一种以非编码RNA Tmevpg1为检测或诊断筛查标志物的重症肌无力检测试剂盒及应用

摘要

本发明公开了一种以非编码RNA？Tmevpg1为检测或诊断筛查标志物的重症肌无力检测试剂盒及应用。该试剂盒通过相对定量的检测重症肌无力患者外周血标本中Tmevpg1的表达水平，用于重症肌无力筛查和诊断。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及以非编码RNA Tmevpg1为检测或诊断筛查标志 物的重症肌无力检测试剂盒及应用。

背景技术

重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是一种由B细胞介导、T细胞依赖、补体参与的 累及神经肌肉接头的自身免疫性疾病，其临床表现为神经肌肉接头(neuromuscular junction, NMJ)传递障碍导致的骨骼肌无力，易疲劳。研究表明抗NMJ处的乙酰胆碱受体 (acetylcholine receptor,AchR)抗体是主要的抗体，另外anti-AchR阴性的全身型MG患者 约40％可anti-MuSK(muscle-specific tyrosine kinase,)抗体阳性，anti-AchR及anti-MuSK 抗体均阴性的全身型MG患者约20％可anti-LRP4(Lipoprotein-Related Protein 4)抗体阳 性。MG的发病机制比较复杂，环境、遗传、激素水平等因素均可参与其发病。CD4⁺T细 胞在MG的发病中起关键作用，一定的诱因下使机体内环境中促炎因子占优势，自身免疫 系统紊乱，免疫耐受被打破，CD4⁺T细胞被激活，Th1,Th2,Th17、Treg亚群比例失衡， 辅助B细胞增殖分化，产生自身抗体，从而破坏神经肌肉接头处的AchR结构或影响其大 量聚集，使神经兴奋性递质无法有效传递，从而产生重症肌无力的临床症状，严重时可 累及呼吸肌危及生命。MG发病率较高，目前仍呈上升趋势，显著影响了患者的生活及生 存质量给个人、家庭和社会带来了沉重的负担。因此，早期预防和筛查重症肌无力疾病 显得十分重要，而目前针对该种疾病的早期预防筛查还没有明显的措施。

LncRNAs(long noncoding RNAs)是长度大于200bp的长链非编码RNA。全基因组 水平非编码DNA序列的研究发现，在人类基因组中大约有10,000～200,000种不同类型 lncRNAs被转录。近年来的研究表明，lncRNAs具有广泛的生物学功能，可通过以下机 制1.募集染色体重塑复合体到特定的基因位点来标记基因沉默区域；2募集转录因子来促 进或抑制基因表达.；3.转录基因的反义链lncRNA可调控转录基因相应mRNAs的剪接或 引导其降解，来参与细胞凋亡、分化、发育等多种重要的调控过程。LncRNAs在免疫系 统中也有着不可忽视的作用，它参与了CD8⁺T细胞的激活与分化，并且随着T细胞的分化 而呈现出动态的变化，对T细胞的发育凋亡起关键作用。研究表明，lncRNAs与人淋巴细 胞白血病、癌症的发生有关，可作为淋巴细胞型白血病易感性的标记物之一。而在重症 肌无力中还没有报道lncRNA作为其发生、预后判断的标志物以及靶点治疗的位点。因此， 项目给予前期非编码RNATmevpg1在重症肌无力中的表达水平，开发一种以lncRNA为基 础的判断重症肌无力发生、以及预后标志物的试剂盒。

Tmevpg1是在免疫系统中第一个被证实的lncRNA,又名IFNG-AS1，研究发现Tmevpg1 位于染色体上编码细胞因子的基因丛中，如INF-γ，IL-22，IL-26，并且包含了整个 IFNG基因的反义链，可以调控INF-γ的基因表达。人Tmevpg1在NK细胞及T淋巴细胞中 均有表达。研究表明，人Tmevpg1的基因表达是Th1细胞选择性的，尤其是效应性Th1 细胞，即受Th1细胞相关转录因子Stat4和T-bet的调控。因此，Tmevpg1在免疫系统中 发挥重要的功能，其异常表达可能参与了免疫性疾病的发生与发展。然而Tmevpg1在重症 肌无力疾病中目前还没有研究报道。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种以非编码RNATmevpg1为检测或诊断筛查 标志物的重症肌无力检测试剂盒。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述以Tmevpg1为检测或诊断筛查标志物的重症肌无力检测试剂盒包括如下引物：

Tmevpg1的实时定量的特异性PCR引物为：

正向引物为：5’-CATGGTACATGTGGGTCCAA-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为：5’-TTAGCAGTTGGTGGGCTTCT-3’(SEQ ID NO.2)；

GAPDH的实时定量的特异性PCR引物为：

正向引物为5’-CTCATGACCACAGTCCATGC-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3’(SEQ ID NO.4)。

上述试剂盒中试剂盒包括本领域提取RNA的常规试剂，如下：淋巴细胞分离液； RNAiso Plus；无水乙醇；三氯甲烷；异丙醇。DEPC水或无酶水。TaKaRa的 PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)。荧光定量PCR荧光染料 SYBR及缓冲液，双蒸水。

上述Tmevpg1的实时定量的特异性PCR引物和GAPDH的实时定量的特异性PCR引物 用于制备重症肌无力检测试剂。

上述长链非编码RNA Tmevpg1用于制备重症肌无力检测或诊断筛查标志物。

发明人已检测了Tmevpg1在25例重症肌无力及10例健康对照组中的表达。结果显示， Tmevpg1在重症肌无力中低表达，与对照相比，p<0.05，具有明显统计学意义(图1)，图 1显示Tmevpg1在重症肌无力患者的外周血单个核细胞中表达下调，这些结果提示 Tmevpg1是重症肌无力诊断、预测、检测或筛查的重要标志物之一，即，Tmevpg1作为其 发生的标志物以及靶点治疗的位点。因此，本发明开发的以Tmevpg1为基础的判断重症肌 无力发生、以及预后标志物的试剂盒具有深远的临床意义和推广性。本发明试剂盒通过 相对定量的检测重症肌无力患者外周血标本中Tmevpg1的表达水平，用于重症肌无力筛查 和诊断。

附图说明

图1是非编码RNATmevpg1在重症肌无力患者外周血单个核细胞中的表达。

具体实施方式 实施例中所用常规试剂均为市售

实施例1

一、RNA提取方法：

(1)用EDTA抗凝采血管采取外周肘静脉血样标本5ml。

(2)3000rpm室温离心10min，小心吸出上层血清。

(3)向剩余的血液样本中加入等体积PBS(1×)液，充分吹打混匀稀释血样；

(4)将上述稀释后的血样靠壁缓慢地加入到另一已加入等体积的淋巴细胞分离液的离 心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上(即两种液体不要混合，保留 清晰的界面)，2400rpm室温离心20min；

(5)用移液枪小心吸取离心后标本中第二层白细胞膜层，装入一新的无酶离心管中， 3000rpm，4℃离心10min，弃上清；

(6)加入1ml PBS(1×)液洗涤白细胞，4℃离心10min，弃上清；

(7)重复步骤6

(8)加入1mlRNAiso plus，吹打溶解细胞至白色絮状物完全消失，室温(15-30℃)静 置5分钟使核蛋白体完全分解(注意：若不继续做完整个提取，震荡后可直接放入-80℃ 冻存)

(9)每1mlRNAiso plus加入200ul氯仿；若为冻存标本，需从-80℃冰箱中取出后在 冰上溶解，剧烈震荡15s(使充分变性)，室温静置5分钟后12000rpm，4℃离心15min， 吸取上清转移到另一新的离心管中；

(10)加入200ul氯仿，重复步骤9

(11)加入与上清液等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后，室温放置30min。

(12)12000rpm，4℃离心10min，小心吸弃上清；

(13)加入1ml的75％乙醇(DEPC水配制)，上下颠倒混匀后；7500rpm，4℃离心5min。

(14)弃上清，室温干燥5-10min，待残余的乙醇挥发完全后，加入适量的DEPC水溶解 RNA沉淀，存于-70℃。用分光光度计测定RNA的浓度。

二、RNA提出质量检测：

(1)ND-1000测定RNA浓度和纯度，

测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零，滴加1.5ul洗涤测量基座的三次，用擦镜纸擦 拭，加1.5ul样本测定RNA的浓度。RNA的质量检测标准之一，260nm/280nm的比值在1.7-2.0 之间为合格样本，样本除了260nm的峰外无明显的杂峰。

(2)琼脂糖凝胶检测RAN的质量

用无酶水配置TAE电泳buffer，配置2％的琼脂糖凝胶，100V的电压电泳，15min,拍照 检测28S、18S和5S的亮度，如果条带出现弥散则为不合格RNA。

三、RNA逆转录方法：

(1)融解lncRNA反转录所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用

(2)去除基因组DNA反应

按表1所示成分于冰上配制反应混合液至总体积10ul

表1

试剂 使用量 5×gDNA Eraser Buffer 2.0ul gDNA Eraser 1.0ul Total RNA 1ug RNase Free dH₂O 补至10ul

上述混匀液配制后混匀，在42℃下反应2min，反应结束后置冰上备用。

(3)lncRNA反转录反应液的配制

在冰上的预冷RNase free的反应管内加入表2所示试剂至总体积25μl

表2

Note:在反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA；Total RNA使用量可在1ng～5 μg之间调整,如使用纯化的小分子RNA，其使用量可在0.1ng～1μg之间调整。RT  Primer是市售反转录反应液自带引物，为oligoT或者是Random。

(4)反转录反应

混匀配制的反应液，短暂离心后在37℃下反应15min，结束后再进行85℃5sec灭 活处理。所得的反转录产物可用无酶水稀释4倍并冰上放置以进行下游qPCR实验。

四、荧光定量PCR检测方法：

(1)融解All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit中的2×All-in-One qPCR mix上 下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。

(2)冰上进行qPCR反应液的配制(所有lncRNA进行复孔测试)，分别分成两份，一 份检测Tmevpg1在样本中的表达，另外一份检测GAPDH在同一个样本中的表达。见表 3。

表3

Note：待所有试剂溶剂彻底溶解后，依次按照顺序加入各种反应试剂于PCR管中，用离 心机“soft”离心，确保所有试剂都在PCR管底部。Tmevpg1 or GAPDH primer F(20uM) 即Tmevpg1的实时定量的特异性PCR正向引物或GAPDH的实时定量的特异性PCR正向引物； Tmevpg1 or GAPDH primer R(20uM)即Tmevpg1的实时定量的特异性PCR反向引物或GAPDH 的实时定量的特异性PCR反向引物。

(3)进行Real Time PCR反应

建议采用表4显示的两步法PCR反应程序

表4

五、结果计算

ΔC_T值的测定：ΔC_T是指同一样本中，待测定Tmevpg1的C_T与内参GAPDH的C_T的差值，即Tmevpg1ΔC_T＝Tmevpg1C_T-GAPDH的C_T，在本发明中，ΔC_T是三个平行试验 中的平均值，如Tmevpg1ΔCT是三个平行实验中Tmevpg1C_T-GAPDH的平均值。在实验 的同时不仅要有待测样本的Tmevpg1ΔC_T，同时还需要检测标准样本(健康对照人)的 Tmevpg1ΔC_T。ΔΔC_T即待测样本的ΔC_T与标准样本的ΔC_T的差值，比如Tmevpg1ΔΔC_T＝待 测样本的Tmevpg1ΔC_T-标准样本Tmevpg1ΔC_T。当ΔΔC_T大于零时，待测样本是重症肌无力 患者。在我们的实验验证结果中，健康对照组的Tmevpg1ΔC_T的平均值在12.39，重症肌 无力患者的Tmevpg1ΔC_T的平均值为14.43，在健康对照组中，90.0％的人的Tmevpg1ΔC_T小于13.0，而在重症肌无力患者组中84.0％以上的病人的ΔC_T值大于13.0。因此，在本发 明所述试剂盒中，建议Tmevpg1ΔC_T值大于13.0存在患重症肌无力的可能。