制备患者特异性胶质母细胞瘤动物模型的方法及其用途

摘要

本发明涉及胶质母细胞瘤小鼠模型的生产方法，包括步骤：(a)将分离自患者的胶质母细胞瘤组织分开成4个或更多部分，从每个部分收集1个或更多碎块；(b)将收集的多个碎块的混合物解离为单细胞形式的胶质母细胞瘤细胞；和(c)将包含在步骤(b)中获得的胶质母细胞瘤细胞的移植物样品原位移植到免疫缺陷小鼠的脑中。本发明还涉及通过该方法生产出的小鼠模型，应用该小鼠模型筛选胶质母细胞瘤的治疗剂的方法；和应用该小鼠模型为选择患者特异性胶质母细胞瘤疗法而提供信息的方法。根据本发明的患者特异性胶质母细胞瘤小鼠模型显示出与亲本肿瘤相同的遗传、形态学和病理学性状，从而使得筛选患者特异性胶质母细胞瘤治疗剂或选择更为安全有效的患者特异性胶质母细胞瘤治疗方法成为可能。

说明书

技术领域

本发明涉及生产胶质母细胞瘤小鼠模型的方法，包括步骤：(a)将分 离自患者的胶质母细胞瘤组织分开成4个或更多部分(sections)，从每个 部分收集1个或更多碎块；(b)将收集的多个碎块的混合物解离为单细胞 形式的胶质母细胞瘤细胞；和(c)将包含在步骤(b)中获得的胶质母细胞 瘤细胞的移植物样品原位移植到免疫缺陷小鼠的脑中；本发明涉及通过该方 法制造出的胶质母细胞瘤小鼠模型；应用该小鼠模型筛选胶质母细胞瘤的治 疗剂的方法；和应用该小鼠模型为患者特异性胶质母细胞瘤疗法的选择提供 信息的方法。

背景技术

神经胶质瘤是在原发脑肿瘤中占约60％的恶性肿瘤，发生率高而且难 以治疗。如此，尚未报道除了放射疗法之外的其他对于神经胶质瘤的有效治 疗方法。在神经胶质瘤中，胶质母细胞瘤(GBM)作为最恶性的类型较之 其他癌对放射疗法和化学疗法有非常高的抵抗性，因而胶质母细胞瘤确诊后 的预期寿命仅有一年。然而，就脑肿瘤来说，治疗药物的递送由于血-脑屏 障的存在而不简单。特别地，因为对于脑神经生物学的了解不足，导致对治 疗剂的开发进展缓慢。进一步地，胶质母细胞瘤相比于其他脑肿瘤表现出浸 润性变异，因此如果不在短期内采取治疗可在数星期内致死。除外科手术治 疗外，对胶质母细胞瘤的治疗还有放射疗法和化学疗法。然而，化学疗法由 于抗性突变体的出现、由肿瘤干细胞导致的复发等已达到其局限性，因此需 要开发新的疗法。

最近几年中，随着系统生物学和生物信息学工具的迅猛发展，已经报道 了被认为与胶质母细胞瘤发生和进展相关的遗传缺陷和基因表达模式。然 而，可以表示临床结果的分子标记的筛选仍然不足。特别地，基因表达分析 在转录水平执行，因此不能反映在实际肿瘤组织中的蛋白表达水平。作为解 决该问题的方法，已提出了最佳模拟胶质母细胞瘤的动物模型的应用。该动 物模型可以被应用于研究胶质母细胞瘤的发生和进展。进一步地，其可被应 用于考察对于胶质母细胞瘤的新的治疗策略和研究已有治疗策略的适当联 用。此外，其还被预期应用于检查对于胶质母细胞瘤显示出有治疗效果的新 抗肿瘤物质的效果。

相应地，诸如裸鼠的免疫受损模型动物已被使用，或已经积极地进行研 究以开发胶质母细胞瘤诱导的动物模型。例如，有报道通过移植人胶质母细 胞瘤产生动物模型(Diao Yi等人,Cancer Investigation,29:229–239,2011, EGFR Gene Overexpression Retained in an Invasive Xenograft Model by Solid  Orthotopic Transplantation of Human Glioblastoma Multiforme Into Nude  Mice)。在上述文献中，通过使用从获自患者的胶质母细胞瘤的一个特定 部分(单个部分)的碎块所制备的移植物样品产生小鼠模型，从而在生产具 有与亲本肿瘤相同的遗传、形态学和病理学性状的胶质母细胞瘤小鼠模型方 面存在困难。此外，在按照现有技术制备移植入小鼠的移植物样品的样品制 备过程中，使用蛋白酶对收集自患者的组织进行酶分解，但是在此情形中， 由于组织黏度，将组织分离成单个细胞存在困难。此外，Ficoll梯度分离法 被普遍应用到从收集自患者的移植物样品中去除红细胞，但是在此情形中的 问题在于红细胞被清除的效力低。

为了治疗胶质母细胞瘤患者，应该考虑患者的遗传、生理和环境特征， 而且应该根据胶质母细胞瘤发展的程度而应用包含化学疗法、放射疗法和外 科手术疗法在内的不同疗法。然而，由于上述动物模型无法反映胶质细胞瘤 患者的个体特征，其仅被应用在开发治疗方法或制剂，其对于患者特异性治 疗的实际运用有制。人们期望，如果动物模型可以最佳模拟每位患者的遗传 和生理学状况，则治疗成功率将伴随对每位患者的特异性治疗而大幅提升。

在此情况下，本发明人做了大量工作以建立显示与成胶质母细胞瘤患 者的遗传、形态学、病理学性状相同的胶质母细胞瘤小鼠模型，因此，已经 发现，当将从收集自由胶质母细胞瘤患者分离出来的胶质母细胞瘤组织的不 同部分的胶质母细胞瘤组织碎块混合物所制备的移植物样品原位移植到小鼠 的脑中，能够建立显示出与亲本肿瘤相同的遗传、形态学、病理学形状的胶 质母细胞瘤小鼠模型。此外，本发明人开发了建立上述小鼠模型的最佳条 件，由此完成了本发明。

发明内容

本发明提供一种胶质母细胞瘤小鼠模型的生产方法，包括步骤：(a) 将分离自患者的胶质母细胞瘤组织分开成4个或更多部分(sections)，从 每个部分收集1个或更多碎块；(b)将收集的多个碎块的混合物解离为单 细胞形式的胶质母细胞瘤细胞；和(c)将包含在步骤(b)中获得的胶质母 细胞瘤细胞的移植物样品原位移植到免疫缺陷小鼠的脑中。本发明还提供通 过上述方法制备的小鼠模型，应用该小鼠模型筛选胶质母细胞瘤的治疗剂； 和应用该小鼠模型为选择患者特异性胶质母细胞瘤疗法而提供信息的方法。 根据本发明的患者特异性胶质母细胞瘤小鼠模型显示出与亲本肿瘤相同的遗 传、形态学、病理学性状，从而使得筛选患者特异性胶质母细胞瘤治疗剂或 选择安全有效的患者特异性胶质母细胞瘤治疗方法成为可能。

附图说明

图1：显示胶质母细胞瘤患者的临床数据，和获自患者的原代培养的胶 质母细胞瘤(GBM)细胞的实验结果。

图2：显示源自胶质母细胞瘤外科手术样品的原代培养物和原位异种 移植动物模型。(A)急性解离的GBM细胞在NBE环境下被原代培养，或 者立体定向注射到免疫缺陷小鼠的脑中。阐述了原位异种移植肿瘤的针对 PCNA的免疫组化。箭头表示PCNA-阳性的异种移植肿瘤的边界。(B)通 过Fisher’s精确检验(p＝0.09)分析急性解离的胶质母细胞瘤细胞的体外球 形成能力和体内肿瘤发生能力之间的相关性。(C)使用Kaplan-Meier曲线 和log rank检验比较具有体内肿瘤发生潜力(n＝40)和没有该潜力(n＝16) 的胶质母细胞瘤的PFS(无进展生存期)和OS(总生存期)。

图3：显示亲本GBM和对应的原位异种移植肿瘤的形态学和病理学性 状。分析和比较亲本和对应的原位异种移植肿瘤的侵袭力(A)、增殖指数 (B)和微血管密度(C)。(A)分别通过MRI和病理切片将浸润距离与 主要肿瘤块直径进行比较而确定侵袭性的亲本和原位异种移植肿瘤。(B) 通过针对Ki-67(亲本GBM)的免疫组化或针对PCNA(异种移植胶质母 细胞瘤)的免疫组化分析增殖指数，然后计算出从随机选择的100个细胞中 的阳性细胞数。每个指数均分析三遍取平均数用于统计分析。(C)通过针 对CD31的免疫组化分析微血管密度。在200倍放大率下随机选择3个显微 视野，然后计算CD31-阳性微血管数量。利用三个值的平均数用于统计分 析。

图4：显示MRI上亲本肿瘤的浸润性和原位异种移植肿瘤的侵袭力。 通过MRI T2/FLAIR图像根据神经肿瘤学(RANO)标准中的反应评估分析 亲本肿瘤的侵袭力。患者的肿瘤的侵袭力定义如下：0＝“无侵袭力”，1 (轻度)＝“侵袭距离<2x肿瘤直径”，2(中度)＝“2x肿瘤直径<侵袭 距离<3x肿瘤直径”和3(重度)＝“3x肿瘤直径<侵袭距离”。原位移 植肿瘤的侵袭力定义如下：Y＝“浸润距离>2x主要肿瘤块的直径”，在石 蜡切片中。对于轻度、中度、重度侵润每一种均提供3个亲本肿瘤的MRI 扫描图和相应的原位异种移植肿瘤的组织学。

图5：显示亲本和原位异种移植肿瘤的分子性状。将亲本胶质母细胞 瘤的短串联重复(A)、基因拷贝数变异(B)、TP53和IDH1基因突变 (C)以及基因表达谱(D和E)与对应的原位异种移植肿瘤比较。(B) 通过aCGH(左)分析基因拷贝数变异，概述了被报道在胶质母细胞瘤中 变化频繁的基因的基因拷贝数变异(扩增的：灰色栏；删除：灰色栏)。 (c)特定的突变用黑体字母表示。wt：野生型。(D)通过最近模板预测 方法确认58个胶质母细胞瘤样品的亚型。(E)通过免疫组化比较亲本 GBM和对应的原位异种移植肿瘤的基因产物的表达。

图6：显示亲本肿瘤和对应的原位异种移植肿瘤的治疗响应性比较。

(A)全脑放射疗法治疗的源自PC-NS07-448、PC-NS07-464、PC- NS08-578、PC-NS09-780或827肿瘤(分别地，对于对照组n＝8、15、9、9 和4；对于放射组n＝9、9、10、9和4)的异种移植肿瘤(自中位生存期后 每天2Gy，5天)。计算出总生存期(OS)，然后显示通过全脑放射增加的 生存长度(左，*p<0.05)。异种移植肿瘤的增加的生存长度与亲本肿瘤的 PFS相关(右)。误差棒代表SD。

(B)通过甲基化特异PCR(左，M，甲基化特异引物或甲基化的对照 gDNA；UM，甲基化特异引物或非甲基化的对照gDNA)分析MGMT启动 子的甲基化状态。使用TMZ(65mg/kg/天，口服施用)治疗源自PC- NS07-464或PC-NS09-559(分别地，对于对照(C)组n＝9和10，对于 TMZ组n＝7和9)的异种移植肿瘤。计算出总生存期(OS)，然后显示通 过TMZ化学疗法增加的生存长度，*p<0.05。(C)使用贝伐单抗(10 mg/kg，腹腔内注射，每周两次)治疗源自PC-NS07-448、PC-NS07-464、 PC-NS09-559或PC-NS09-748(分别地，对于对照组n＝8、8、7和7，和对 于贝伐单抗组n＝9、11、7和6)的异种移植肿瘤。通过H&E染色和针对人 核的免疫组化(低，PCNS07-464)分析经过贝伐单抗治疗的异种移植肿瘤 的形态学改变。

图7：显示对于原位异种移植肿瘤的体内全脑照射和RR(放射-响应 性)信号。(A)使用全脑放射疗法治疗源自PC-NS07-448、PC-NS07- 464、PC-NS08-578、PC-NS09-780或827肿瘤[分别地，对于对照组n＝8、 15、9、9和4，和对于放射组n＝9、9、10、9和4]的异种移植肿瘤(每天 2Gy，5天)。应用Kaplan-Meier曲线和log-rank检验分析在生存长度方面 的照射效果。(B)从接受体内放射治疗的源自PC-NS07-448和PC-NS07- 464异种移植肿瘤(左)的mRNA表达的分析确定RR信号。基于RR信 号，高级别神经胶质瘤REMBRANDT数据集分级体系地聚簇成为448-样和 464-样组。应用Kaplan-Meier曲线和log-rank检验分析448-样和464-样组的 高级别神经胶质瘤的总生存期(OS)和GBM的OS。

图8：显示在独立数据集中肿瘤发生标签，肿瘤发生相关通路，和它们 与临床结果的关联性。(A)在行-标准化后，在10个非肿瘤发生和36个肿 瘤发生GBM中差异表达(临界值：改变多于1.5-倍)的709个基因的表 达，以热图(二维图)的形式绘图。红色和蓝色分别表示高和低表达。每个 组中差异表达程度最高的20个基因被列于两侧。(B)比较在 REMBRANDT数据集中两组患者的累积总生存期的Kaplan-Meier曲线，每 组患者与肿瘤发生标签正或负相关联。(C)比较在REMBRANDT数据集 中两组患者的累积总生存期的Kaplan-Meier曲线，每组患者上调控或下调 控PITX2通路。(D)显示风险比(以自然对数标尺)和它们的95％的置信 区间的森林图，其中每一个风险比代表在REMBRANDT数据集中特定通路 的计算活性与患者的总生存期OS之间的相互关系。在与肿瘤发生标签正相 关的组中，最前五个和最后五个分别对应于在BIOCARTA中被发现最上调 和下调通路的入口。

图9：显示在独立数据集中的排列分析(permutation analysis)和肿瘤 发生相关联的通路与临床结果之间的关联性。

(A)来自500次排列分析中的P值分布。在每一次分析中，产生“对 照”标签，然后以log-rank P值检验量化对照标签在预测REMBRANDT数据 集的患者生存期的表现。在500个log-rank P值中的两个(以实心棒标记) 小于初始信号的P值(0.000046)，这使得排列检验P值是0.004 (＝2/500)。

(B)带注释的KEGG通路的森林图。

(C)带注释的REACTOME通路的森林图。

图10：显示在独立数据集中侵袭标签和与临床结果的关联性。(A)在 行-标准化后，在9个非肿瘤发生和27个肿瘤发生(在小鼠脑中)GBM中 差异表达(临界值:改变大于1.5-倍)的777个基因的表达以热图(二维 图)的形式绘图。每个组中差异表达程度最高的20个基因被列于两侧。 (B)比较在REMBRANDT数据集中两组患者的累积总生存期的Kaplan- Meier曲线，每组患者与肿瘤发生信号正或负相关。

发明的最佳实施方式

本发明的目的在于提供显示出与亲本肿瘤相同的遗传、形态学和病理学 性状的胶质母细胞瘤小鼠模型，和制备该模型的方法。

本发明的另一个目的在于使用本发明方法制备的小鼠模型筛选患者特异 性胶质母细胞瘤治疗剂。

本发明的另一个目的在于提供应用本发明制备的小鼠模型为选择患者特 异性胶质母细胞瘤疗法而提供信息的方法。

为了达成上述目的，本发明提供一种生产胶质母细胞瘤小鼠模型的方 法，包括步骤：(a)将分离自患者的胶质母细胞瘤组织分开成4个或更多 部分(sections)，从每个部分收集1个或更多碎块；(b)将收集的多个碎 块的混合物解离为胶质母细胞瘤单细胞；和(c)将包含步骤(b)中获得的 胶质母细胞瘤细胞的移植物样品原位移植到免疫缺陷小鼠的脑中。

本发明还提供了一种筛选胶质母细胞瘤治疗剂的方法，该方法包括使用 候选治疗剂处理上述胶质母细胞瘤小鼠模型或由其获得的胶质母细胞瘤细胞 的步骤。

本发明还提供了为选择患者特异性胶质母细胞瘤疗法提供信息的方法， 该方法包括步骤：(a)对上述胶质母细胞瘤小鼠模型施用候选胶质母细胞 瘤疗法；和(b)在饲养被施用候选胶质母细胞瘤疗法的动物模型同时考查 治疗效果和预后。

除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语均具有和本发明所属的 技术领域普通技术人员共知的相同的普通含义。一般地，本文中的命名和实 验方法在本领域熟知并普遍应用。

如本文所使用的，术语“胶质母细胞瘤(GBM)”指源自大量存在于正 常脑组织中的神经胶质细胞的肿瘤。特别地，胶质母细胞瘤是脑中的最为常 见的单一肿瘤，占脑肿瘤的12-15％和神经胶质瘤的50-60％。此外，其表现 出多种症状，包括由于快速升高的脑压造成的头疼(早晨严重)、恶心、呕 吐、抽搐、由于大脑浮肿导致的神经功能下降、肢体运动或敏感性下降、面 部瘫痪、语言失调、认知损伤和右-左辨别力失调。基于TMZ(替莫唑胺) 的治疗及类似方法已被应用于治疗胶质母细胞瘤。然而，即使将相同的治疗 应用于胶质母细胞瘤患者时，其治疗效果也可能因患者而异，因为患者具有 不同的遗传和病理学状况。由于上述原因，需要开发反映患者遗传、生理和 病理学状况的胶质母细胞瘤异种移植物小鼠模型以筛选胶质母细胞瘤治疗 剂。相应地，本发明人已经通过将从分离自患者的胶质母细胞瘤组织的移植 物样品原位移植进入小鼠的脑中，开发了制备显示与亲本肿瘤相同性状的原 位胶质母细胞瘤异种移植物小鼠模型。特别地，当基于遗传上相同的癌症细 胞组成的胶质母细胞瘤这一原理，仅从分离的癌症组织的特定部分制备小鼠 模型时，该小鼠模型将无法恰当地显示亲本肿瘤的性状。为了克服上述困 难，本发明人开发了制备移植物样品的方法，该方法将胶质母细胞瘤组织分 开成4个或更多部分，从上述部分上收集具有特定体积的碎块，然后将所收 集的碎块彼此混合。使用上述移植物样品，制备出胶质母细胞瘤小鼠模型。 换而言之，在本发明中，不是仅将胶质母细胞瘤组织的某个部分移植到小鼠 中，而是将分离自患者的胶质母细胞瘤组织的不同部分混合制备样品然后移 植到小鼠中，从而制备可以完全反映患者性状的胶质瘤母细胞异种移植物小 鼠。在本发明中，称这种反映患者性状的胶质瘤母细胞异种移植物小鼠为 “化身作人形的小鼠(avatar mouse)”。

一方面，本发明涉及制备胶质母细胞瘤小鼠模型的方法，包括步骤： (a)将分离自患者的胶质母细胞瘤组织分开成4个或更多部分 (sections)，从每个部分收集1个或更多碎块；(b)将收集的多个碎块的 混合物解离为胶质母细胞瘤单细胞；和(c)将包含步骤(b)中获得的胶质 母细胞瘤细胞的移植物样品原位移植到免疫缺陷小鼠的脑中。

根据本发明制备胶质母细胞瘤原位异种移植物小鼠方法中的步骤(a) 和(b)是准备用于制备患者特异性胶质母细胞瘤小鼠模型的包含胶质母细 胞瘤细胞的移植物样品的步骤。

如本文所使用的，术语“包含胶质母细胞瘤细胞的移植物样品”指由分离 自胶质母细胞瘤患者的胶质母细胞瘤组织制备的样品，以将其移植到小鼠的 脑中，其包含单细胞形式的胶质母细胞瘤细胞。包含在样品中的胶质母细胞 瘤细胞优选但不限于获自从胶质母细胞瘤患者分离后3小时以内的组织。此 外，样品优选通过将分离自胶质母细胞瘤患者的胶质母细胞瘤组织分开至4 或更多部分，然后从每个部分收集1个或更多碎块，以致它可以恰当地反映 患者的胶质母细胞肿瘤的特征。如上所述，当使用通过将分离自胶质母细胞 瘤患者的胶质母细胞瘤组织分开至4个或更多部分，从每个部分收集1个或 更多碎块，然后将收集的碎块彼此混合以制备包含胶质母细胞瘤细胞的混合 物，不同于仅将胶质母细胞瘤组织的某个部分作为样品移植制备的小鼠模 型，通过上述移植物样品制备获得小鼠模型时，其可恰当地反映患者的胶质 母细胞瘤的性状。因此，如本发明所公开的，移植物样品优选将胶质母细胞 瘤组织分开至4或更多部分，从每个部分收集1个或更多碎块，然后将收集 的碎块彼此混合。如果从4个或更多部分收集碎块，则可能生产出显示与亲 本肿瘤显示相同遗传、形态学和病理学性状的小鼠模型。从而，所述部分的 上限数量是不固定的，但是碎块可以收集自100个或更少的部分，因为部分 的数量增多会增加时间和成本。

优选地，可以从4个或更多部分收集1个或更多碎块，每个的体积在1- 8mm³。此外，在步骤(b)中收集的碎块的混合物的体积可以优选为分离 自患者的胶质母细胞瘤组织体积的30-100％。

此外，步骤(b)是将收集的多个碎块的混合物解离为胶质母细胞瘤单 细胞的步骤。在此步骤中，可顺序地执行机械解离和酶解离混合物来将收集 的碎块的混合物解离为单个细胞。

可使用现有技术中任何常规的装置执行机械解离处理。在本发明的一个 实施例中，使用解离器。经过机械解离处理的样品可以进行酶解离处理。用 于这一酶解离的试剂优选包含蛋白酶和DNase两者。蛋白酶的实例包括但 不限于半胱氨酸蛋白酶，例如木瓜蛋白酶，DNase的实例包括但不限于 DNase I。本发明人发现，在进行酶解离处理时，除了蛋白酶之外再使用 DNase可以有效解决执行均质化处理所导致的黏度增大的问题。因此，酶解 离处理优选使用包含蛋白酶和DNase两者在内的试剂进行。在检验完样品 是否被解离成为单个细胞之后，可任选地过滤经过上述酶解离处理的样品。

可使用孔径适于单个细胞分离的任何过滤器执行过滤处理。在本发明的 一个实施例中，使用细胞筛获得单个细胞群体。

在上述过滤处理后，可以对该包含单细胞类型的胶质瘤母细胞的样品执 行从样品中去除血液的处理。可使用现有技术中已知的任何常规的红细胞去 除方法执行去除血液的处理，但是优选使用Percoll梯度离心法执行。在本 发明的一个实施例中，发现当使用Percoll梯度离心法时，相比不使用 Percoll梯度离心法，血液去除效率有所提高。

本发明的步骤(c)是将包含在步骤(b)中获得的胶质母细胞瘤细胞的 移植物样品原位移植到免疫缺陷小鼠的脑中的步骤。

如本文所使用的，术语“免疫缺陷小鼠”指在基因水平上人工地损害其免 疫系统中的部分以使免疫系统异常来培养胶质母细胞瘤的小鼠。在本发明中 使用的免疫缺陷小鼠可以是具有成形的神经系统的小鼠。优选地，可以是免 疫缺陷基因工程小鼠。现有技术中，主要应用裸鼠，但是当使用NOG (NOD/SCID Il2rg^-/-)小鼠制备小鼠模型时，其具有使小鼠模型的生产速度 进一步增加的优势。因此，最优选地，在本发明中可使用NOG (NOD/SCID Il2rg^-/-)小鼠。

包含胶质母细胞瘤细胞的移植物样品的特征在于将其原位移植到免疫缺 陷小鼠的脑中。

可通过将样品注射到小鼠脑中，定位在前囱左侧1.5-2.5mm和前囱前 0.5-1.5mm和从硬脑(脊)膜起深1.8-2.2mm的位置来将移植物样品移植到 小鼠脑中。本发明中包括将样品原位移植到小鼠脑中的方法，相比于将胶质 母细胞瘤移植到小鼠皮下的方法而言，其优势在于该方法可以容易地保持亲 本肿瘤的特征。

此外，当将步骤(b)的移植物样品原位移植到小鼠脑中时，样品优选 含有1x10⁵-5x10⁵个胶质母细胞瘤细胞并具有5-15μl的体积。如果样品中细 胞数约为10⁴或更少或约为10⁶或更多，则生产胶质母细胞瘤小鼠疾病模型 的速度会下降。

移植细胞生长并且在移植后的数周或数月内，胶质母细胞瘤模型形成从 而建立起胶质母细胞瘤小鼠疾病模型，此时，体重的显著减少、呼吸急促、 瘫痪或其他近似症状将显现。在本发明的一个实施例中，在异种移植物动物 模型中，在体重方面表现出20％或更多的下降的动物被认为是建立了疾病 模型。

如上所描述的方法制备的本发明的胶质母细胞瘤异种移植物小鼠模型， 遗传、形态学和分子性状与其获自患者的被移植组织的亲本胶质母细胞瘤的 对应性状相似。

在另一方面，本发明涉及一种胶质母细胞瘤小鼠模型，该模型是根据本 发明的制备方法制备获得的胶质母细胞瘤小鼠模型。

甚至具有相同胶质母细胞瘤的患者也具有不同的性状，由此导致在患者 之间可能存在治疗效果和预后差异。因而，当向所有胶质母细胞瘤的患者应 用相同的治疗方法时，其治疗效果在患者之间可能存在差别。因而，需要在 多种胶质母细胞瘤治疗方法中选择患者特异性且更为有效的治疗方法或者筛 选新的治疗方法。根据本发明的患者特异性的胶质母细胞瘤小鼠模型恰当地 反映了作为该胶质母细胞瘤细胞所源自的患者的性状，因而其应用使得选择 适合该患者的治疗方法成为可能。

特别地，本发明的小鼠模型其特征在于诸如其侵袭性、增殖指数和微血 管密度等的形态学性状与其亲本肿瘤的对应性状相同。例如，其遗传环境例 如编码EGFR(表皮生长因子受体)、CDK2(细胞周期蛋白依赖性激酶 2)、PDGFRA(α型血小板衍生生长因子受体)、MDM2(鼠双微体)、 MDM4、MET(MET原癌基因)、CDK6(细胞周期蛋白依赖性激酶6)、 PIK3CA(磷酸肌醇-3-激酶，催化剂，α多肽)，和AKT3(RAC-γ-丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶)的基因是否扩增，或编码CDKN2A/B(细胞周期蛋白依 赖性激酶抑制剂2A/B)、PTEN(磷酸酶和张力蛋白同源物)、CDKN2C (细胞周期蛋白依赖性激酶4抑制剂C)、RB1(视网膜母细胞瘤蛋白)、 PARK2(帕金森蛋白2)和NF1(神经纤维瘤蛋白)的基因是否被删除，这 与其亲本肿瘤相同；以及MBP(髓鞘碱性蛋白)、PDGFA(血小板衍生生 长因子A)、EGFR,CHI3L1(几丁质酶-3-样蛋白1)、MAP2(微管相关蛋 白2)、TOP2A(DNA拓普异构酶Ⅱ-α)、DLL3(δ样3)、SOX2(SRY (Y染色体上的性别决定区)-盒2)和Olig2(少突胶质细胞转录因子 2)，这些已知作为胶质母细胞瘤的标记蛋白，可以与亲本肿瘤的上述蛋白 相同或相似的水平表达，但不是特别限制于此。

在本发明的一个实施例中，在分离后3小时以内均匀切割不同的分离自 患者的胶质母细胞瘤组织的部分，因此可以均匀混合全部肿瘤组织的不同部 分的细胞。然后，通过机械分离或酶解离将组织分离成为单个细胞，然后将 包含1.0x10⁵到2.0x10⁵个胶质母细胞瘤细胞的10μl HBSS溶液移植到小鼠 脑(前囱左侧2mm和前囱前1mm和从硬脑(脊)膜起深2mm)。当小 鼠表现出20％或更多的体重下降，可以认为其已患胶质母细胞瘤并处死 (实施例2)。然后，检验制备的患者特异性胶质母细胞瘤小鼠模型与其亲 本肿瘤之间的形态学和病理学相似性。特别地，检验侵袭性、增殖指数和微 小血管密度，然后结果显示，移植了胶质母细胞瘤的小鼠模型与亲本肿瘤在 侵袭性、增殖指数和微血管密度方面非常相似(实验例2)。此外，检验基 因组相似性，结果显示，拷贝数和基因突变在小鼠模型与其亲本肿瘤间是一 致的(图5B和5C)。进一步地，用微阵列检验基因表达，结果显示亲本 肿瘤和与其对应的异种移植物显示出相似的基因表达性状(图5E)。检验 了本发明的小鼠模型是否恰当地反映亲本肿瘤的形态学、病理学和遗传性 状，而且还检验了小鼠模型对于胶质母细胞瘤疗法的反应是否与其亲本肿瘤 相似。作为结果，小鼠模型和亲本肿瘤显示出对于放射疗法和基于TMZ的 化学疗法具有相似的趋势(实验例4)。以上结果表明根据本发明方法制备 的胶质母细胞瘤小鼠模型充分地反映了该移植的胶质母细胞瘤所源自的患者 的性状，因而其在为选择患者特异性治疗剂及治疗方法提供平台方面是有用 的。

在另一方面，本发明涉及筛选胶质母细胞瘤治疗剂的方法，该方法包括 用候选治疗剂处理以上胶质母细胞瘤小鼠模型或由其获得的胶质母细胞瘤细 胞的步骤。

该筛选方法还可以进一步包括检验候选治疗剂对于小鼠模型或由其获得 的胶质母细胞瘤细胞的治疗效果的步骤。

可以通过合适途径例如口服、静脉、经皮途径将候选治疗剂给予小鼠， 然后测量肿瘤尺寸、转移的程度、死细胞/活细胞比率来确定候选治疗剂的 治疗效果。特别地，本发明的胶质母细胞瘤小鼠模型或由其获得的胶质母细 胞瘤细胞反映了该胶质母细胞瘤所源自的患者的性状，而且可有效应用其选 择适合于该患者的治疗剂。

此外，筛选方法可以进一步包括确定经候选治疗剂处理的小鼠模型的预 后的步骤。如本文所使用的，术语“预后”意为对疾病病情进展或痊愈的预 测。在本发明中，预后指通过检验向小鼠给予候选试剂后检验胶质母细胞瘤 发展的程度，对候选试剂是否能治疗患者所患胶质母细胞瘤进行评估。

如上所描述的，使用根据本发明方法制备获得的胶质母细胞瘤小鼠模 型，结合对胶质母细胞瘤患者应用候选试剂或疗法，可以使预测胶质母细胞 瘤的病情发展或痊愈成为可能。

在另一方面，本发明涉及应用该小鼠模型为选择患者特异性胶质母细胞 瘤疗法提供信息的方法，该方法包括步骤：(a)使以上胶质母细胞瘤小鼠 模型经历候选胶质母细胞瘤疗法；和(b)在饲养经历了该候选疗法的小鼠 模型同时检验治疗效果和预后。

在此，胶质母细胞瘤和小鼠模型是如以上描述的那样。

在提供信息的方法中，步骤(a)是对本发明的胶质母细胞瘤小鼠模型 执行候选胶质母细胞瘤疗法的步骤。

如本文所使用的，术语“候选疗法”意为不同的疗法，从中可为治疗患有 胶质母细胞瘤的患者选择胶质母细胞瘤特异性疗法。候选疗法可以是已知用 于治疗胶质母细胞瘤的任何可能的方法，而且其中的例子包含化学疗法、放 射疗法、外科手术疗法、免疫细胞疗法和它们的组合。

如本文所使用的，术语“化学疗法”指通过对患者施用具有抗肿瘤活性的 常规候选治疗剂以治疗胶质母细胞瘤的方法。如本文所使用的，术语“放射 疗法”指通过用放射来处理患者以治疗胶质母细胞瘤的方法。术语“外科手术 疗法”指通过外科手术除去患有胶质母细胞瘤的部分以治疗胶质母细胞瘤的 方法。

术语“免疫细胞疗法”指通过从取自患者外周血的单核细胞分离攻击胶质 母细胞瘤的免疫细胞，将所选细胞与分离自患者的胶质母细胞瘤融合，然后 以抗肿瘤疫苗的方式将融合细胞再输回至患者体内来治疗患者的胶质母细胞 瘤的方法。在此，攻击胶质母细胞瘤的免疫细胞优选但不限于树突状细胞。

尽管以下实施例仅阐述了在本发明的培养基中人源的神经干细胞的培 养，但是对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是培养其他来源的成熟 干细胞会显示相同的效果。

以下，将通过实施例进行进一步详细说明本发明。对于本领域的普通技 术人员显而易见的是，这些实施例仅用于阐述发明而非对本发明范围构成限 制或改变。同样地，本领域的普通技术人员将会意识到，基于这种阐述，在 不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本说明书中公开的实施方式进 行各种各样的修改、增加和替换。

实施例1：胶质母细胞瘤(GBM)患者和源自所述患者的细胞培养物的原 代培养

遵照知情同意原则，手术样品和临床数据取自在三星医学中心(首尔， 韩国)接受脑肿瘤移除手术的58名患有胶质母细胞瘤的患者，图1显示出 其数据。特别地，图1示出了胶质母细胞瘤患者的临床数据和源自患者的胶 质母细胞瘤(GBM)细胞的原代培养的实验结果。

基于WHO标准经过病理学者们检查将所获得的外科手术样品分类为 GBM。一部分外科手术样品通过酶解离成为单个细胞，并且经解离的GBM 细胞在“NBE”条件下培养。特别地，经解离的GBM细胞在Neurobasal培养 基并添加N2和B27添加剂(各自0.53x；Invitrogen)以及bFGF和EGF (各自25ng/ml；R&D Systems)中培养。可供选择地，在NBE条件下急 性解离的GBM细胞平铺于烧瓶上，使用前以10mg/ml层粘连蛋白 (Sigma)包被过夜，进行贴壁培养。

实施例2：原位异种移植小鼠模型的构建

动物实验经三星医疗中心的机构审查委员会批准，并按照“国立卫生研 究院照顾和使用实验动物指导”("National Institutes of Health Guide for the  Care and Use of Laboratory Animals"，NIH出版物80-23)进行，原位异种移 植小鼠模型按照以下方式制备。

原位异种移植小鼠模型的制备主要分为以下步骤：1)从分离自胶质母 细胞瘤患者的胶质母细胞瘤组织制备样品(将被移植到小鼠中)；和2)将 样品移植到小鼠中。制备原位异种移植小鼠模型的程序如下：

(1)从分离自胶质母细胞瘤患者的组织制备均质化的移植物样品的步骤

使用从胶质母细胞瘤患者分离出来后2-3小时的新鲜组织来制备将要移 植到小鼠中的样品，制备是按照如下表1所示的顺序进行。

表1

[表1]

序号 步骤 1 组织均质化 2 解离肿瘤组织(机械解离和酶解离) 3 过滤单个细胞 4 清除血细胞 5 计算细胞数和生存能力

特别地，将分离自患者的胶质母细胞瘤组织分开4个或更多部分 (sections)，然后用剪刀或镊子从每个部分收集至少1个具有1-8mm³的 碎块使得收集的碎块的体积相当于所分离的胶质母细胞瘤组织的体积的30- 80％，因而可以均匀混合整个肿瘤组织的不同部分的细胞。

在建立小鼠模型生产程序期间，本发明人发现，当全部肿瘤组织的不同 部分均被均匀切割并用于制备移植物样品时，生产小鼠模型的速率提高了， 并且小鼠模型的遗传、形态学和标记表达性状与患者的相似，从而相比于仅 使用分离组织的某个部分所生产的小鼠模型，该模型可以最佳模拟患者的遗 传和生理学性状。基于这一发现，本发明人建立了以上描述的程序，该程序 中并不是使用整个肿瘤组织的某个部分，而是将分离的整个肿瘤组织的不同 部分均匀切割然后用于制备移植物样品。

然后，使用剪刀和镊子将经切割的组织切割成为小碎块。然后，把切割 的小组织碎块转移到试管中，并用gentleMACS切碎。

执行以上描述的机械解离处理后，进行酶解离处理。酶解离处理是将经 机械解离的组织样品与包含木瓜蛋白酶和DNase的酶混合物在培养箱中于 37℃反应。此处，酶混合物是以相对于组织体积为1:1-1:2的比率使用。

在建立以上描述的酶解离程序过程中，本发明人发现，DNase与木瓜蛋 白酶共同使用时，可以克服由于黏度导致的细胞解离困难。基于这一发现， 本发明人建立了DNase与木瓜蛋白酶共同使用的酶解离程序。

执行以上描述的酶解离程序后，执行过滤程序以获得单细胞群。在过滤 程序中，使用细胞筛过滤。

清洗所获得的单细胞群，然后在18℃以20,000rpm进行Percoll梯度离 心20分钟以去除血细胞。在去除血细胞后，使用血细胞计数器测量样品中 的细胞数，并且分析细胞的生存能力。

(2)原位移植均质化的移植物样品的步骤

在以下条件将在步骤(1)中得到的包含胶质母细胞瘤细胞的样品原位 移植到小鼠的脑中。

特别地，将10μl包含1x10⁵至2.0x10⁵个细胞的HBSS(Hank's平衡盐 溶液)注射到小鼠的脑中。使用的小鼠为NOG小鼠。样品转移到小鼠脑 中，在前囱左侧2mm和前囱前1mm，和从硬脑(脊)膜起2mm的位 置。本发明人发现，如果在这一步骤中移植到小鼠脑中的细胞数约为10⁴或 更少或约为10⁶或更多，以及如果包含细胞的溶液体积太少如约5μl或更少 或如约50μl，则能够模拟患者性状的小鼠模型的生产降低。基于这一发 现，本发明人建立了如上描述的最适注射条件。

当移植了所述细胞的小鼠表现出20％或更多的体重下降时，处死小鼠 并且，然后用石蜡或冰冻切片法将其脑制备成样本。

(3)与常规技术的对照

为了证明本发明制备能够模拟患者遗传和生理学性状的胶质母细胞瘤小 鼠模型的方法的优越性，将本发明的每个步骤与常规生产方法(比较例)作 比较，然后其比较结果显示于下表2中。

表2

[表2]

如以上所描述的，本发明人开发的制备恰当反映患者组织遗传和生理学 性状的异种移植物小鼠模型的方法，其生产模型的速率是显著高的。

实施例3：组织微阵列和免疫组化

在亲本和源自它的原位异种移植肿瘤(PC-NS07-464、PC-NS08-493、 PC-NS08-532、PC-NS08-559、PC-NS08-608、PC-NS09-626、PC-NS09- 630、PC-NS09-633、PC-NS09-660、PC-NS09-690和PC-NS09-696)执行组 织微阵列。

使用蛋白特异性抗体(Ki-67，PCNA(DAKO)、DLL3(Santa  Cruz)、SOX2、Olig2、MAP2(Abcam)、MBP、PDGFA、EGFR(Santa  Cruz)、CHI3L1、TOP2A(LifeSpan Bioscience)和CD31，和BD  Pharmingen对亲本肿瘤进行免疫组化。

实施例4：短串联重复(STR)基因分型，阵列比较式基因组杂交 (aCGH)以及TP53和IDH1的基因突变分析

使用QIAamp DNA mini kit(QIAGEN)从肿瘤样品中分离基因组 DNA。为(STR)基因分型，使用AmpFlSTR Identifier PCR扩增试剂盒 (Applied Biosystems)通过多重PCR扩增靶DNA的16个基因座。PCR产 物与内标(GS-500LIZ，Applied Biosystems)混合，在ABI 3130xL基因分 析仪中电泳。以GeneMapper 4.0软件使用其提供的等位基因阶梯(Applied  Biosystems)分析电泳结果。

使用安捷伦人类全基因组CGH244K微阵列执行aCGH。对于TP53和 IDH1的基因突变，进行PCR反应(40个循环，95℃30秒，58℃30秒， 和72℃30秒)，使用100ng的gDNA，每种引物200nM(以下表3)， 和Maxime PCR premix(iNtRON)。

表3

[表3]

通过QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，然后使用BigDye  Terminator v1.1试剂盒(Applied Biosystems)在ABI 3130xl基因分析仪 (Applied Biosystems)上执行双向测序。

实施例5：基因表达谱分析

使用Affymetrix Human Gene 1.0 ST阵列实施基因表达谱分析。由此生 成的CEL文件使用Robust Multichip Averaging(RMA)程序标准化。使用 PM(精确匹配)-MM(错配)差异模型获取表达值。使用GSEA-P程序将 探针ID分解成基因名称(从Broad Institute网站下载)。

为了REMBRANDT(脑肿瘤的分子数据库)数据集，从网站 (https://caintegrator.nci.nih.gov/rembrandt/)下载高级别神经胶质瘤样品的 CEL文件，连同匹配的临床信息文件。以与内部(in-house)产生的CEL文 件相同的方式加工处理CEL文件，不同在于使用匹配阵列注释文件(对于 Affymetrix U133 Plus 2.0阵列)。

对于TCGA数据集(Cancer Genome Atlas Research Network,2008)， 起初使用Affymetrix U133A 2.0阵列生成的556个GBM样品的基因表达数 据文件从官方网站上下载，连同匹配的临床信息文件。以已经加工过的形式 (III级)提供基因表达文件。

实施例6：胶质母细胞瘤(GBM)亚型预测

在起初用来分类GBM亚型的840个标记基因中，有787个在所使用的 微阵列平台中被展示。以数字代码注释该787个基因，代表每个基因表示的 独特亚型(1、2、3和4分别指原神经、神经、典型和间充质标记，5指其 他)。58个GBM样品的标记基因信息文件和包含基因表达数据的文件被上 传到在GenePattern的最近模板预测模块(通过Broad Institute获得)。所 有样品均被分类到5个类别之一，差异有显著性(Bonferroni P值小于 0.05，bootstrap检验1000次重复采样)。

实施例7：基因标签分析

对46个内部绘制(in-house-profiled)的GBM样品做肿瘤发生标签分 析。鉴定出非肿瘤发生组(n＝10)和肿瘤发生组(n＝36)之间差异表达的 基因(改变大于1.5-倍)。

肿瘤发生标签由差异表达的基因组成，每个均标记有关联的子群和对 Log2倍数改变值。标签被上传到在GenePattern的最近模板预测模块中。同 样，将REMBRANDT或TCGA数据集以GCT格式上传到模块中。在每个 数据集中模块生成关于样品分类的输出文件。

使用R生存包(R Survival package)执行生存分析(Kaplan-Meier曲线 和log rank检验)。为了排列分析，本发明人随机将GBM患者重分组成肿 瘤发生和非肿瘤发生子群，维持原始子群的大小。获得“对照”标签并将其应 用到REMBRANDT数据集中为了预后预测。生成的比未改组数据集的初始 p值(p＝0.000046)小500p值(从log rank检验)的部分(fraction)定义为 排列检验的p值。

实施例8：通路分析

(1)鉴定体内肿瘤发生相关通路

对46个内部绘制的GBM样品使用GSEA-P程序做通路分析。分析使 用在MSigDB v3.0中的基因集合，特别是源自3个主要的手工辅助通路数 据库：KEGG、REACTOME和BIOCARTA的基因。通过差异表达的程度 来排列和加权基因，通过Z分数(由t检验的T分数校正)来量化。

对于排列方式(permutation-type)参数，用备选(alternative)选择 (基因_集)代替默认选择(基因表型)。这个备选设置有助于给出更大量 的p值。然而，默认设置很可能在样本量小时给出过于保守的显著性评估， 只有在该备选设置显示在REMBRANDT数据集中与患者生存率的被期望的 相关性趋势时，通路中的大多数通过显著性临界值。

(2)从基因表达数据集量化通路活性

对于REMBRANDT数据集，表达值被“基因-标准化”。特别地，对每一 个基因，每个样品的log表达值被所有样品的基因的平均log表达值所抵 消。为了计算在给定样品的给定通路的活性，通路基因的相对表达值与所有 基因的相对表达值相比较。用KS分数(Python Stats软件包)来比较；分数 被定义在-1和1之间，大于和小于0的值分别表示相比于在所给定样品中的 所有基因，通路基因被上调和下调。

R survival软件包被用来(1)绘制样品的患者生存上调和下调所给通 路，(2)评估两组之间生存差异的统计显著性，和(3)计算KS分数(通 路活性)对OS(通过Cox比率风险回归)的风险率。

实验例1：体外培养物和原位异种移植肿瘤模型

如图1所示，从59个GBM患者收集71个外科样本(从11位患者， 获得既有原发性又有再发性肿瘤样本；从1个患者，获得2个再发性样本无 原发性样本)。

为了从样本生产原位异种移植肿瘤模型，将每个样本的胶质母细胞瘤组 织解离成上述实施例2所示的单个细胞，然后在手术后12小时内将单个细 胞立体定向注射到免疫缺陷NOD/SCID Il2rg^-/-(NOG)小鼠脑中。

平行地，通过将新鲜分离的GBM细胞在包含EGF和bEGF的无血清培 养基中培养来确定新鲜分离的GBM细胞的体外生长动力。因为如神经球的 无性繁殖生长是GBM干细胞自我更新的体外指示物，用球形成(直径： R50mm)用作为GBM体外生长的读出器。体内肿瘤发生学被定义为在肿 瘤细胞注射后12个月内形成肿瘤。由于包括有限数目的可获得细胞在内的 技术问题，本发明不能检验一个样品的体内肿瘤发生潜力和21个样品的体 外球形成能力(图1)。

关于这个平行的体内异种移植肿瘤和体外短期培养物，本发明人确定了 两者之间的潜在关联。通过组织病理学从70个样品中确认了53个案例 (75.7％)的体内异种移植肿瘤形成。在50个样品中确认了34个案例 (68％)的体外球形成和持续生长的活力(图1和2A)。

以上结果指出在体内异种移植肿瘤和体外培养之间存在正向关联。

实验例2：形态学和病理学相似性的检查

如果在本发明中生产的胶质母细胞瘤异种移植小鼠肿瘤精确地反映它们 的亲本肿瘤的形态学和病理学特点，原位GBM异种移植物作为人类GBM 原位模型系统的应用将极大增强。在下面的实验中，本发明人基于侵袭力、 增殖指数和血管密度方面的三个参数，比较了亲本肿瘤和异种移植肿瘤形态 学和病理学的相似性。

(1)侵袭力(图3A和4)：使用MRI T2/FLAIR图像依照以神经肿瘤 学(RANO)标准的反应评估来分析每个亲本肿瘤的侵袭力，然后通过比较 肿瘤直径与侵袭距离来分配侵袭力的数字分值(图1)。感兴趣的是，患者 MRI和异种移植肿瘤侵袭力的比较揭示了亲本和对应的异种移植肿瘤的侵 袭力显著相关(n＝42，卡方检验，23P＝0.029)。

(2)增殖指数(图3B)：异种移植肿瘤的增殖指数与它们的亲本肿瘤 正相关(n＝53，皮尔森相关，P<0.001)。

(3)微小血管密度(图3C)：异种移植肿瘤的CD31阳性微小血管密 度显示与它们的亲本肿瘤正相关(n＝53，皮尔森相关，P<0.001)。

以上结果支持，通过本发明方法生产的胶质母细胞瘤异种移植小鼠模型 充分地反映了亲本肿瘤的形态学和病理学状态，表明小鼠模型能用于筛选患 者特异性药物和在2期临床试验前直接应用药物至患者前测试药物的效果和 负作用。

实验例3：基因相似性

为了进一步调查亲本肿瘤和对应的原位异种移植肿瘤的相似性，执行基 因分析。

首先，本发明执行短串联重复(STR)基因分型以确保每个GBM异种 移植物均来源于特定患者(图5A)。

另外，执行阵列比较式基因组杂交(aCGH)和基因突变分析，并且分 析结果指出对应的异种移植肿瘤可以精确复制所有的在亲本GBM上发现的 包括拷贝数变化和遗传突变在内的检测到的基因改变(图5B和5C)。

已知最近一项大型基因研究基于其不同的基因表达标签将GBM归类成 为4个小组(原神经、神经、典型和间充质)(Cancer Genome Atlas  Research Network,2008 Nature 455,1061-1068.；Phillips et al.,2006 Cancer  Cell 9,157-173.；Verhaak et al.,2010 Cancer Cell 17,98-110.)。为了确定本 发明文库是否覆盖了这些小组的所有范围并且测试亲本肿瘤的基因表达标签 是否在原位异种移植肿瘤中得以保持，本发明执行了全基因表达谱分析。

特别地，本发明人分析了58个可获得微阵列基因表达数据的GBM患 者的外科手术样本(图1)。本发明人也执行了涵盖亲本GBM和相应的原 位异种移植肿瘤的组织微阵列(TMA)分析。为了确定亚型，本发明人采 用最近模板预测算法(Hoshida,2010)来进行基于单样品的亚型确定。该 分析鉴定出在数据集中的18个原神经，6个神经，13个典型和19个间充 质GBM(2个未确定；图1和5D)。

利用组织微阵列(TMA)切片，本发明人执行了一系列的针对截然不 同的GBM亚型标记的免疫组化分析，所述标记为：DLL3、SOX2和Olig2 (原神经)；MBP(神经)；PDGFA和EGFR(原神经)；CHI3L1、 MAP2和TOP2A(间充质)。

作为结果，发现在亲本GBM样本和相应的异种移植肿瘤中都检测到每 个亚型标记蛋白的优先表达(图5E)。

以上结果表明原位异种移植小鼠模型和它们的亲本肿瘤具有基因相似 性。

实验例4：功能相关性研究

实验例1至4的结果揭示了原位异种移植小鼠模型和它们的亲本肿瘤具 有相似的遗传、形态学和病理学性状。进一步地，本发明人检验了对于标准 的胶质母细胞瘤治疗的患者特异性反应是否能够在原位异种移植肿瘤模型中 被复制。

(1)放射疗法

为了检验对于放射疗法的功能相关性，本发明人随机选择在切除原发肿 瘤后临床接受放射治疗的5位患者(4位来自本发明文库，1位来自本发明 人最近出版的研究)[“827”，PFS＝128周][Son et al.,2009 Cell Stem Cell 4, 440-452.)]，然后将他们相应的异种移植肿瘤进行体内全脑放射(每天 2Gy，5天)。具有PC-NS07-448、PC-NS07-464、PC-NS08-578、PC-NS09- 780和827肿瘤的小鼠的生存通过放射疗法有不同的增长(分别地， 21.9％±7.1％、49.8％±14.1％、45.9％±8.6％、23.3％±19.5％和45.0％±5.9％， 图6A和7A)。

生存的增长与亲本肿瘤的PFS正相关(图6A)。特别地，对于具有亲 本肿瘤有相对短PFS的GBM(PC-NS07-448和PC-NS09-780)的小鼠，其 放射介导的生存益处要显著少于具有较长PFS的那些GBM(图6A)。

为了进一步阐述对于放射疗法的不同反应的临床意义，本发明人通过比 较在放疗后耐辐射的PC-NS07-448(“448”)和辐射敏感的PCNS07-464 (“464”)异种移植肿瘤的基因表达改变获得放射反应(RR)标签。结果 显示在下面的表4和图7B中。

表4

基于基因表达，在REMBRANDT数据集(n＝463，Madhavan et al., 2009Mol.Cancer Res.7,157-167)中的高级别神经胶质瘤被聚簇成为448-样 组(n＝267)和464-样组(n＝196)(图7B)。当将样品限制到219个胶质 母细胞瘤(IV级)时，174和45个GBM被分别聚簇成为448-样组和464- 样组。448-样高级别神经胶质瘤和GBM两者显示比464-样组(图7B)显 著恶化的临床结果，确认了RR标签的临床相关性。

(2)化学疗法

已知GBM患者根据MGMT基因启动子的甲基化状态对基于TMZ化学 疗法进行差异化反应。因而，本发明人检测了该差异化反应是否能够在本发 明的异种移植物小鼠模型中被复制。

与临床观察一致，TMZ化学疗法延长了具有MGMT-甲基化PC-NS07- 464肿瘤小鼠的OS(148.5％±45.4％，图6B)显著长于具有MGMT-未甲基 化PCNS09-559肿瘤(55.7％±38.6％，p<0.001，图6B)的小鼠。这些结果 与临床结果一致。

(3)靶向疗法

GBM的多血管性质提示抗血管生成的治疗，诸如VEGF-中和抗体、贝 伐单抗，可能具有有益活性。尽管使用常规GBM细胞系如U-87MG在动物 模型上显示出治疗效果，但是与标准治疗对照相比，它不能延长GBM患者 的OS。相应地，本发明人检测了贝伐单抗的抗肿瘤活性，并且检测效果示 出于图6。

作为结果，具有PC-NS07-448、PC-NS07-464、PC-NS08-559或PC- NS09-748异种移植肿瘤的小鼠的生存不会被贝伐单抗治疗改变(图6C)。 同样，尽管OS没被改变，但治疗使得异种移植肿瘤更加扩散(图6C)。 在使用贝伐单抗治疗的人GBM中也观察到这些形态学改变，这提示获自 GBM外科手术样品的异种移植肿瘤可以预测临床试验结果。

实验例5：体内肿瘤发生潜力的遗传标签

以上结果显示原代培养的GBM细胞的体内肿瘤发生潜力与对应的患者 的临床侵袭性相关联。因而，本发明人确定了由709个在肿瘤发生GBM (n＝36；图1)和非肿瘤发生GBM(n＝10)(图8A)中差异表达的基因 (改变多于1.5倍)所组成的“肿瘤发生”标签。

为了证实这一标签，本发明人将其应用到2个独立的GBM基因表达谱 数据集，TCGA和REMBRANDT。最近模板预测算法允许将每个GBM患 者预测成两组，与肿瘤发生标签正正向关联或负向关联。

当在两组中比较患者生存时，正向关联的组显示出与REMBRANDT数 据集负向关联的组相比显著恶化的生存(p<0.0001，log rank检验；图 8B)。

此外，排列分析显示不太可能偶然发现在生存上如此严重或更严重的分 离(P＝0.004)，这增强了标签的有效性(图9A)。通过TCGA数据集也 观察到统计学上显著的趋势(p＝0.019)。

为了观察不同的肿瘤发生潜力和临床侵袭性的生物学基础，本发明人转 而使用GSEA通路分析(gene set enrichment analysis:Clark and Ma'ayan, 2011 Sci.Signal.4,tr4；Subramanian et al.,2005Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102,15545-15550)。

分析揭示了与细胞周期、端粒维持、转录、页：26 Notch信号或Wnt信号相关的通路在具有体内肿瘤发生潜力的GBM中上 调，而与神经元或免疫功能相关的通路则被下调。

如果这些通路影响GBM的临床侵袭性，则可以用通路活性预测患者生 存。因而，本发明人设计了基于基因表达谱来计算每位患者的通路活性的方 法。特别地，定义通路活性在-1和1之间，分数大于0或小于0分别意味着 上调和下调。当计算REMBRANDT数据集的每位患者的PITX2通路 (PITX2是转录因子，作用在WNT下游)的通路活性时，本发明人发现上 调通路与更差的生存相对应(p＝0.002，log-rank检验；图8C)。

或者，通过Cox比例风险回归，高通路活性与更差的患者生存显著相 关联(p＝0.007，单侧Wald检验；图8D)。当扩展该分析到在BIOCARTA (图8D)、KEGG(图9B)和REACTOME(图9C)数据集的5个最上调 和下调通路时，本发明人观察到在有体内肿瘤发生潜力GBM中被上调或下 调的通路分别与差或较好的患者生存相关的显著趋势(对于所有3个数据库 p<0.05，KS检验)。

当与那些产生非扩散肿瘤(n＝13)或不产生肿瘤(n＝16)的GBM相 比，在小鼠脑产生扩散肿瘤(n＝29)的GBM在本发明的数据集中显示出显 著恶化的临床结果，本发明人找寻机会以进一步基于它们的不同的侵袭力将 GBM分层。因而，本发明人比较了“扩散”(n＝29)和“边缘清楚完整” (n＝13)组的基因表达。

作为结果，显示777个差异表达基因(改变多于1.5倍；图10)具有 “扩散性”标签(图10)。为了证实该标签，本发明人再次用REMBRANDT 数据集，做肿瘤发生标签。当比较两组中患者的生存时间时，扩散组显示出 比边缘清楚完整组显著恶化的生存(p＝0.027，log-rank检验；图10B)，这 提示扩散标签的可能的临床相关性。

本文详细描述了本发明的具体特征，当考虑到前面的描述时，这些仅是 优选的实施方案并且不对本发明的范围构成限制对于本领域的普通技术人员 是显而易见的。因此，本发明的真实范围包括附上的权利要求中引用的主题 的所有改进和等价物。

工业实用性

根据本发明的患者特异性胶质母细胞瘤小鼠模型具有显示与胶质母细胞 瘤患者对应的性状相同的形态学和遗传性状，从而可以有效地将其用于筛选 患者特异性胶质母细胞瘤治疗剂。特别地，当应用根据本发明的小鼠模型， 因为可预测患者对于候选治疗剂的反应和候选试剂的效果和负作用，所以能 有效地筛选患者特异性治疗剂。此外，患者特异性胶质母细胞瘤小鼠模型能 被应用于临床前平移研究以预测临床测试结果，而且特别地，能用于1.5期 临床试验(1期临床试验之后，2期临床试验之前)以选择患者和预测药物 效果。

序列目录

附上电子文件。