一种来自人辅助生殖胚胎发育早期出生安全性预测的试剂盒

摘要

本发明公开了一种在人辅助生殖胚胎发育早期进行出生安全性预测的试剂盒。本发明所公开的在人辅助生殖胚胎发育早期进行出生安全性预测的试剂盒，包括用于检测人辅助生殖囊胚植入人体后胚胎发育早期的胎盘中表1所示的1593个基因的表达量的产品。如果人辅助生殖囊胚植入人体后胚胎发育早期胎盘的所述1593个基因中各个基因的表达量均是人自然妊娠的胚胎发育早期胎盘的所述1593个基因中同一种基因的表达量的两倍以上或二分之一倍以下，预示所述人辅助生殖囊胚将正常发育和孕妇正常分娩。

说明书

技术领域

本发明涉及一种来自人辅助生殖胚胎发育早期出生安全性预测的试剂盒。

背景技术

辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology，ART)的安全性一直广受关注。 辅助生殖技术是采用人工技术将精子和卵子在体外环境受精，然后移植到母体子宫继续妊娠。 由于药物应用、体外操作和体外培养，使得受精卵发育过程受到影响，并最终影响到新生儿 出生安全。近年多项流行病学调查研究显示ART可能造成不良的妊娠结局，流行病学调查显 示，在排除不孕疾病因素之后，即使采用单胎移植，辅助生殖技术仍然可能造成不良妊娠结 局，包括：流产、早产、低出生体质量儿、先兆子痫等，辅助生殖围产期胎儿与孕妇发病率 和死亡率高于自然妊娠。2005年Shevell等对1222例单纯促排卵治疗、554例IVF-ET妊娠 以及34286例自然妊娠出生单胎的妊娠结局进行分析，发现当匹配年龄、种族、教育程度、 BMI、吸烟史以及既往早产史之后，辅助生殖技术明显增加先兆子痫、前置胎盘、胎盘早剥 等胎盘发育相关的妊娠合并症风险。2013年Pinborg提出辅助生殖中单胎移植的妊娠结局如 何？并对单胎移植妊娠结局进行meta分析，发现即使排除多胎移植的影响，辅助生殖单胎 移植的妊娠结局与自然妊娠单胎相比较仍然较差，包括早产、胎儿宫内发育迟缓、低体重儿、 先兆子痫等发病率较高，可能与使用卵巢刺激药物和生殖细胞体外操作有关，而深入的病理 生理机制不清楚。2013年Michele对欧洲辅助生殖妊娠结局数据进行分析，特别之处在于将 单胎和多胎移植的妊娠结局分别独立进行分析，发现按照其定义的不良妊娠结局范围，单胎 移植的不良妊娠结局发生率是32％，而不孕疾病因素虽然重要，但并不是这些不良结局的主 要因素，ART增加孕母和子代不良健康风险的发生机制尚不清楚。学者们争论的焦点在于ART 风险性增高到底是由于不孕患者不孕背景引起还是由ART技术引起。因此，对ART安全性的 研究已成为临床生殖医学研究的热点。

围生期母婴的病理结局与胎盘功能有着密切的关联。胎盘作为妊娠期连接母胎的独特器 官，具有重要的功能：(1)在母亲和胎儿异体移植物之间提供一个免疫界面；(2)在母胎间 构建一个营养、代谢废物转运平台；(3)作为产生多种多肽和甾体类激素的来源，通过这些 多肽和甾体激素来影响胎儿、胎盘以及母亲的相关代谢和发育。胎盘维系正常妊娠，和孕母 和子代的围产期和远期安全密切相关。妊娠期缺氧状态被认为是影响胎盘形态和功能的最关 键因素。子宫胎盘血流量减少、宫内氧气供应和营养状态下降等因素，可能改变胎盘滋养层 细胞的生物学特性，造成胎盘结构、功能改变。在这种情况下，胎盘通过改变相关蛋白表达 或相关基因表观遗传修饰来适应这些改变，满足胎儿发育需求，发挥其代偿功能。一旦胎盘 结构和功能出现异常超过自身代偿能力，就可能引起一系列不良结局，不仅会导致多种妊娠 合并症的发生，如先兆子痫(Preeclampsia,PE)、妊娠期糖尿病(Gestaional diabetes  mellitus,GDM)、胎儿宫内生长受限(Fetal growth restriction,FGR)等；还会造成宫内 发育的胎儿发生程序性改变引起远期成年阶段各种代谢类疾病如高血压、糖尿病等发病率增 高。所以，辅助生殖安全性的评价可以通过评价胚胎植入后早期胎盘发育实现。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何在人辅助生殖胚胎发育早期进行出生安全性预测。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种在人辅助生殖胚胎发育早期进行出生安全性预 测的试剂盒。

本发明所提供的在人辅助生殖胚胎发育早期进行出生安全性预测的试剂盒，包括用于检 测人辅助生殖囊胚植入人体后胚胎发育早期的胎盘中1593个基因的表达量的产品；所述1593 个基因的ID_REF如表1第1列所示。

上述试剂盒中，所述1593个基因的表达量为采用Human Genome U133Plus 2.0 Array 检测系统得到基因的表达量。

上述试剂盒中，所述胚胎发育早期可为胚胎发育至孕7周±2天的阶段。

上述试剂盒中，所述试剂盒包括记载如下内容的载体：以人辅助生殖囊胚植入人体后胚 胎发育至孕7周±2天阶段内的胎盘作为待检测样品，以人自然妊娠的胎盘发育至孕7周±2 天阶段内的胎盘作为参比样品，检测所述待检测样品和所述参比样品中所述1593个基因表 达量，根据所述待检测样品和所述参比样品中所述1593个基因表达量的差异对所述人辅助 生殖胚胎发育早期进行出生安全性预测。

上述试剂盒中，所述载体还记载有如下内容；如果人辅助生殖囊胚植入人体后胚胎发育 至孕7周±2天阶段内的胎盘的所述1593个基因中各个基因的表达量均是人自然妊娠的胎盘 发育至孕7周±2天阶段内的胎盘的所述1593个基因中同一种基因的表达量的两倍以上或二 分之一倍以下，预示所述人辅助生殖囊胚将正常发育。

上述用于检测来自人辅助生殖胚胎发育早期的胎盘中1593个基因的表达量的产品在制 备上述试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围；所述1593个基因为表1所述的1593个基 因。

上述用于检测来自人辅助生殖胚胎发育早期的胎盘中1593个基因的表达量的产品和上 述的载体在制备上述试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围；所述1593个基因为表1所 述的1593个基因。

上述应用中，所述胚胎发育早期可为胚胎发育至孕7周±2天的阶段。

本发明的主要贡献是，明确人辅助生殖技术对胎盘发育的影响，主要是发现1593个基 因的表达量差异。如果人辅助生殖囊胚植入人体后胚胎发育至孕7周±2天阶段内,其胎盘的 所述1593个基因中各个基因的表达量均是人自然妊娠的胎盘发育至孕7周±2天阶段内的胎 盘的所述1593个基因中同一种基因的表达量的两倍以上或二分之一倍以下，预示所述人辅 助生殖囊胚仍然可以正常发育和孕妇正常分娩。如果人辅助生殖囊胚植入人体后胚胎发育至 孕7周±2天阶段内的胎盘基因表达种类超过所述1593个基因，或者异常表达量超过本文中 公布的范围，预示所述人辅助生殖囊胚将不正常发育，影响儿童健康和出现围产期合并症。 这种可能性就随着辅助生殖胎盘基因表达量超过本文所述1593个基因的差异程度(数量： 多于1593个基因，和表达量：虽然是1593个基因范围内，但是差异表达量超过本文报告的 范围)增加而风险增加，本发明的主要贡献是科学判断移植策略和决策，减少辅助生殖中孕 妇围产期合并症和患病儿童的可能性。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规 生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。 用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理,Student`s，t检验分析各实验数据，p<0.01为差异有 统计学意义。

实施例、

研究时间为2010年至2014年。研究内容和标本收集得到北京大学伦理委员会的允许， 胎盘和胚胎的父亲和母亲均为知情同意的志愿者。研究组样本(共计4个研究样本，即4个 胎盘)为临床收集的人辅助生殖胚胎发育至孕7周±2天阶段的胎盘；对照组样本(共计4 个研究样本，即4个胎盘)为临床收集的自然妊娠的胚胎发育至孕7周±2天阶段的胎盘。

针对进行辅助生殖的妇女，在知情同意的情况下，在胚胎发育至孕7周±2天阶段内， 在B超监视下穿刺吸取胎盘，得到各个胎盘样本(即研究组胎盘样本)，分别命名为胎盘样 本一、胎盘样本二、胎盘样本三和胎盘样本四；针对自然妊娠并自愿进行人工流产的妇女， 在知情同意的情况下，在胚胎发育至孕7周±2天阶段内，在B超监视下穿刺吸取胎盘和胚 胎，得到各个胎盘样本(对照组胎盘样本)，分别命名为胎盘样本五、胎盘样本六、胎盘样 本七和胎盘样本八。研究组和对照组母亲的临床背景(临床背景指的是民族、年龄、初产妇 /经产妇、流产史、孕前BMI；均无系统性疾病、妊娠期合并症、吸烟和酒精依赖；受教育程 度均大于15年)是一对一、两两一致匹配对应的。取各个胎盘样本，提取总RNA，采用Human  Genome U133 Plus 2.0 Array检测系统检测各个胎盘样本mRNA中各个基因的表达量(即各 个基因反转录产物mRNA丰度)。结果表明研究组胎盘样本的所述1593个基因中各个基因的 表达量均是对照组胎盘样本的所述1593个基因中同一种基因的表达量的两倍以上或二分之 一倍以下。

研究组胎盘样本基因的平均相对表达量、对照组胎盘样本基因的平均相对表达量以及两 者的比值见表1。对移植入4个研究样本的四个辅助生殖妇女进行持续追踪回访，四个妇女 均正常分娩，对孩子持续追踪回访至一岁半，孩子各项指标均正常。

表1

注：表1的相对表达量为扣除背景信号的信号值。