牛产气荚膜梭菌毒素亚单位多价疫苗以及Epsilon毒素减毒机理的研究

摘要

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens，C. perfringens)是革兰氏阳性厌氧芽孢梭菌，广泛分布于自然界的土壤、污水、粪便、饲料、食物中，也是人和温血动物肠道中的常在菌，属于条件致病菌。产气荚膜梭菌至少可产生16种毒素，根据其产生4种主要毒素α、β、ε、ι的种类分为A、B、C、D、E5个毒素型。该菌通过其产生的毒素发挥致病作用，可引起人畜创伤性气坏疽、人类食物中毒以及多种动物的坏死性肠炎、肠毒血症。 一直以来，产气荚膜梭菌就是危害全球养牛业的重要病原。尽管牛产气荚膜梭菌病常以散发的形式出现，但由于该病发病迅猛、并且缺乏有效的治疗手段，导致的死亡率极高，往往对养牛产业造成严重的经济损失。自2010年以来，我们对黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等地大型牛场的牛猝死症病例进行病原流行病学调查，对采集的30例猝死症病例进行产气荚膜梭菌的分离与鉴定。结果显示，产气荚膜梭菌仍然是导致牛猝死症的主要病原菌，其分离率高达73.33%，其中，A型菌株占分离株总数的86.36%、是导致牛猝死症的主要产气荚膜梭菌毒素型，其次为 D型、占分离菌总数的13.64%。产气荚膜梭菌瞬时大量复制导致肠毒血症，是引起牛猝死的主要因素，占到送检牛猝死病例的56.57%，其产气荚膜梭菌分离率高达88.24%；同时发现，该菌继发于牛的产后生殖系统疾病，也是引起牛猝死的重要因素。对分离株的毒素基因进行序列分析发现，部分分离菌株除主要毒素基因外还携带cpb2基因，经序列分析确定，是非典型cpb2。上述流行病学调查研究，对于确定我国流行菌株的毒素型及其亚单位疫苗的研究是必要的，为牛产气荚膜梭菌病的防控体系的建立奠定了理论和实验基础。 在病原流行病学调查的基础上，对牛产气荚膜梭菌的外毒素亚单位疫苗进行了研究。研究针对引发牛猝死症的主要梭菌外毒素α、ε以及β，首先对其编码基因的片段进行原核表达，然后对表达的毒素蛋白用小鼠模型进行安全性检测与免疫原性评价，据此筛选多价毒素亚单位疫苗的保护性抗原组分，最终通过牛体免疫试验评价多价亚单位疫苗的免疫原性。结果表明，针对α、ε以及β毒素的重组减毒蛋白rCpa247-370、rCpb以及rEtxHP在小鼠模型显示良好的安全性，免疫小鼠可抵抗致死剂量天然毒素的攻击，各重组毒素单独或联合免疫牛均呈现良好的免疫原性，能够诱导高水平的血清IgG抗体以及中和抗体；而且，该多价疫苗剂型可覆盖对牛致病的主要产气荚膜梭菌毒素型A、C和D型，显示其具有潜在的应用价值和开发潜力。 在毒素亚单位疫苗的研究中，重组毒素蛋白的成功减毒对于疫苗的安全性至关重要。因此，筛选毒素减毒体并研究其减毒机理，对减毒毒素亚单位疫苗的研究具有重要意义。ε毒素在所有产气荚膜梭菌外毒素中毒力最强，是重要的生物恐怖因子。我们通过对该毒素晶体结构的分子模拟分析，采用定点突变构建突变体的方式筛选减毒体，通过细胞毒性试验、钙离子流出试验、检测毒素与细胞结合以及聚合等手段，对其减毒机理进行研究。结果表明，位于ε毒素 DomainⅢ的71位酪氨酸（Y71）是影响该毒素细胞毒性与细胞穿孔效应的关键氨基酸，而该位点氨基酸残基的芳香环基团是毒素发挥其细胞毒性与穿孔效应所必需的；该位点的丙氨酸替换减毒体Y71A，在体外细胞水平以及小鼠体内均无明显毒性，并且在小鼠模型呈现良好的免疫保护性，可作为ε毒素候选疫苗抗原。这些研究，为进一步了解ε毒素结构与功能关系、开发ε毒素亚单位疫苗的研究奠定了理论基础。

目录

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英文缩略表

第一章 引 言

1.1 产气荚膜梭菌概述

1.2 牛产气荚膜梭菌病概述

1.3 牛产气荚膜梭菌外毒素研究进展

1.4 本研究的目的与意义

第二章 我国部分地区牛源产气荚膜梭菌的病原流行病学调查

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 产气荚膜梭菌毒素亚单位疫苗的研究

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 产气荚膜梭菌ε毒素减毒体的筛选及其减毒的分子机制

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历