产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体及其应用

摘要

本发明公开了产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体及其应用。本发明将野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素的第71位酪氨酸突变为非芳香族氨基酸，获得了对于细胞或动物体减毒的ε毒素突变体。本发明进一步公开了含有所述产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞。本发明重组表达的产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体在体外以及小鼠体内均实现完全减毒且在小鼠模型中呈现良好的免疫原性和免疫保护性。本发明的产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体或其编码基因能够应用于制备预防产气荚膜梭菌病的ε毒素亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫苗。

说明书

技术领域

本发明涉及产气荚膜梭菌ε毒素，尤其涉及产气荚膜梭菌ε毒素减毒 突变体，本发明进一步涉及所述产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体在制备ε 毒素亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫苗中的应用，属于产气荚膜梭菌 ε毒素减毒突变体及其应用领域。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是芽孢杆菌科梭菌属的成员， 该菌可产生至少16种外毒素，并通过其产生的毒素发挥致病作用，可引 起多种动物发生肠毒血症和/或坏死性肠炎、人畜创伤性气坏疽以及人类 食物中毒。根据产生4种主要致死性外毒素α、β、ε、ι的种类，将该菌 分为A、B、C、D、E五个毒素型。

产气荚膜梭菌病具有发病急、病程短且死亡率极高的特点，一旦发病， 往往还来不及治疗就因外毒素中毒而发生猝死，因此免疫接种(而不是治 疗)是防控该病的有效方法。目前使用的商品化疫苗主要为灭活疫苗，其 在制备过程中涉及到外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底的安全隐 患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫 动物的致敏原，接种动物易产生副作用，而且导致免疫效果下降甚至免疫 失败。因此，近些年来研究者致力于梭菌毒素基因工程减毒疫苗的开发， 结果显示，针对主要毒素抗原片段的亚单位疫苗具有安全性好、有效抗原 含量高、免疫原性强等优点，具有诱人的开发前景。

ε毒素由B型和D型产气荚膜梭菌产生，其以前毒素的形式分泌于菌 体外，全长296个氨基酸。前毒素被宿主的胰蛋白酶和糜蛋白酶或梭菌自 身的λ蛋白酶作用后，去除N端11-13个以及C端22-29个氨基酸，从而 活化为成熟毒素。ε毒素属于β穿孔素家族的成员，是产气荚膜梭菌毒素 中毒力最强的毒素，其毒力仅次于肉毒杆菌素和破伤风神经毒素的毒力而 成为第三强的梭菌类毒素。因此，实现ε毒素的减毒以及构建相关减毒体， 对于开发ε毒素基因工程减毒亚单位疫苗以及其作为抗原组分的多价亚 单位疫苗的研究和应用就显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种产气荚膜梭菌(Clostridium  perfringens)ε毒素减毒突变体，其在体外细胞水平以及体内水平均实现完 全减毒且对动物呈现良好的免疫原性和免疫保护性。

本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案实现的：

本发明首先公开了产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)ε毒素减毒 突变体，该突变体通过将野生型ε毒素成熟毒素的第71位酪氨酸突变为 非芳香族氨基酸获得；其中，所述的非芳香族氨基酸是除酪氨酸、苯丙氨 酸以及色氨酸之外的氨基酸，优选为丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸或甘氨酸中 的任意一种；最优选为丙氨酸。

本发明野生型ε毒素成熟毒素基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所 示，野生型ε毒素成熟毒素的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；野生型ε 前毒素基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，其编码的氨基酸序列为 SEQ ID No.4所示。

本发明进一步提供了编码所述产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体的基 因，优选的，其核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。

本发明进一步公开了含有所述产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体的编 码基因的重组表达载体。将本发明的产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体的编 码基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操 作的与表达调控序列相连接。作为一个方案的例证，所述重组表达载体可 以为pET-22b-Etx-Y71A、pET-22b-Etx-Y71E、pET-22b-Etx-Y71G或 pET-22b-Etx-Y71S。

本发明还公开了含有所述重组表达载体的重组宿主细胞；所述重组宿 主细胞可为原核细胞或真核细胞。

本发明在ε毒素三维结构模型分析的基础上，选择ε毒素DomainⅢ 区的芳香族氨基酸Y71、F92、Y169和Y254作为突变位点，根据已发表 的ε毒素基因序列，针对ε前毒素基因Etx设计表达引物，同时设计突变 引物用于Y71A、F92A、Y169A与Y254A突变位点的引入，分别将这些 氨基酸突变为无特殊侧链结构的惰性氨基酸丙氨酸(A)；并且设计突变 引物用于Y71E、Y71G、Y71S、Y71F和Y71W突变位点的引入，将Y71 分别用谷氨酸(E)、苏氨酸(S)、甘氨酸(G)、色氨酸(W)以及苯 丙氨酸(F)这5个具有不同侧链结构的氨基酸进行替换。本发明以产气 荚膜梭菌D型参考株CVCC C60-1的基因组DNA为模板，对Etx基因进 行扩增，同时通过融合PCR扩增Etx突变体基因Etx-Y71A、Etx-F92A、 Etx-Y169A、Etx-Y254A、Etx-Y71E、Etx-Y71G、Etx-Y71S、Etx-Y71F和 Etx-Y71W。

本发明将扩增的野生型Etx基因及其突变体的基因片段克隆入原核表 达载体pET-22b(+)中构建重组质粒，转化大肠杆菌，诱导重组毒素的表达。

经鉴定，所有构建的重组毒素包括野生型ε前毒素rEtx及其突变体 rEtx-Y71A、rEtx-F92A、rEtx-Y169A与rEtx-Y254A以及Y71的5个突变 体rEtx-Y71E、rEtx-Y71S、rEtx-Y71G、rEtx-Y71W、rEtx-Y71F均在大肠 杆菌中实现可溶性表达，大小约35kDa。表达的重组野生型毒素及其突变 体均为前毒素形式，通过胰酶的活化，各种重组前毒素均被成功活化为大 小约为30kDa的成熟毒素，可用于功能性验证。胰酶的成功活化表明， 本发明表达的重组毒素的空间结构没有发生明显的改变。

本发明将活化的重组野生型毒素(rEtx)及其突变体作用MDCK细 胞后，检测其对细胞毒性。结果表明，野生型毒素在0.1μg/mL时即可完 全杀死细胞，与预期相符；在毒素突变体中，rEtx-Y169A、rEtx-Y254A 与rEtx对MDCK细胞的毒性相似，rEtx-F92A与rEtx相比，在0.01μg/mL 时的毒力弱于rEtx，但当浓度达到0.1μg/mL即可100％致死细胞；而突变 体rEtx-Y71A即使在10μg/mL时对细胞仍然没有毒性，显示该突变体在 细胞水平上成功减毒，这表明位于DomainⅢ中的Y71是ε毒素发挥其细 胞毒性的关键氨基酸。本发明将活化的Y71突变体rEtx-Y71E、rEtx-Y71S、 rEtx-Y71G、rEtx-Y71W以及rEtx-Y71F分别作用于MDCK细胞检测其细 胞毒性，以确定不同氨基酸侧链结构对Y71功能的影响。结果表明，当 Y71突变为非芳香族氨基酸E、G、S时，突变体在10μg/mL时对细胞仍 然没有毒性，表明这些突变体在细胞水平上成功减毒；只有当Y71突变 为芳香族氨基酸W或F时，突变体才具有细胞毒性，而且突变体 rEtx-Y71W在0.1μg/mL时即可完全杀死细胞，显示出与rEtx相似的细胞 毒性，强于突变体rEtx-Y71F的细胞毒性；该实验结果表明，Y71位点的 芳香环侧链结构是ε毒素发挥其细胞毒性所必需的。

本发明采用细胞钙离子流动试验检测活化的重组毒素作用细胞后钙 离子浓度的变化，以确定毒素对细胞的穿孔效应。结果表明，rEtx-F92A， rEtx-Y169A与rEtx-Y254A作用细胞后，细胞内的钙离子浓度明显增加， 其中rEtx-Y169A与rEtx-Y254A导致钙离子升高的程度与速度与rEtx相 似，高于rEtx-F92A，表明这三个突变体均能够导致细胞穿孔效应，其中 Y169与Y254两个位点的突变对毒素的穿孔效应没有影响；F92的突变则 对毒素的穿孔效应有所降低；而rEtx-Y71A作用细胞后，细胞内钙离子浓 度并没有出现明显的改变，表明该位点的突变使毒素丧失了对细胞的穿孔 能力。因此，本发明确定Y71是影响ε毒素发挥其细胞穿孔效应的关键氨 基酸。同样，对活化的Y71系列突变体(rEtx-Y71E、rEtx-Y71G、rEtx-Y71S、 rEtx-Y71F与rEtx-Y71W)的细胞穿孔效应检测结果表明，当rEtx-Y71F 与rEtx-Y71W作用于MDCK细胞后，细胞内的钙离子浓度出现了增加， 其中rEtx-Y71W导致钙离子增加的幅度与速度与rEtx相似，高于 rEtx-Y71F；而当Y71被非芳香族氨基酸E、G与S替换时，突变体则不 能导致细胞内钙离子浓度的增加，细胞也就不发生穿孔。表明，Domain  Ⅲ 71位氨基酸残基的芳香环侧链基团对于ε毒素发挥其细胞穿孔效应是 必需的，这与细胞毒性试验的结果相吻合。

为进一步确定突变体对毒素与细胞相互作用的影响以及Y71减毒体 的减毒机理，本发明采用激光共聚焦试验对突变体与细胞上的结合能力进 行了鉴定；结果表明，无论是活化的DomainⅢ芳香族氨基酸突变体 (rEtx-Y71A、rEtx-F92A、rEtx-Y169A与rEtx-Y254A)还是Y71系列突 变体(rEtx-Y71E、rEtx-Y71G、rEtx-Y71S、rEtx-Y71F与rEtx-Y71W) 均与rEtx相似，在激光共聚焦显微镜观察下，均能在细胞膜上出现明显 的绿色荧光，显示这些突变体均能够结合在MDCK细胞的细胞膜上，表 明ε毒素DomainⅢ的芳香族氨基酸不是细胞受体结合位点，因此这些氨 基酸的的替换并不影响毒素与MDCK细胞的结合；而Y71突变体毒力的 丧失是由于影响了其与细胞结合后的穿孔作用，这与DomainⅠ中关键氨 基酸的作用机理是不同的。

本发明的产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体能够应用于制备预防产气 荚膜梭菌病的ε毒素亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫苗。

本发明所述重组产气荚膜梭菌ε毒素减毒体的编码基因能够应用于 制备预防产气荚膜梭菌病的ε毒素亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫 苗。

本发明还公开了一种ε毒素亚单位疫苗组合物，包括：免疫上有效量 的所述产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体和药学上可接受的佐剂；

优选的，所述ε毒素亚单位疫苗组合物由ε毒素减毒体rEtx-Y71A与 油佐剂按照体积比85：15组成。

小鼠毒力试验结果表明，减毒突变体rEtx-Y71A成熟毒素不仅在细胞 水平上实现了减毒，而且在小鼠体内也成功实现了减毒。

减毒体前毒素在小鼠模型的免疫保护试验结果表明，减毒突变体 rEtx-Y71A前毒素免疫小鼠后诱导了高水平的特异性IgG抗体，对小鼠呈 现良好免疫原性；免疫保护性评价实验结果表明，减毒突变体rEtx-Y71A 前毒素的免疫保护性与野生型前毒素rEtx的免疫保护性无明显差异，对 小鼠呈现良好的免疫保护性，这间接表明Y71A的突变没有改变ε毒素的 抗原结构，减毒突变体rEtx-Y71A前毒素能够应用于制备预防产气荚膜梭 菌病的ε毒素亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫苗。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明首次确定了位于ε毒素成熟毒素的第71位酪氨酸(Y71)是决 定该毒素细胞毒性与细胞穿孔效应的关键氨基酸，该位点的芳香环基团侧 链是毒素发挥其细胞毒性以及穿孔能力所必需的。本发明将野生型ε毒素 成熟毒素的第71位酪氨酸突变为非芳香族氨基酸丙氨酸、谷氨酸、苏氨 酸或甘氨酸，构建的ε毒素减毒突变体在体外细胞水平以及小鼠体内均实 现完全减毒，且在小鼠模型呈现良好的免疫原性和免疫保护性，能够应用 于制备预防产气荚膜梭菌病的ε毒素亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位 疫苗。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明 所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、 脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则 所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似 于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除 非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽 核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。 除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包 括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定 而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经 混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem. 260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell. Probes 8:91-98(1994))。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞， 而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、 f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒 的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核 细胞。

术语“表达”意指内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。

可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物，其包 括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物 可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括 增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以 另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括例如佐剂或免疫 调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在 经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过 合适方法灭活的生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位 疫苗，或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的 疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。

术语“佐剂”意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合 物的抗原性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性 增强免疫应答的淋巴样系统激活。通常，在不存在佐剂的情况下，用单独抗 原的初次疫苗接种将无法引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全 弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质。

附图说明

图1为ε前毒素晶体结构示意图；

图2为重组ε毒素及其突变体的可溶性表达；其中，M：Marker；1： pET-22b(+)空载体；2：pET-22b-rEtx；3：pET-22b-rEtx-Y71A；4： pET-22b-rEtx-F92A；5：pET-22b-rEtx-Y169A；6：pET-22b-rEtx-Y254A；

图3为重组ε毒素及其突变体的提纯；其中，M：Marker；1：rEtx； 2：rEtx-Y71A；3：rEtx-F92A；4：rEtx-Y169A；5：rEtx-Y254A；

图4为重组ε毒素及其突变体的活化；其中，(A)：胰酶作用于前 毒素的位点示意图；(B)：经胰酶活化毒素的SDS-PAGE分析；

图5为ε毒素DomainⅢ芳香族氨基酸突变体对MDCK的细胞毒性测 定；其中，WT：rEtx；Y71A：rEtx-Y71A；F92A：rEtx-F92A；Y169A： rEtx-Y169A；Y254A：rEtx-Y254A；

图6为ε毒素Y71系列突变体的提纯与活化；其中，(A)：突变体 的提纯；(B)：突变体的活化以及突变氨基酸的侧链结构；

图7为ε毒素Y71突变体对MDCK细胞的毒性；

图8为ε毒素突变体对MDCK细胞的穿孔效应；其中，(A)：Domain Ⅲ芳香族氨基酸突变体作用MDCK细胞后引起细胞内钙离子浓度的动态 变化；其中，WT：rEtx；Y71A：rEtx-Y71A；F92A：rEtx-F92A；Y169A： rEtx-Y169A；Y254A：rEtx-Y254A；(B)：Y71系列突变体作用MDCK 细胞后引起细胞内钙离子浓度的动态变化；其中，WT：rEtx；Y71A： rEtx-Y71A；Y71W：rEtx-Y71W；Y71F：rEtx-Y71F；Y71E：rEtx-Y71E； Y71G：rEtx-Y71G；Y71S：rEtx-Y71S；

图9为ε毒素突变体对MDCK细胞的结合能力；其中，(A)：ε毒 素DomainⅢ芳香族氨基酸突变体与MDCK细胞的结合；(B)：ε毒素 Y71系列突变体与MDCK细胞的结合；(C)：ε毒素与BHK-21细胞的 结合；

图10为间接ELISA检测免疫小鼠血清中rEtx特异性IgG抗体。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明 的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的 精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这 些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、试验材料、试剂、菌株、细胞与试验动物

胰酶购自sigma公司；蛋白酶抑制剂购自promega公司；Fluo-4 Direct^TMCalcium Assay Kits钙离子检测试剂盒购自Invitrogen公司； CCK-8试剂盒购自碧云天公司；Ex taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司； T4DNA连接酶及各种限制性内切酶均购自NEB公司；辣根过氧化物酶 标记的羊抗鼠IgG(HRP-IgG)、FITC标记的山羊抗小鼠IgG与IPTG均为 Sigma公司产品；DAPI染料购自碧云天公司；Ni-NTA Agarose购自Qiagen 公司；化学试剂均为分析纯试剂；

MDCK细胞系由本发明人实验室冻存；

D型产气荚膜梭菌参考株CVCC C60-1购自中国兽医药品监察所菌 种保藏中心；

6-8周龄清洁级雌性BALB/c小鼠，购自中国农业科学院哈尔滨兽医 研究所实验动物中心。

实施例1重组产气荚膜梭菌ε毒素减毒体的表达与鉴定

1、实验方法

1.1 目的基因的扩增

根据已发表的ε毒素基因序列，针对ε前毒素基因Etx设计表达引物， 并在表达引物的上下游引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，同时设计突变引物 用于Y71A、F92A、Y169A与Y254A突变位点以及Y71E、Y71G、Y71S、 Y71F和Y71W突变位点的引入。引物序列详见表1。

表1用于扩增Etx基因及其突变体的引物及其序列

注：斜体为引入的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，下划线为编码突变氨基酸的核苷酸。

以产气荚膜梭菌D型参考株CVCC C60-1的基因组DNA为模板，对 Etx基因进行扩增，同时通过融合PCR扩增Etx突变体基因Etx-Y71A、 Etx-F92A、Etx-Y169A、Etx-Y254A、Etx-Y71E、Etx-Y71G、Etx-Y71S、 Etx-Y71F和Etx-Y71W。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：94℃解链5min，1个循环；94℃变性30s，55℃ 退火30s，72℃延伸60s，共40个循环；72℃延伸10min。取5μl PCR 产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

1.2 原核表达质粒的构建

将扩增的目的基因Etx、Etx-Y71A、Etx-F92A、Etx-Y169A、Etx-Y254A、 Etx-Y71E、Etx-Y71G、Etx-Y71S、Etx-Y71F和Etx-Y71W分别用Axygen 凝胶回收试剂盒进行切胶回收，回收产物经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后，再 次进行切胶回收，将回收的基因片段分别与同样经酶切处理的pET-22b(+) 原核表达载体在T4DNA连接酶的作用下于16℃进行连接。

反应体系如下：

连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建重组表达菌株并 分别涂布于含Amp(100μg/mL)抗性的LB培养基平板，37℃培养16h，挑 取单菌落，接种于Amp(100μg/mL)抗性的LB液体培养基，37℃、225×g 振荡培养12h，提取质粒并进行NcoⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，将鉴定为阳 性的重组质粒分别命名为pET-22b-Etx、pET-22b-Etx-Y71A、 pET-22b-Etx-F92A、pET-22b-Etx-Y169A、pET-22b-Etx-Y254A、 pET-22b-Etx-Y71E、pET-22b-Etx-Y71G、pET-22b-Etx-Y71S、 pET-22b-Etx-Y71F和pET-22b-Etx-Y71W，并送北京华大公司测序。

1.3 重组毒素的诱导表达与纯化

将质粒测序为阳性的重组菌分别以1％转接于Amp(100μg/mL)抗性的 LB液体培养基37℃、225×g振荡培养12h进行活化，将活化的菌液再以 1％转接于Amp(100μg/mL)抗性的LB液体培养基37℃、225×g振荡培养 2h左右，待菌液OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG于30℃、 225×g诱导6h。收集诱导后菌液，于12000rpm离心2min，弃掉上清， 沉淀用PBS重悬后进行超声破碎，超声破碎后将蛋白样品于12000rpm离 心30min，取离心后的上清液进行12％的SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束 后将凝胶进行考马斯亮蓝染色液染色20min后，使用考马斯亮蓝染色脱色 液进行脱色，观察结果。在确定蛋白以可溶形式表达后，对目的蛋白进行 镍柱亲和层析，用含不同浓度(20mM-80mM)咪唑的磷酸盐缓冲液对杂 蛋白进行洗涤，以确定咪唑的最佳洗涤浓度，最后用含250mM咪唑的磷 酸盐缓冲液对目的蛋白进行洗脱，将洗脱的蛋白进行12％的SDS-PAGE 分析，以确定蛋白提纯效果，应用BCA蛋白浓度检测试剂盒对提纯蛋白 的浓度进行测定。

1.4 重组野生型ε毒素及其突变体的活化

通过胰酶活化使前体形式的野生型毒素或突变体转变为成熟毒素，向 纯化的前毒素中加入0.05％的胰酶，于37℃水浴1h，向活化的成熟毒素 中加入1％的蛋白酶抑制剂以去除胰酶活性，并对活化的成熟毒素进行 SDS-PAGE分析。

1.5 细胞毒性试验

采用CCK-8试剂盒检测纯化的野生型毒素及其突变体对MDCK细胞 的毒性。将MDCK用含8％胎牛血清的DMEM培养液接种于96孔板，置 于含5％CO₂的37℃培养箱中过夜培养，使细胞密度约为3×10⁴/孔；将重 组野生型毒素及其突变体用无血清DMEM以10倍梯度进行稀释 (10μg/mL至0.001μg/mL)，将稀释的重组毒素加入MDCK细胞中， 100μL/孔，于含5％CO₂的37℃培养箱中孵育16h；将CCK-8溶液以体积 比1:10加入细胞孔中，于37℃培养箱中孵育1h，活细胞的线粒体内的脱 氢酶会将CCK-8还原成橙色的formazan，最终通过EnVision Multilabel  酶标仪读取450nm的吸光度值来确定细胞活力，从而检测重组毒素对 MDCK细胞的毒性。

1.6 细胞钙离子流动试验

采用Fluo-4Direct^TMCalcium Assay试剂盒进行细胞钙离子流动试验， 通过检测细胞内钙离子浓度的变化来对重组毒素对细胞的穿孔效应进行 检测。将MDCK用含8％胎牛血清的DMEM培养液接种于底面透明的黑 色96孔板中，置于含5％CO2的37℃培养箱中过夜培养，使细胞密度约 为3×10⁴/孔；按照试剂盒说明书将2×Fluo-4Direct^TMcalcium reagent  loading solution与无血清的DMEM以1:1体积混合加入细胞中，100μL/ 孔，于37℃培养箱中孵育30min，再置于室温中孵育30min；孵育后将细 胞用HBSS缓冲液(25mM HEPES,pH 7.5；125mM NaCl；5mM KCl；6mM glucose；12mM MgCl₂)洗三次，将重组野生型毒素及其突变体用含有 2mM CaCl₂的HBSS缓冲液稀释至10μg/mL后加入细胞中，100μL/孔；通 过EnVision Multilabel酶标仪于37℃每隔5min检测在485nm激发波长、 516nm放射波长下的荧光信号强度，通过Fluo-4标记的钙离子荧光强度 的动态变化来确定细胞内外钙离子的流动，从而检测毒素对细胞的穿孔效 应。

1.7 激光共聚焦试验

采用激光共聚焦实验检测ε毒素突变体与MDCK细胞的结合能力。 将MDCK细胞消化后，铺在Nest 20mm细胞培养皿中(cat.No.801001)， 于37℃含5％CO₂恒温培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，弃去培养液， 用37℃预热PBS缓冲液清洗细胞。将重组野生型毒素及其突变体用无 血清的DMEM稀释至10μg/mL后，取200μL加入细胞中，于37℃孵育 5min，弃去含毒素的培养液，用PBS缓冲液清洗细胞三次，每次5min， 弃去PBS，加入-20℃预冷的无水乙醇室温固定30min，弃去无水乙醇， 每个小皿加入200μL用PBS以1：100稀释的鼠源抗毒素多克隆抗体于 37℃孵育50min，PBS缓冲液清洗细胞四次，每次5min，每个小皿加入 200μL用PBS以1：100稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG于37℃孵育 40min，PBS缓冲液清洗细胞四次。在每个小皿中加入DAPI染料(碧云 天)300ul，室温处理5min，随后用PBS缓冲液清洗细胞四次。最后样 本浸泡于PBS中，于激光共聚焦显微镜下检测毒素与MDCK细胞的结合 能力。

2、实验结果

2.1 ε毒素DomainⅢ芳香族氨基酸突变体的表达与鉴定

2.1.1 ε毒素DomainⅢ芳香族氨基酸突变体的表达与提纯

选择ε毒素DomainⅢ区的芳香族氨基酸Y71、F92、Y169和Y254 作为突变位点(图1)，分别将这些氨基酸突变为无特殊侧链结构的惰性 氨基酸丙氨酸(A)。点突变通过融合PCR技术引入到野生型毒素序列中， 随后将野生型及其突变体的基因片段克隆入原核表达载体pET-22b(+)中 构建重组质粒。经鉴定，所有构建的重组毒素包括野生型ε前毒素rEtx 及其突变体rEtx-Y71A、rEtx-F92A、rEtx-Y169A与rEtx-Y254A均在大肠 杆菌中实现可溶性表达，大小约35kDa(图2)。通过Ni柱亲和层析对 表达的重组毒素进行纯化，SDS-PAGE分析显示(图3)，所有蛋白的纯 度达到电泳纯，无明显可见的杂带。

2.1.2 重组毒素的活化及鉴定

表达的重组野生型毒素及其突变体均为前毒素形式，为验证其功能， 需先通过胰酶的活化将其转化为成熟毒素的形式(图4A)。经SDS-PAGE 鉴定，大小约为35kDa的各种重组前毒素均被成功活化为大小约为30kDa 的成熟毒素(图4B)，可用于下一步功能性验证。同时，胰酶的成功活 化也表明，表达的重组毒素的空间结构没有发生明显的改变。

2.1.3 ε毒素的DomainⅢ芳香族氨基酸突变体对MDCK细胞的毒性

将活化的重组野生型毒素(rEtx)及其突变体作用MDCK细胞后， 通过CCK-8试剂盒对其细胞毒性进行检测。结果如图5所示，野生型毒 素在0.1μg/mL时即可完全杀死细胞，与预期相符；在毒素突变体中， rEtx-Y169A、rEtx-Y254A与rEtx对MDCK细胞的毒性相似，rEtx-F92A 与rEtx相比，在0.01μg/mL时的毒力弱于rEtx，但当浓度达到0.1μg/mL 即可100％致死细胞；而突变体rEtx-Y71A即使在10μg/mL时对细胞仍然 没有毒性，显示该突变体在细胞水平上成功减毒，这表明位于DomainⅢ 中的Y71是ε毒素发挥其细胞毒性的关键氨基酸。

2.2 Y71系列突变体的表达、提纯与鉴定

2.2.1 Y71系列突变体的表达、提纯与活化

将影响细胞毒性的关键氨基酸Y71分别用谷氨酸(E)、苏氨酸(S)、 甘氨酸(G)、色氨酸(W)以及苯丙氨酸(F)这5个具有不同侧链结 构的氨基酸进行替换，分别构建Y71的5个突变体rEtx-Y71E、rEtx-Y71S、 rEtx-Y71G、rEtx-Y71W以及rEtx-Y71F，旨在确定Y71氨基酸位点影响 毒素功能的关键侧链基团。结果显示，所有毒素突变体在大肠杆菌中均实 现可溶性表达，大小约为35kDa，通过Ni柱亲和层析对表达的重组毒素 进行纯化，SDS-PAGE分析显示(图6A)，所有蛋白的纯度达到电泳纯， 无明显可见的杂带。将各突变体经过胰酶活化后，均成功转变为约30kDa 的成熟毒素(图6B)，表明突变体的空间结构没有发生明显的改变，可 用于下一步功能性验证。

2.2.2 ε毒素Y71突变体对MDCK细胞的毒性

将活化的Y71突变体rEtx-Y71E、rEtx-Y71S、rEtx-Y71G、rEtx-Y71W 以及rEtx-Y71F分别作用于MDCK细胞检测其细胞毒性，以确定不同氨 基酸侧链结构对Y71功能的影响。以WT作为阳性对照，以无毒突变体 rEtx-Y71A作为阴性对照。结果如图7所示，当Y71突变为非芳香族氨基 酸E、G、S时，突变体在10μg/mL时对细胞仍然没有毒性，表明这些突 变体在细胞水平上成功减毒；只有当Y71突变为芳香族氨基酸W、F时， 突变体才具有细胞毒性，而且突变体rEtx-Y71W在0.1μg/mL时即可完全 杀死细胞，显示出与rEtx相似的细胞毒性，强于突变体rEtx-Y71F的细胞 毒性。该结果表明，Y71位点的芳香环侧链结构是ε毒素发挥其细胞毒性 所必需的。

2.3 ε毒素突变体对MDCK细胞的穿孔效应

采用细胞钙离子流动试验检测活化后的重组毒素作用细胞后钙离子 浓度的变化，以确定毒素对细胞的穿孔效应，设立重组野生型毒素rEtx 作为对照。将DomainⅢ芳香族氨基酸突变体(rEtx-Y71A、rEtx-F92A、 rEtx-Y169A与rEtx-Y254A)作用于MDCK细胞，通过荧光信号强度来 检测细胞内钙离子浓度的变化，结果如图8A所示：rEtx-F92A，rEtx-Y169A 与rEtx-Y254A作用细胞后，细胞内的钙离子浓度明显增加，其中 rEtx-Y169A与rEtx-Y254A导致钙离子升高的程度与速度与rEtx相似， 高于rEtx-F92A，表明这三个突变体均能够导致细胞穿孔效应，其中Y169 与Y254两个位点的突变对毒素的穿孔效应没有影响；F92的突变则对毒 素的穿孔效应有所降低；而rEtx-Y71A作用细胞后，细胞内钙离子浓度并 没有出现明显的改变，表明该位点的突变使毒素丧失了对细胞的穿孔能 力。因此，本发明确定Y71是影响ε毒素发挥其细胞穿孔效应的关键氨基 酸。

同样，通过钙离子流动试验对Y71系列突变体(rEtx-Y71E、 rEtx-Y71G、rEtx-Y71S、rEtx-Y71F与rEtx-Y71W)的细胞穿孔效应进行 检测，结果如图8B所示。当rEtx-Y71F与rEtx-Y71W作用于MDCK细 胞后，细胞内的钙离子浓度出现了增加，其中rEtx-Y71W导致钙离子增 加的幅度与速度与rEtx相似，高于rEtx-Y71F；而当Y71被非芳香族氨基 酸E、G与S替换时，突变体则不能导致细胞内钙离子浓度的增加，细胞 也就不发生穿孔。结果表明，DomainⅢ 71位氨基酸残基的芳香环侧链基 团对于ε毒素发挥其细胞穿孔效应是必需的，这与细胞毒性试验的结果 (图5和图7)相吻合。

2.4 ε毒素突变体与MDCK细胞的结合能力

细胞毒性试验与钙离子流动试验的结果表明，Y71的突变体可使毒素 丧失其细胞毒性以及对细胞的穿孔能力。为进一步确定突变体对毒素与细 胞相互作用的影响以及Y71减毒体的减毒机理，采用激光共聚焦试验对 突变体与细胞上的结合能力进行了鉴定，以野生型毒素(rEtx)作为阳性 对照，已被鉴定与细胞无结合能力的突变体rEtx-Y30E作为阴性对照(Ivie  et al.,2012)。结果如图9所示，无论是活化的DomainⅢ芳香族氨基酸突 变体(rEtx-Y71A、rEtx-F92A、rEtx-Y169A与rEtx-Y254A)(图9A) 还是Y71系列突变体(rEtx-Y71E、rEtx-Y71G、rEtx-Y71S、rEtx-Y71F与 rEtx-Y71W)(图9B)均与rEtx相似，在激光共聚焦显微镜观察下，均 能在细胞膜上出现明显的绿色荧光，显示这些突变体均能够结合在MDCK 细胞的细胞膜上，表明ε毒素DomainⅢ的芳香族氨基酸不是细胞受体结 合位点，因此这些氨基酸的的替换并不影响毒素与MDCK细胞的结合； 而Y71突变体毒力的丧失是由于影响了其与细胞结合后的穿孔作用，这 与DomainⅠ中关键氨基酸的作用机理是不同的。

同时，为了验证突变体是与MDCK细胞发生特异性结合，选取野生 型毒素rEtx与突变体rEtx-Y71A作用于BHK-21细胞，并进行激光共聚 焦试验，结果如图9C显示，rEtx与rEtx-Y71A均不能与BHK细胞发生 结合，表明毒素及其突变体与MDCK细胞的结合作用是特异性的。

实施例2 ε毒素减毒体在小鼠模型减毒效果检测及免疫保护试验

1、实验方法

1.1 减毒体在小鼠模型减毒效果的检测

对实施例1筛选到的减毒体rEtx-Y71A在小鼠体内的毒力进行检测， 将活化的rEtx-Y71A通过腹腔途径接种小鼠，设置6个接种剂量，分别为 20ng、50ng、100ng、1000ng、10000ng与100000ng，每个剂量接种5 只小鼠，同时设置重组野生型成熟毒素rEtx作为对照，接种后观察3日， 记录小鼠副反应以及死亡情况。

1.2 减毒体在小鼠模型的免疫保护试验

免疫原的制备：实施例1筛选到的减毒体rEtx-Y71A前毒素与油佐剂 ISA 15A VG(SEPPIC，法国)以85：15的体积比混合，于震荡漩涡器 中充分混匀，备用；另外设置野生型ε前毒素rEtx抗原作为对照，其制 备过程如下：将纯化的rEtx加入5％甲醛溶液于37℃灭活三天，并进行灭 活检验。灭活后rEtx与油佐剂ISA 15A VG(SEPPIC，法国)以85：15 的体积比混合，于震荡漩涡器中充分混匀，备用。

将50只小鼠随机分为4组，其中rEtx免疫组与rEtx-Y71A免疫组各 20只，PBS加佐剂对照组5只，PBS对照组5只，重组毒素的免疫剂量 均为10μg/只，两次免疫，首免14天后进行二免，于二免21天后进行小 鼠腹腔攻毒。攻毒毒素采用D型产气荚膜梭菌参考株C60-1的粗提上清。 两个重组毒素免疫组均设置4个攻毒剂量，分别为：1LD₁₀₀，10LD₁₀₀， 100LD₁₀₀与200LD₁₀₀，每个攻毒剂量分别攻5只小鼠，两个对照组的攻毒 剂量均为1LD₁₀₀。攻毒后观察3d，记录小鼠死亡情况。

小鼠血清IgG抗体的检测：于免疫后第0、7、14、21、28、35天进 行小鼠尾静脉采血并分离血清。以rEtx为包被抗原，采用间接ELISA检 测各免疫组小鼠血清中针对重组ε毒素的特异性IgG抗体。将纯化的rEtx 用0.05M碳酸盐包被液稀释为0.06μg/孔的剂量包被于高亲和力96孔板 (sigma，美国)4℃过夜，次日，用PBST洗板3次，每次5min，加入5％ 的脱脂乳，37℃封闭1h，用PBST洗版3次，每次5min，加入1:100稀 释的小鼠待检血清，37℃孵育1h，用PBST洗版3次，每次5min，加入 1:2500稀释的羊抗鼠HRP-IgG，37℃孵育1h，用PBST洗版3次，每次 5min，TMB避光显色10min，读取OD450nm吸光度值。

2、实验结果

2.1 ε毒素减毒体rEtx-Y71A对小鼠的毒力

实施例1的细胞毒性试验以及钙离子流动试验结果均显示，ε毒素突 变体rEtx-Y71A实现了在细胞水平上的减毒。为验证该减毒体在体内的减 毒效果，将活化的rEtx-Y71A以不同的剂量接种小鼠，结果如表2所示： 当接种剂量为100000ng时，所有小鼠均健活且无不良反应，而野生型对 照组在接种100ng时即可导致小鼠100％死亡。该结果表明，rEtx-Y71A 不仅在细胞水平上实现了减毒，而且在小鼠体内也成功减毒，被确定为ε 毒素减毒体。

表2减毒体在小鼠体内的毒力

^a：未做。

2.2 减毒体rEtx-Y71A在小鼠模型的免疫原性评价

为验证减毒体rEtx-Y71A的突变是否对毒素的免疫原性产生影响，将 减毒体rEtx-Y71A前毒素免疫小鼠，用间接ELISA对免疫小鼠血清中针 对野生型前毒素rEtx的IgG抗体进行检测，结果如图10所示：减毒体免 疫组在首免后即出现针对rEtx的IgG抗体，并且在加强免疫后，IgG抗体 水平出现了明显的上升，其抗体产生的动态水平与野生型rEtx极其相近， 而PBS以及佐剂对照组的特异性IgG抗体均为阴性。结果表明，减毒体 rEtx-Y71A对小鼠具有良好的免疫原性，Y71A突变对毒素的免疫原性没 有任何影响。

2.3 减毒体rEtx-Y71A在小鼠模型的免疫保护性评价

将减毒体rEtx-Y71A前毒素免疫小鼠后，以D型产气荚膜梭菌参考 菌株C60-1的粗提毒素进行攻毒，结果如表3所示：当攻毒剂量达到 10LD₁₀₀时，减毒体rEtx-Y71A与野生型rEtx均能对免疫小鼠产生完全保 护；当攻毒剂量为100LD₁₀₀时，rEtx-Y71A与rEtx免疫组小鼠均存活80％； 当攻毒剂量提高到200LD₁₀₀时，Y71A与rEtx均对小鼠无保护作用；PBS 组以及PBS加佐剂组小鼠在1LD₁₀₀的攻毒剂量下均全部死亡。结果表明， 减毒体rEtx-Y71A前毒素具有良好的免疫保护性，与野生型前毒素rEtx 的免疫保护性无明显差异，同时也间接表明Y71A的突变没有明显改变ε 毒素的抗原结构，因此减毒体rEtx-Y71A前毒素可作为ε毒素亚单位疫苗 的抗原蛋白。

表3减毒体rEtx-Y71A前毒素对小鼠的免疫保护作用

^a:不同小写字母代表数据具有显著性差异(卡方检验，P<0.05)。