检测金鱼造血器官坏死病病毒的试剂盒及其应用

摘要

本发明提供了用于检测金鱼造血器官坏死病病毒试剂盒。本发明首先提供了用于检测金鱼造血器官坏死病病毒的实时荧光定量PCR引物和探针，其序列分别如SEQ？ID？NO2，SEQ？ID？NO3和SEQID？NO4所示。本发明还提供了使用上述引物和探针进行荧光定量PCR检测金鱼造血器官坏死病病毒的方法。本发明的检测方法及其检测试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测金鱼造血器 官坏死病病毒的荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该引 物和探针进行金鱼造血器官坏死病病毒检测的方法和试剂盒。

背景技术

金鱼造血器官坏死病病毒(goldfish haematopoietic necrosis virus, GFHNV)，也称为鲤疱疹病毒-2(cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)， 是金鱼造血器官坏死病(goldfish haematopoietic necrosis，GFHN)的 病原，是一种感染金鱼(Carassius auratus)、鲫(Carassius auratus) 及其变种的高致病性双链DNA病毒。该病毒曾在日本、澳大利亚、新 西兰、英国、匈牙利及我国台湾爆发疫病，发病金鱼死亡率可达100％。

目前，国内外缺乏对GFHNV敏感的细胞系以及抗GFHNV的抗体, 因此无法使用病毒分离和免疫学方法检测该病毒。对该病毒的检测方 法的研究主要集中于建立分子生物学检测方法检测病毒核酸，包括 PCR方法、荧光定量PCR方法和环介导等温扩增技术(LAMP)检测方 法。

目前报道的针对GFHNV的PCR检测方法，其检测限低于荧光定 量PCR检测方法和LAMP检测方法，而且需要对扩增产物进行凝胶电 泳才能观察结果，易造成溴化乙锭污染；LAMP检测方法如果反应时 间过长，容易产生假阳性，且由于产物过多，也容易造成核酸污染； 目前报道的某些荧光定量PCR检测方法不稳定，检测结果有时会产生 假阴性。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测金鱼造血器官坏死病病毒的特 异性引物和探针。

本发明的另一个目的在于提供检测金鱼造血器官坏死病病毒的 荧光定量PCR方法及其试剂盒。

为实现上述目的，本发明对已知金鱼造血器官坏死病病毒特异 基因的DNA序列进行比对，筛选出金鱼造血器官坏死病病毒基因的 特异序列，即GFHNV主衣壳蛋白(MCP)基因中一段保守序列 (2307-2464)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供用于检测金鱼造血器官坏死病病毒上述特异序列的 引物，以及与所述引物配合使用的荧光探针。其中，探针5’标记荧光 基团FAM，3’标记TAMRAN。该特异引物扩增产物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为：

上游引物：CAAACCCAGCACCGTCAGATGGT(SEQ ID NO.2)

下游引物：ATCCGGCACAGGTGGCGTGT(SEQ ID NO.3)。

荧光探针序列为：

5’-FAM-TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAG-TAMRAN (SEQ ID NO.4)。

本发明提供了上述引物和荧光探针在制备检测金鱼造血器官坏 死病病毒试剂盒中的应用。

本发明提供一种金鱼造血器官坏死病病毒的实时荧光定量PCR 检测方法，包括以样品总DNA为模板，利用本发明提供的引物和探 针进行实时荧光定量PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据 扩增曲线判定结果。

本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为25μL反应体 系时，其优选配置为：

本发明的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性3min， 1个循环；95℃变性30s，55～65℃退火30s，40个循环。

本发明优选的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性 3min，1个循环；95℃变性30s，59℃退火30s，40个循环。

本发明每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两 种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

Ct值≤38.0时样品结果为阳性；Ct值＞38.0的样品结果为阴性。

本发明提供了一种用于金鱼造血器官坏死病病毒检测的试剂盒， 其包括上述能特异地扩增出如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或其特异 性片段的引物以及配合引物使用的Taqman探针。

本发明试剂盒的所用引物序列为：

上游引物：CAAACCCAGCACCGTCAGATGGT(SEQ ID NO.2)

下游引物：ATCCGGCACAGGTGGCGTGT(SEQ ID NO.3)。

荧光探针序列为：

5’-FAM-TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAG-TAMRAN (SEQ ID NO.4)。

本发明提供的试剂盒，还包括DNA裂解液，荧光定量反应液， 阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为金 鱼造血器官坏死病病毒基因组DNA。

本发明提供了用于检测金鱼造血器官坏死病病毒的特异性引物 和探针，建立了检测金鱼造血器官坏死病病毒的荧光定量PCR方法， 具有很高的检测灵敏度，可以检测到100个拷贝的金鱼造血器官坏 死病病毒DNA；该方法特异性强，其重复性好，可作为检测临床标 本的手段，提高金鱼造血器官坏死病病毒检测的阳性率，操作简单， 检测过程仅需90分钟，大大缩短检测周期，检测结果使用荧光定量 PCR仪直接观察，不存在溴化乙锭污染的问题。本发明提供的检测 试剂盒，其反应体系包含了上述引物、探针和阴性、阳性对照，该 试剂盒的推广应用将为防治和监测金鱼造血器官坏死病病毒病提供 技术支持。

附图说明

图1为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR特异性评价，图 中曲线为金鱼造血器官坏死病病毒的反应曲线；

图2为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR检测限测定(1)， 图中4-10号曲线，分别依次对应DNA模板量为10⁴拷贝-10¹⁰拷贝 的反应体系扩增出的反应曲线。

图3为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR标准曲线(1)

图4为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR检测限测定(2)， 图中1-5号曲线，分别依次对应DNA模板量为10¹拷贝-10⁵拷贝的 反应体系扩增出的反应曲线。

图5为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR标准曲线(2)

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明 的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步 骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。

实施例1金鱼造血器官坏死病病毒特异性引物和探针的设计

对已知金鱼造血器官坏死病病毒特异基因的DNA序列进行比 对，筛选出金鱼造血器官坏死病病毒基因的特异序列，即GFHNV 主衣壳蛋白(MCP)基因中一段保守序列(2307-2464)，其核苷酸 序列如SEQ ID NO.1所示。设计引物与探针时，注意避开序列的突 变点，经反复筛选和验证，得到一对用于检测金鱼造血器官坏死病 病毒的荧光定量PCR引物和与引物配合使用的探针，

上游引物：CAAACCCAGCACCGTCAGATGGT(SEQ ID NO.2)

下游引物：ATCCGGCACAGGTGGCGTGT(SEQ ID NO.3)。

荧光探针序列为：

5’-FAM-TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAG-TAMRAN (SEQ ID NO.4)。

实施例2检测金鱼造血器官坏死病病毒的荧光定量PCR检测方法 的建立

1、作为阳性对照的重组质粒构建。

将目的基因连接入T载体，连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受 态细胞，通过蓝白斑技术筛选重组质粒。使用商业化质粒提纯试剂盒 提纯重组质粒。

每组样品都设立1个阳性对照样品和阴性对照样品。阳性对照样品 为上述重组质粒；阴性对照样品为去离子水。

2、根据Ct值和荧光信号的强弱来判断优化条件，把最佳的条 件组合起来作为最终的优化体系。

退火温度从55℃～65℃之间进行优化；mg²⁺浓度在1.5～5mM之 间进行优化；dNTPs浓度在2～5.8mM之间进行优化。最终确定的金 鱼造血器官坏死病病毒荧光定量25μL PCR反应体系见表1：

表1 金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR反应体系

3、实时荧光定量PCR反应条件

同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。

4、反应结束后，根据荧光定量PCR仪显示图片判断检测结果：

阴性样品没有扩增曲线出现，阳性样品有明显扩增曲线，且Ct 值小于25。此时阴性对照和阳性对照都成立，可以对待测样品起对照 作用；若待测样品扩增曲线Ct值小于或等于38，则说明样品为GFHNV 核酸阳性；若待测样品无扩增曲线，或扩增曲线Ct值大于38，则样品 为GFHNV核酸阴性。

实施例3金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR检测方法的特性 评价

1、灵敏度评价，灵敏度即real-time PCR的最低检测限。

阳性参考DNA原液浓度为10¹⁰copies/μL。先将其10倍梯度稀 释至10copies/μL，再分别以每个稀释度的溶液为模板，采用本发 明实施例2建立的荧光定量PCR方法进行扩增，确定该方法最低可 以检测到的模板量。根据检测结果，该荧光定量PCR方法最低可检 测到100个拷贝的DNA模板。

2、特异度评价。

采用本发明实施例2建立的荧光定量PCR方法，对金鱼造血器 官坏死病毒、锦鲤疱疹病毒(KHV)、传染性造血器官坏死病毒 (EHNV)、中华鳖虹彩病毒(STIV)、斑点叉尾鮰病毒(CCV)和 对虾白斑病病毒(WSSV)等水产病毒进行检测，结果见图1。图1 显示只有GFHNV样品(箭头所指)有曲线，其他病毒DNA无曲线， 说明本发明方法对KHV、EHNV、STIV、CCV和WSSV无交叉反 应，对金鱼造血器官坏死病病毒检测结果呈现阳性。说明本发明方 法具有优异的特异性。

实施例4检测金鱼造血器官坏死病病毒的临床应用

1、待捡样品DNA的提取

待检的病金鱼，取肝、脾、肾、脑和鳃。

将鱼组织混合，研磨成糊状后，使用酚氯仿或商业化组织DNA 提取试剂盒，提取样品总DNA。

将提取的总DNA作为模板，使用本发明实施例2的GFHNV荧光定 量PCR检测方法检测是否感染GFHNV。

2、采用传统的PCR方法检测GFHNV对上述待检样品进行验证。 引物序列：上游引物：CCCAGCAACATGTGCGACGG；下游引物： CCGTARTGAGAGTTGGCGCA；目的基因长度362bp。

结果显示该传统方法的检测结果与本发明实施例2建立的 GFHNV荧光定量PCR检测方法检测的阳性结果与阴性结果均相一 致，说明本发明建立的GFHNV荧光定量PCR检测方法具有较高准确 率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了 详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这 对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。