荧光显微筛检生长快和油脂高的微藻单细胞的方法

摘要

本发明涉及生物质能利用技术，旨在提供荧光显微筛检生长快和油脂高的微藻单细胞的方法。该荧光显微筛检生长快和油脂高的微藻单细胞的方法包括步骤：取微藻液体进行单细胞分离，然后进行扩大培养，获得许多株单细胞藻液，再将单细胞藻液接种至96孔板培养至稳定期后，筛选出生长速率快的优势微藻单细胞，用尼罗红荧光染料Nile/DMSO染色后，计算藻细胞的油脂含量，从而筛选出油脂含量高的优势微藻单细胞。本发明能够在10分钟左右对96孔板的藻细胞快速筛检出生长速率快和油脂含量高的优势藻株，大大提高了筛选目标藻株的工作效率，减少了劳动时间成本。

说明书

技术领域

本发明是关于生物质能利用技术，特别涉及荧光显微筛检生长快和油脂高的微藻单 细胞的方法。

背景技术

微藻对太阳能利用效率高、生长繁殖迅速、对环境的适应能力强、油脂产量高。据 报道微藻的光合作用转化效率理论值可达10％，在单位面积上每年油脂产量可达棕榈油 产量的8～24倍(Hu et al.,2008)。Chisti(Chisti,2007)建立数学模型计算得到微藻生物柴油 是取代石化油的重要选择，Cheng等人发现核辐射诱变可以显著提高小球藻的生长速率 和生物质密度(Cheng et al.,2013a)。Khozin等人综述了缺氮条件下硅藻油脂合成中基因 的表达情况(Khozin-Goldberg and Cohen,2011)，Mock等人(Mock et al.,2008)发现在缺硅 条件下硅藻Thalassiosira pseudonana有75对基因诱导。但是微藻生长速率与其富集油脂 之间存在相互矛盾，当绝大多数微藻达到最高的生长速率时，其细胞中油脂含量往往比 较低；而人为控制细胞生长的宏观条件(温度、光照、pH、氮源、碳源等)使微藻细胞 内油脂含量增加时，其细胞的生长速率以及微藻对于太阳能的转化效率则会明显降低。 国外一些主要的研发机构都将高产油藻株的种质创新列为整个微藻产油系统工程中的 首要位置，故如何获得生长速率快、油脂含量高的优势藻种是关键问题。

传统测量微藻生长速率的方法是将藻细胞接种后扩大培养数日，然后过滤脱水和烘 干测量单位体积藻液中的生物质密度。但是该方法费时费力成本较高，尤其是对于大量 筛检核诱变后的成千上万个藻种突变体时，往往因工作量过于庞大而难以完成全部筛检 任务。例如将菱形藻液(含有藻细胞约6.7×10⁵个/mL)在100Gy的γ射线下进行核辐射 诱变，由于藻细胞致死率约为60％，故至少会产生2.7×10⁵个/mL突变单细胞活体。利 用荧光显微镜自动移位对焦的电子控制载物台新技术、以及配套的CCD相机在白光条件 下对大量藻细胞进行自动扫描拍摄，通过辨别藻细胞颜色进行定量化数据分析则有希望 高速筛选出生长速率快的藻细胞，而目前关于这方面的研究报道还比较少。

尼罗红染色利用荧光定量检测细胞内油脂含量由Greenspan最早提出(Greenspan et  al.,1985)，此方法的准确性已在多种生物中被证实(Genicot et al.,2005；Huang et al., 2009)，可代替传统的称重法对细胞内油脂含量进行监测。由于尼罗红在水中很快发生 荧光淬灭，多余的染料无需清除，与苏丹黑、尼罗蓝-A等染料比较，尼罗红能够准确 地将细胞内脂类物质与其他贮藏物区分开来(Kranz et al.,1997)，经常被用于检测动物以 及微生物细胞内油脂情况。故利用尼罗红与油脂成分结合后在荧光显微镜下发出荧光的 特性，建立一套利用荧光显微测量藻细胞生长过程中的油脂含量，是一种快速筛检高产 油藻种的高效可行方法。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种荧光显微筛检生长快和油 脂高的微藻单细胞的方法。为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：

提供荧光显微筛检生长快和油脂高的微藻单细胞的方法，具体包括下述步骤：

(1)取5μL微藻液体接种至固体平板培养基进行单细胞分离，将藻细胞取出接种 到20mL培养基，放入三角瓶扩大培养，获得许多株单细胞藻液；

(2)用96孔板接种300μL单细胞藻液，初始接种pH调至8～9，在恒温20～30℃、 光照强度5000～7000lux、光照24h条件下培养至稳定期；将96孔板置于荧光显微镜自 动移位对焦的电子控制载物台上，利用显微镜配套的CCD相机在白光条件下对96孔板 中每孔的藻细胞进行自动扫描拍摄，利用显微镜图像处理软件通过拍摄的显微镜图像对 每孔藻细胞的颜色进行定量化数据分析，筛选出生长速率快(生长速率≥0.4g/L·d)的 优势微藻单细胞(由于藻细胞密度越大时颜色越深则表明生长速率越快，从而能够筛选 出生长速率快的优势微藻单细胞)；

(3)用0.1g/L的尼罗红荧光染料Nile/DMSO对步骤(2)中筛选得到生长速率快 的微藻单细胞进行染色，尼罗红荧光染料终浓度达到0.1mg/L，染色时间7min；将染色 藻细胞置于荧光显微镜的载物台上，在EX 450-490nm波长下结合图像处理软件观察测 量藻细胞的荧光强度，测量视野中所有藻细胞的面积以及细胞内所有油滴的面积，计算 藻细胞的油脂含量，从而筛选出油脂含量高(油脂含量≥40％)的优势微藻单细胞；

油脂含量的计算方法为：

油脂含量其中A_C为藻细胞的面积总和(μm²)，A_L为细胞中油 脂颗粒的面积总和(μm²)。

本发明中，所述培养基的组分及配比关系为：0.15g NaHCO₃、0.02g KH₂PO₄、0.027g  VB₁、1.5×10-6g VB₁₂、0.2g Na₂SiO₃·9H₂O、1.0g NaNO₃、0.0005g Biotin、1mL微量元 素和980mL人工海水。

本发明中，所述微量元素的组分及配比关系为：1000mL蒸馏水中含有4.35g  Na₂EDTA、7.3mg Na₂MoO₄·2H₂O、12mgCoCl₂·6H₂O、3.9g FeC₆H₅O₇·5H₂O、10mg  CuSO₄·5H₂O、23mg ZnSO₄、178mg MnCl₂·4H₂O和600mg H₃BO₃。

本发明中，所述人工海水的组分及配比关系为(盐度＝3.0％)：1000mL蒸馏水中含 有21.2157g NaCl、3.407g Na₂SO₄、0.3577g KCl、9.3042g MgCl₂·6H₂O、1.3044g  CaCl₂、0.0862g KBr、0.0226g H₃BO₃、0.2760g NaF和0.0219g SrCl₂·6H₂O。

本发明中，所述微藻液体中的藻种是下述任意一种：从自然环境中筛选得到的天然 藻种、物理化学诱变得到的藻种突变体或经过基因改良得到的转基因藻种。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

利用荧光显微镜自动移位对焦的电子控制载物台和尼罗红染色技术，在白光条件下 定量分析藻细胞的颜色数据筛选出生长速率快的藻细胞，然后根据藻细胞及油滴的荧光 强度测量计算出油脂含量，从而能够在10分钟左右对96孔板的藻细胞快速筛检出生长 速率快(≥0.4g/L·d)和油脂含量高(≥40％)的优势藻株，大大提高了筛选目标藻株的 工作效率，减少了劳动时间成本。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：

如图1所示一种荧光显微筛检生长快和油脂高的微藻单细胞的方法，具体包括下述 步骤：

(1)取5μL微藻液体接种至固体平板培养基进行单细胞分离，所述微藻液体的藻 种包括从自然环境中筛选得到的天然藻种、物理化学诱变得到的藻种突变体、经过基因 改良得到的转基因藻种。将藻细胞取出接种到20mL培养基，放入三角瓶扩大培养。

所述培养基的组分及配比关系为：0.15g NaHCO₃、0.02g KH₂PO₄、0.027g VB₁、 1.5×10^-6g VB₁₂、0.2g Na₂SiO₃·9H₂O、1.0g NaNO₃、0.0005g Biotin、1mL微量元素和980mL 人工海水。所述微量元素组分及配比关系为：1000mL蒸馏水中含有4.35g Na₂EDTA、 7.3mg Na₂MoO₄·2H₂O、12mgCoCl₂·6H₂O、3.9g FeC₆H₅O₇·5H₂O、10mg CuSO₄·5H₂O、 23mg ZnSO₄、178mg MnCl₂·4H₂O和600mg H₃BO₃。所述人工海水配方(盐度＝3.0％) 为：1000mL蒸馏水中含有21.2157g NaCl、3.407g Na₂SO₄、0.3577g KCl、9.3042g  MgCl₂·6H₂O、1.3044g CaCl₂、0.0862g KBr、0.0226g H₃BO₃、0.2760g NaF和0.0219g SrCl₂·6H₂O。

(2)用96孔板接种300μL单细胞藻液，初始接种pH调至8～9，在恒温20～30℃、 光照强度5000～7000lux、光照24h条件下培养至稳定期；将96孔板置于荧光显微镜自 动移位对焦的电子控制载物台上，利用显微镜配套的CCD相机在白光条件下对96孔板 中每孔的藻细胞进行自动扫描拍摄，利用显微镜图像处理软件对每孔藻细胞的颜色进行 定量化数据分析。由于藻细胞密度越大时颜色越深则表明生长速率越快，从而能够筛选 出生长速率快(≥0.4g/L·d)的优势微藻单细胞；

(3)用0.1g/L的尼罗红荧光染料Nile/DMSO对筛选得到生长速率快的微藻单细胞 进行染色，尼罗红荧光染料终浓度达到0.1mg/L，染色时间7min；将染色藻细胞置于荧 光显微镜的载物台上，在EX 450-490nm波长下结合图像处理软件观察测量藻细胞的荧 光强度，测量视野中所有藻细胞的面积以及细胞内所有油滴的面积，计算藻细胞的油脂 含量，从而筛选出油脂含量高(≥40％)的优势微藻单细胞；

油脂含量的计算方法为：

油脂含量其中A_C为藻细胞的面积总和(μm²)，A_L为细胞中油 脂颗粒的面积总和(μm²)。

下面的实施例可以使本专业的专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式 限制本发明。

实施例1

(1)取5μL菱形藻液体接种至固体平板培养基进行单细胞分离，将藻细胞取出接 种到20mL培养基，放入三角瓶扩大培养。

所述培养基的组成为：0.15g NaHCO₃、0.02g KH₂PO₄、0.027g VB₁、1.5×10^-6g VB₁₂、 0.2g Na₂SiO₃·9H₂O、1.0g NaNO₃、0.0005g Biotin、1mL微量元素和980mL人工海水； 所述微量元素主要成分为：1000mL蒸馏水中含有4.35g Na₂EDTA、7.3mg  Na₂MoO₄·2H₂O、12mgCoCl₂·6H₂O、3.9g FeC₆H₅O₇·5H₂O、10mg CuSO₄·5H₂O、23mg  ZnSO₄、178mg MnCl₂·4H₂O和600mg H₃BO₃。所述人工海水配方(盐度＝3.0％)为： 1000mL蒸馏水中含有21.2157g NaCl、3.407g Na₂SO₄、0.3577g KCl、9.3042g  MgCl₂·6H₂O、1.3044g CaCl₂、0.0862g KBr、0.0226g H₃BO₃、0.2760g NaF和0.0219g SrCl₂·6H₂O。

(2)用96孔板接种300μL单细胞藻液，初始接种pH调至8，在恒温20℃、光照 强度5000lux、光照24h条件下培养至稳定期。将96孔板置于荧光显微镜自动移位对焦 的电子控制载物台上，利用显微镜配套的CCD相机在白光条件下对96孔板中每孔的藻 细胞进行自动扫描拍摄，利用显微镜图像处理软件对每孔藻细胞的颜色进行定量化数据 分析。由于藻细胞密度越大时颜色越深则表明生长速率越快，从而能够筛选出生长速率 快(0.42g/L·d)的优势微藻单细胞。

(3)用尼罗红荧光染料(0.1g/L,Nile/DMSO)对筛选得到生长速率快的微藻单细 胞进行染色(尼罗红终浓度0.1mg/L，染色时间7min)，将染色藻细胞置于荧光显微镜 的载物台上，在EX 450-490nm波长下结合图像处理软件观察测量藻细胞的荧光强度， 测量视野中所有藻细胞的面积以及细胞内所有油滴的面积，计算藻细胞的油脂含量，从 而筛选出油脂含量高(47％)的优势微藻单细胞。油脂含量计算方法为：

油脂含量其中A_C为藻细胞的面积总和(μm²)，A_L为细胞中油 脂颗粒的面积总和(μm²)。

实施例2

(1)取5μL小球藻液体接种至固体平板培养基进行单细胞分离，将藻细胞取出接 种到20mL培养基，放入三角瓶扩大培养。

所述培养基的组成为：0.15g NaHCO₃、0.02g KH₂PO₄、0.027g VB₁、1.5×10^-6g VB₁₂、 0.2g Na₂SiO₃·9H₂O、1.0g NaNO₃、0.0005g Biotin、1mL微量元素和980mL人工海水； 所述微量元素主要成分为：1000mL蒸馏水中含有4.35g Na₂EDTA、7.3mg  Na₂MoO₄·2H₂O、12mgCoCl₂·6H₂O、3.9g FeC₆H₅O₇·5H₂O、10mg CuSO₄·5H₂O、23mg  ZnSO₄、178mg MnCl₂·4H₂O和600mg H₃BO₃。所述人工海水配方(盐度＝3.0％)为： 1000mL蒸馏水中含有21.2157g NaCl、3.407g Na₂SO₄、0.3577g KCl、9.3042g  MgCl₂·6H₂O、1.3044g CaCl₂、0.0862g KBr、0.0226g H₃BO₃、0.2760g NaF和0.0219g SrCl₂·6H₂O。

(2)用96孔板接种300μL单细胞藻液，初始接种pH调至8.5，在恒温25℃、光 照强度6000lux、光照24h条件下培养至稳定期。将96孔板置于荧光显微镜自动移位对 焦的电子控制载物台上，利用显微镜配套的CCD相机在白光条件下对96孔板中每孔的 藻细胞进行自动扫描拍摄，利用显微镜图像处理软件对每孔藻细胞的颜色进行定量化数 据分析。由于藻细胞密度越大时颜色越深则表明生长速率越快，从而能够筛选出生长速 率快(0.84g/L·d)的优势微藻单细胞。

(3)用尼罗红荧光染料(0.1g/L,Nile/DMSO)对筛选得到生长速率快的微藻单细 胞进行染色(尼罗红终浓度0.1mg/L，染色时间7min)，将染色藻细胞置于荧光显微镜 的载物台上，在EX 450-490nm波长下结合图像处理软件观察测量藻细胞的荧光强度， 测量视野中所有藻细胞的面积以及细胞内所有油滴的面积，计算藻细胞的油脂含量，从 而筛选出油脂含量高(58％)的优势微藻单细胞。油脂含量计算方法为：

油脂含量其中A_C为藻细胞的面积总和(μm²)，A_L为细胞中油 脂颗粒的面积总和(μm²)。

实施例3

(1)取5μL微拟球藻液体接种至固体平板培养基进行单细胞分离，将藻细胞取出 接种到20mL培养基，放入三角瓶扩大培养。

所述培养基的组成为：0.15g NaHCO₃、0.02g KH₂PO₄、0.027g VB₁、1.5×10^-6g VB₁₂、 0.2g Na₂SiO₃·9H₂O、1.0g NaNO₃、0.0005g Biotin、1mL微量元素和980mL人工海水； 所述微量元素主要成分为：1000mL蒸馏水中含有4.35g Na₂EDTA、7.3mg  Na₂MoO₄·2H₂O、12mgCoCl₂·6H₂O、3.9g FeC₆H₅O₇·5H₂O、10mg CuSO₄·5H₂O、23mg  ZnSO₄、178mg MnCl₂·4H₂O和600mg H₃BO₃。所述人工海水配方(盐度＝3.0％)为： 1000mL蒸馏水中含有21.2157g NaCl、3.407g Na₂SO₄、0.3577g KCl、9.3042g  MgCl₂·6H₂O、1.3044g CaCl₂、0.0862g KBr、0.0226g H₃BO₃、0.2760g NaF和0.0219g SrCl₂·6H₂O。

(2)用96孔板接种300μL单细胞藻液，初始接种pH调至9，在恒温30℃、光照 强度7000lux、光照24h条件下培养至稳定期。将96孔板置于荧光显微镜自动移位对焦 的电子控制载物台上，利用显微镜配套的CCD相机在白光条件下对96孔板中每孔的藻 细胞进行自动扫描拍摄，利用显微镜图像处理软件对每孔藻细胞的颜色进行定量化数据 分析。由于藻细胞密度越大时颜色越深则表明生长速率越快，从而能够筛选出生长速率 快(0.56g/L·d)的优势微藻单细胞。

(3)用尼罗红荧光染料(0.1g/L,Nile/DMSO)对筛选得到生长速率快的微藻单细 胞进行染色(尼罗红终浓度0.1mg/L，染色时间7min)，将染色藻细胞置于荧光显微镜 的载物台上，在EX 450-490nm波长下结合图像处理软件观察测量藻细胞的荧光强度， 测量视野中所有藻细胞的面积以及细胞内所有油滴的面积，计算藻细胞的油脂含量，从 而筛选出油脂含量高(52％)的优势微藻单细胞。油脂含量计算方法为：

油脂含量其中A_C为藻细胞的面积总和(μm²)，A_L为细胞中油 脂颗粒的面积总和(μm²)。

最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于 以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接 导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。