45min，减压回收二氯甲烷，得到二氯甲烷浸膏158g；

（2）除杂：将158g二氯甲烷浸膏加入水，调至密度为1.05 g/mL的混悬液，该混悬液反复5次穿过实施例1中的活性碳减压装置，此过程目的主要除去叶绿素为主的脂溶性杂质；抽滤结束后将抽滤液浓缩蒸干后，加入无水乙醇30ml、100g吉拉德试剂P 100g及12%（V/V）醋酸进行捏溶，在水浴50℃温热24h，反应结束后加水稀释至2000ml，加入同体积乙醚萃取三次，得到乙醚浸膏26g；

（3）分离：乙醚浸膏再进行硅胶柱层析分离，乙醚浸膏与拌样硅胶重量比为1:25，二氯甲烷浸膏与装柱硅胶重量比为1:1.5，石油醚：乙酸乙酯=3:1等度洗脱，3.5个柱体积后弃去，石油醚：乙酸乙酯=0.5:1等度洗脱3个柱体积后回收溶剂得到粗品20(S)-原人参二醇42mg；

（4）精制：用乙酸乙酯反复洗涤结晶得到精品20(S)-原人参二醇40mg，纯度含量为97.4%。

实施例4：

一种青龙衣中20(S)-原人参二醇的提取分离方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）提取：取实施例1中制备的干药材5kg；按溶剂为原料重量6倍（V/W）的用量加入二氯甲烷50KHz超声提取5次，每次45min，减压回收二氯甲烷，得到二氯甲烷浸膏160g；

（2）除杂：将160g二氯甲烷浸膏加入水，调至密度为1.05 g/mL的混悬液，该混悬液反复8次穿过实施例1中的活性碳减压装置，此过程目的主要除去叶绿素为主的脂溶性杂质；抽滤结束后将抽滤液浓缩蒸干后，加入无水乙醇30ml、100g吉拉德试剂P 100g及12%（V/V）醋酸进行捏溶，在水浴50℃温热12h，反应结束后加水稀释至2000ml，加入同体积乙醚萃取三次，得到乙醚浸膏25g；

（3）分离：乙醚浸膏再进行硅胶柱层析分离，乙醚浸膏与拌样硅胶重量比为1:25，二氯甲烷浸膏与装柱硅胶重量比为1:1.5，石油醚：乙酸乙酯=3:1等度洗脱，3.5个柱体积后弃去，石油醚：乙酸乙酯=1:1等度洗脱3个柱体积后回收溶剂得到粗品20(S)-原人参二醇48mg；

（4）精制：用乙酸乙酯反复洗涤结晶得到精品20(S)-原人参二醇46mg，纯度含量为98.8%。

实施例5：

如实施例1-4中任一项所述的提取分离的20(S)-原人参二醇在制备治疗慢性胃溃疡引起的胃粘膜损伤药物中的应用。

效果描述:同时发现，实施例1-4中任一项所述的提取分离的20(S)-原人参二醇对慢性胃溃疡引起的胃粘膜损伤具有明显的保护作用。

具体实验方法如下：

1、建立慢性胃溃疡动物模型：将动物禁食不禁水24小时，乙醚或5%巴比妥钠麻醉后实施剖腹手术，消毒腹部，于剑突下切开腹腔，在胃前壁窦体交界同一部位(避开血管)，用浸有100％冰醋酸、直径为5 mm的圆形滤纸接触1 min。然后还纳胃体，缝合手术切口，切口用乙醇擦拭以防止感染。

2、分组与给药：术后将动物随机分为对照组，提取分离的20(S)-原人参二醇高、中、低剂量组及法莫替丁组，每组8只。予以常规饲养，次日起各组分别给药，对照组给予相当于中药中剂量体积的蒸馏水，每天1次，连续10 d。

3、观察指标：末次给药后第2天，开腹测量溃疡面的横径及纵径，计算溃疡面积，溃疡面积S=π×R₁×R₂×1/4(π为圆周率，R₁、R₂分别为通过溃疡中心所取的最大横径和纵径)；按Guth法计算黏膜损伤指数，损伤≤1>

与模型组比较，a：与其他组比较：p＜0.01；与其他组比较，b：p＜0.05

从结果可以看出，提取分离的20(S)-原人参二醇能够降低醋酸诱导大鼠胃溃疡损伤面积、溃疡指数，其高剂量组与西药的黏膜保护药法莫替丁作用较接近，保护作用显著，对慢性胃溃疡引起的胃粘膜损伤具有明显的保护作用。具有开发成为胃粘膜保护药的前景。