具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统

摘要

一种具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统，包括激光发射器、扩束光路组件、微反射镜、二向色镜、荧光显微成像组件及光谱仪，激光发射器用于将激光束发射至所述扩束光路组件上，经由扩束光路组件进行散斑抑制后得到照明光束，照明光束经过微反射镜产生结构光场，结构光场通过二向色镜反射至荧光显微成像组件上，荧光显微成像组件包括物镜、物镜驱动装置及载物台，物镜接受结构光场并聚焦于载物台上的样品上，并激发出荧光束，所述物镜驱动装置驱动所述物镜沿其光轴运动，使物镜进行光轴扫描，光谱仪将荧光束进行分析并分离得到光谱及图像信息。使用上述具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统可得到样品结构的三维图像及对应的一维光谱信息。

说明书

技术领域

本发明涉及一种光学系统，尤其涉及一种具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统。

背景技术

光学显微镜自发明以来就一直是人类认识微观世界的重要工具之一，其在临床医学、生物学、材料学等学科领域中发挥着非常重要的作用。但传统的光学显微只能获取物体如细胞的形态信息，不能对物体的结构与成份进行进一步的分析。

光谱成像技术是一种将成像技术与光谱技术相结合的新型多维信息获取技术。物体结构与成份的差异，会在吸收光谱上存在显著的差异性。在宏观方面的空间探测与地表观测中成像光谱技术已经成为一种广泛且有效的检测手段。

随着科学研究与实际检测的需要，将光谱成像技术应用到显微镜观测逐渐成为国内外各领域研究人员关注的热点，尤其是病理学、细胞学、组织学等生物医学领域。将光谱成像技术与显微成像技术结合在一起形成的显微光谱成像系统，不仅可以对物体的形态进行观测，还能够提供用以区别物体结构与成份差异光谱信息，即获得物体的二维信息同时还可以获得一维光谱信息。它具有较高的光谱分辨率、光学成像分辨率。

目前大部分基于传统荧光显微镜的荧光显微光谱成像系统，是一种面照明的宽场成像方式，虽然可以在较短的积分时间内获得一幅完整图像，但由于受物体离焦部分的干扰，其图像不具有三维层析能力，只能获得二维图像信息与一维光谱信息。因此，如何实现排除物体离焦部分干扰，提供一种新的具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统，以获得三维图像信息以及一维光谱信息，满足对物体的结构与成分进行进一步分析，是当前迫切需要解决的一个问题。

发明内容

本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统，可获得三维结构信息以及一维光谱信息，从而满足对物体的结构与成分进行进一步地分析。

为了解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统，其包括激光发射器、扩束光路组件、微反射镜、二向色镜、荧光显微成像组件以及光谱仪，所述激光发射器用于将激光束发射至所述扩束光路组件上，经由所述扩束光路组件进行散斑抑制后得到照明光束，所述照明光束经过所述微反射镜产生结构光场，所述结构光场通过所述二向色镜反射至所述荧光显微成像组件上，所述荧光显微成像组件包括物镜、物镜驱动装置以及载物台，所述物镜接受所述结构光场，并将所述结构光场聚焦于所述载物台上放置的样品上并激发出荧光束，所述物镜驱动装置用于驱动所述物镜沿其光轴运动，以使所述物镜进行光轴扫描，所述光谱仪将所述荧光束进行分析并分离得到光谱及图像信息。

其中，所述扩束光路组件包括散射体旋转装置、第一透镜以及第二透镜，所述散射体旋转装置将所述激光束进行散斑抑制后得到所述照明光束，所述第一透镜以及第二透镜用于对所述照明光束进行均匀扩束，以使所述照明光束均匀化。

其中，所述具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统还包括第一平面反射镜，设于所述第二透镜以及所述微反射镜之间，用以对所述照明光束的入射角度进行调整后，使所述照明光束以一定的入射角度照射于所述微反射镜上。

其中，所述具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统还包括柱透镜，所述柱透镜设于所述微反射镜以及所述荧光显微成像组件之间，用以将所述结构光场成像于无穷远处，以使所述物镜在所述样品的物面上的聚焦区域呈长方形状。

其中，所述物镜驱动装置包括一维平移台以及物镜调整架，所述物镜调整架设于所述一维平移台上，所述物镜调整架与所述物镜连接，用以调整所述物镜的位置。

其中，所述光谱仪包括第二平面反射镜、第三透镜以及入射狭缝，所述第二平面反射镜用以反射所述荧光束至所述第三透镜上，所述第三透镜用以对所述荧光束进行聚焦，以使所述荧光束聚焦成像于所述入射狭缝上。

其中，光谱仪还包括滤光片，所述滤光片设于所述第二平面反射镜以及所述第三透镜之间，用以进一步滤除所述荧光束中的激光光谱。

其中，所述光谱仪还包括球面反射镜以及平面光栅，所述球面反射镜用于对经过所述入射狭缝的荧光束进行准直并反射至所述平面光栅上，经由所述平面光栅对所述荧光束进行荧光光谱色散。

其中，所述光谱仪还包括超环面镜，所述荧光束经所述平面光栅进行荧光光谱色散后，经由所述超环面镜进行聚焦。

其中，所述光谱仪还包括成像器件，所述荧光束经所述超环面镜进行聚焦至所述成像器件上，经由所述成像器件进行光谱及图像信息的记录采集。

实施本发明实施例，具有如下有益效果：

本发明实施例提供的具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统通过设置微反射镜来产生一维结构光场，同时设置二向色镜、物镜、物镜驱动装置以及载物台，通过二向色镜将结构光场反射至物镜上并被物镜接受，物镜将该结构光场聚焦于载物台的样品上，并激发出荧光，通过控制载物台进行一维平移，得到不同视场的二维图像，控制物镜驱动装置驱动物镜沿光轴方向运动，使得物镜能够进行光轴扫描。荧光束通过光谱仪进行分析并分离。通过控制载物台进行图像视场切换，物镜驱动装置进行物镜光轴扫描，以及光谱仪进行荧光光谱色散，最终可得到样品结构的三维图像以及对应的一维光谱信息。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统的示意图；

图2是本发明实施例提供的柱透镜与微反射镜的另一视角的示意图；

图3是本发明实施例提供的微反射镜产生结构光场的示意图；

图4是本发明实施例提供的具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统的成像原理图；

图5是本发明实施例提供的微反射镜、成像器件以及载物台的同步时序图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请一并参阅图1至图2所示，本实施例提供一种具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统100，其包括激光发射器10、扩束光路组件20、微反射镜30、二向色镜40、荧光显微成像组件50以及光谱仪60。所述荧光显微成像系统50包括物镜51、载物台52以及物镜驱动装置53，所述载物台52上放置有样品(未图示)，所述物镜驱动装置53驱动所述物镜51沿其光轴运动，以使所述物镜51进行光轴扫描。

所述激光发射器10用于发射激光束L1。本实施例中，所述激光发射器10为单色激光器。所述激光发射器10将所述激光束L1发射至所述扩束光路组件20上。所述激光发射器10的激光波长为445nm，激光功率为40mw。可以理解的是，在其他实施例中，所述激光发射器10的激光波长以及激光功率也可根据实际操作选择调整。

所述扩束光路组件20将所述激光发射器10发射出的所述激光束L1进行散斑抑制后得到照明光束L2。本实施例中，所述扩束光路组件20包括散射体旋转装置21、第一透镜22以及第二透镜23，所述散射体旋转装置21用于将所述激光束L1进行散斑抑制后得到所述照明光束L2。所述散射体旋转装置21由散射片(未图示)以及电动马达(未图示)组成，所述电动马达驱动所述散射片转动，从而通过所述散射片的转动，打乱所述激光束L1的激光相关性，从而实现散斑抑制功能。

所述照明光束L2经过所述第一透镜22以及所述第二透镜23进行均匀扩束，以使所述照明光束L2均匀化。此外，所述第一透镜22以及第二透镜23还可对所述照明光束L2进行准直，便于后续所述微反射镜30形成结构光场。

所述照明光束L2经过所述微反射镜30产生结构光场L3。本实施例中，所述微反射镜30为数字微反射镜，从而能够快速产生所述结构光场L3，并且由于其产生的所述结构光场L3的刷新速度快，故其光能利用率高。此外，通过所述微反射镜30产生的所述结构光场L3更均匀，从而有利于后续的样品结构分析。具体的，如图3所示，所述微反射镜30采用DMD投影系统，由1024×768像素组成，其像元尺寸为13.68um×13.68um，即每一个所述像素都为一块可独立向正负方向翻转12度的小反射镜，其翻转的频率可达32KHz。所述微反射镜的每个周期Z为6个像素。可以理解的是，在其他实施例中，所述微反射镜30也可根据实际操作选择其他的投影系统。

为了进一步的改进，所述具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统100还包括第一平面反射镜70，所述第一平面反射镜70设于所述第二透镜23以及所述微反射镜30之间，用以对所述照明光束L2的入射角度进行调整后，使所述照明光束L2以一定的入射角度设于所述微反射镜30上。本实施例中，所述入射角度为12度，从而使得所述照明光束L2经过所述微反射镜30上时，能够被调制为具有一定周期的一维结构光场。可以理解的是，在其他实施例中，所述入射角度的值也可根据实际操作调整。

本实施例中，所述具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统100还包括柱透镜80，所述柱透镜80设于所述微反射镜30以及所述荧光显微成像组件50之间，用以将所述结构光场L3成像于无穷远处，以使所述物镜51在所述样品的物面上的聚焦区域呈长方形状。

所述二向色镜40设于所述柱透镜80以及所述物镜51之间，用以反射所述结构光场L3。本实施例中，所述二向色镜40能够反射小于450nm的光谱，同时能够透射大于450nm的光谱，从而使得所述结构光场L3经过所述二向色镜40反射至所述物镜51上，激发的所述荧光束L4经过所述二向色镜40透射至所述光谱仪60中。

所述物镜51接受所述结构光场L3，并且所述物镜51将所述结构光场L3聚焦于所述载物台52上放置的所述样品上，并激发出荧光束L4。所述物镜驱动装置53用于驱动所述物镜51沿其光轴运动，以使所述物镜51进行光轴扫描。本实施例中，所述物镜驱动装置53沿其光轴方向能够做准纳米级别扫描。所述物镜驱动装置53包括一维平移台(未图示)以及物镜调整架(未图示)，所述物镜调整架设于所述一维平移台上，所述物镜调整架与所述物镜51连接，用以调整所述物镜51的位置，从而能够保证所述物镜51的定位精度。具体的，所述一维平移台的量程为25mm，其重复定位精度为1.6um，最小步进位移为50nm。可以理解的是，在其他实施例中，所述一维平移台的量程以及其重复定位精度均可根据实际操作情况调整选择。

本实施例中，所述载物台52的位移量程为110mm×75mm，其重复定位精度为0.25um，所述载物台52用于扫描所述样品图像从而得到整个样品的二维图像。可以理解的是，在其他实施例中，所述载物台52的位移量程以及其重复定位精度均可根据实际操作情况调整选择。

本实施例中，当所述物镜51接受所述结构光场L3并聚焦于所述载物台52的样品上时，所述结构光场L3激发出荧光束L4，所述荧光束L4以及激光再次经过所述二向色镜40，所述激光再次被所述二向色镜40反射，而所述荧光束L4则透过所述二向色镜40入射至所述光谱仪60上，以进行分析及分离。

所述光谱仪60将所述荧光束L4进行分析并分离得到光谱以及图像信息。本实施例中，所述光谱仪60的光谱范围为400～700nm，光栅刻线数为600lp/mm，光谱分辨率优于2nm。可以理解的是，在其他实施例中，所述光谱仪60的光谱范围、光栅刻线数以及光谱分辨率均可根据实际操作调整选择。

所述光谱仪60包括第二平面反射镜61、第三透镜62以及入射狭缝63，所述第二平面反射镜61用以反射所述荧光束L4至所述第三透镜62上，所述第三透镜62用以对所述荧光束L4进行聚焦，以使所述荧光束L4聚焦成像于所述入射狭缝63上。本实施例中，所述微反射镜30所在平面、所述样品所在物面、所述入射狭缝63所在平面以及成像器件19所在的像面，四者成互共轭关系。同时，所述样品的物面视场大小与所述入射狭缝63存在线性放大关系。

本实施例中，所述光谱仪60还包括滤光片64，所述滤光片64设于所述第二平面反射镜61以及所述第三透镜62之间，用以进一步滤除所述荧光束L4中的残余激光光谱。

本实施例中，所述光谱仪60还包括球面反射镜65以及平面光栅66，所述球面反射镜65用以对经所述入射狭缝63的荧光束L4进行准直并反射至所述平面光栅66上，经由所述平面光栅66对所述荧光束L4进行荧光光谱色散。通过所述平面光栅66进行光谱色散，从而光谱的波长范围更长，光谱精度较高，并且光谱与像素的线性关系更好。

为了进一步的改进，本实施例中，所述光谱仪60还包括超环面镜67，所述荧光束L4经所述平面光栅66进行荧光光谱色散后，经由所述超环面镜67进行聚焦。此外，所述超环面镜67能够对所述具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统100进行像散与彗差的校正，从而提高所述具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统100的成像性能。

本实施例中，为了便于记录采集光谱与图像信息，所述光谱仪60还包括成像器件68，所述荧光束L4经所述超环面镜67聚焦至所述成像器件68上，经由所述成像器件68进行光谱及图像信息的记录采集。

本发明提供的具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统100通过设置微反射镜30产生结构光场L3，并设置二向色镜40将所述微反射镜30产生的结构光场L3反射至物镜51上，所述物镜51将接收到的所述结构光场L3聚焦于所述载物台52的样品上。通过控制所述载物台52进行一维平移，从而得到不同视场的二维图像，控制所述物镜驱动装置53驱动所述物镜51沿光轴方向运动，从而使得所述物镜51能够进行光轴扫描。

请参阅图4，为本发明的具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统100的成像原理图，所述具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统100的工作模式为光学层析模式。工作时，所述激光发射器10将激光束L1发射至所述扩束光路组件20上，经由所述扩束光路组件20进行散斑抑制以及均匀扩束后，形成照明光束L2，所述照明光束L 2照射在所述微反射镜30上，从而产生结构光场L3，并且该结构光场L3为具有一定周期的一维结构光场。所述结构光场L3经由所述柱透镜80成像于无穷远后，经过所述二向色镜40反射至所述物镜51上并被所述物镜51接受，所述物镜51将所述结构光场L3聚焦于所述载物台52的样品上，并激发出荧光束L4，在所述载物台52上的物面被照明的范围为一块长方形的视场区域。

所述荧光束L4通过所述第二平面反射镜61反射至所述第三透镜62上，并聚焦于所述入射狭缝63成像后，被球面镜65准直反射至平面光栅66上，通过所述平面光栅66进行光谱色散，并经由所述超环面镜67聚焦至所述成像器件68上进行图像信息与光谱的记录与采集，从而得到当前所在光轴扫描层的不同光谱的单色层析图像。。

请一并参阅图3至图5，本实施例中，当所述具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统100的工作模式为光学层析模式时，所述具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统100的操作步骤如下所示：

(1)控制所述微反射镜30顺序加载三幅不同相位的结构光场，并使得结构光场分布方向与所述物面长方形视场的宽度方向一致，如图3所示。

(2)采用CCD相机(未图示)同时采集对应的三幅不同相位的所述结构光场的二维光谱图以及

(3)在所述CCD相机第三次将所述光谱图读出的时间内，同时控制载物台52进行一维平移，并切换聚焦于所述入射狭缝63的样品像，即切换下一视场进入所述入射狭缝63。

(4)所述微反射镜30、成像组件68与载物台52的同步时序图如图5所示。重复以上过程，可以得到一组不同视场的二维光谱图像，通过对采集的不同视场的所述二维光谱图像重建可以得到不同光谱的单色二维图像组，再利用以下公式进行图像运算后可以得到样品的不同光谱的单色层析图像。

$>I_{\mathrm{RE}}=\sqrt{{\left(I_{{1\lambda }_i}{-I_{2\lambda }}_i\right)}^2+{(I_{{2\lambda }_i}-I_{{3\lambda }_i})}^2+{(I_{{3\lambda }_i}-I_{{1\lambda }_i})}^2}$>

其中，I_RE表示的是重建后的光谱。

(5)控制所述物镜驱动装置53驱动所述物镜51沿其光轴方向运动，并重复上述(1)～(4)的步骤，从而能够获得当前扫描层样品不同光谱的单色层析图像。

(6)重复上述(1)～(5)的步骤，能够得到不同层样品对应的不同光谱的单色层析图像，即四维图像信息组。

本发明实施例提供的具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统通过设置微反射镜来产生一维结构光场，同时设置二向色镜、物镜、物镜驱动装置以及载物台，通过二向色镜将结构光场反射至物镜上并被物镜接受，物镜将该结构光场聚焦于载物台的样品上，并激发出荧光，通过控制载物台进行一维平移，得到不同视场的二维图像，控制物镜驱动装置驱动物镜沿光轴方向运动，使得物镜能够进行光轴扫描。荧光束通过光谱仪进行分析并分离。通过控制载物台进行图像视场切换，物镜驱动装置进行物镜光轴扫描，以及光谱仪进行荧光光谱色散，最终可得到样品结构的三维图像以及对应的一维光谱信息。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。