家猪肿瘤坏死因子突变体的构建及蛋白表达纯化方法

摘要

本发明涉及家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)基因定点突变与蛋白制备方法和应用，本发明所述的猪肿瘤坏死因子(TNF-α)的一个突变体基因，它具有SEQ？ID？NO.2所示的序列。此突变体基因翻译蛋白氨基酸序列具有SEQ？ID？NO.3所示的序列，将此突变体连接到pET28a原核表达质粒中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达，Ni

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及家猪肿瘤坏死因子突变体基因的构 建、表达、蛋白纯化及活性鉴定技术。

背景技术

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)是1975年发现的一种具有抗 肿瘤效果的细胞因子，是迄今发现的对肿瘤细胞杀伤性最好的细胞因子，属于肿 瘤坏死因子超家族成员。TNF-α除对肿瘤细胞具有直接的抑制增殖和细胞坏死作 用外，对其他细胞(包括心肌细胞)的生长分化也有影响，同时还有抗病毒及细 菌感染；刺激T细胞、B细胞、单核巨噬细胞等，使其功能增强；诱发炎症反应， 促进IL1、IL2、IL6等的产生及分泌；促进EGFR及主要组织相容性抗原Ⅱ类 抗原(MHCⅡAg)等的表达等，在宿主防御反应中起重要作用。TNF-α主要是通 过与靶细胞膜上肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)结合, 实现其细胞毒性、抗病毒细菌感染、免疫调节等生物学功能，具有广泛的生物学 活性。

人用TNF-α能被肾脏快速排泄及被各种蛋白酶分解,在体内半衰期很短 (15-30min),而发挥作用需要12-36h。若频繁大剂量注射,则会导致严重的不良 反应,如发热、恶心呕吐、头痛、低血压等,甚至能引起休克、死亡。TNF-α在 人体的耐受量仅为其有效量的1/10～1/50。因此,用TNF-α治疗癌症被局限于肿瘤 组织内给药,以获得较高的局部浓度。为了更好的利用TNF-α，提高其生物学活 性，降低其系统毒副作用，近年来，国内外科学家通过定点突变技术对TNF-α基 因进行定点突变，从而达到增加TNF-α活性并降低其毒性的目的。2003年第四军 医大学生物技术中心的张英起教授通过蛋白质工程技术对TNF-α重组改造之后 获得高活性低毒性的新型突变体，突变后的肿瘤坏死因子与天然重组人肿瘤坏死 因子相比，毒性降低了100到1000倍，但对肿瘤细胞的杀伤活性和抑瘤作用达到 60％以上。该研究已经获得国家一类新药物制品证书，这是目前世界上第一个被 批准生产的重组改构人肿瘤坏死因子药物，也是我国第一个上市的一类基因工程 抗肿瘤药物。

肿瘤坏死因子(TNF-α)作为迄今为止发现的抗肿瘤效果最好的细胞因子， 一直是国内外研究的热点，但是几乎所有的研究都是围绕着人TNF-α，很少涉及 到家畜的肿瘤坏死因子。猪是我国肉类重要来源，是我国畜类养殖业的重要组成 部分，但是近年来，猪的一些常见病(如发热、痢疾甚至猪瘟、蓝耳病、口蹄疫 等)对其养殖的影响日益严重。本课题从国内外研究的现状以及增强猪的免疫力 和抗病毒细菌感染的方面考虑，提出对猪TNF-α基因进行突变体构建、原核重组 表达及功能进行研究，针对免疫力低下和炎症感染疾病的猪，有望开发成相关的 免疫增强剂和疫苗佐剂。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种家猪肿瘤坏死因子突变体基因 (PmTNF-α)构建方法，并提供家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体蛋白的表达 及纯化方法和活性检测。

本发明所述猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体基因序列如SEQ ID NO.2所 示，突变基因翻译蛋白氨基酸序列和野生型相比，N端缺少7个氨基酸，第8位 的Ser、第9位的Asp和第156位的Ile分别突变为Lys、Arg和Phe，其序列如 SEQ ID NO.3所示。

家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体基因构建方法如下：

(1)提取猪脾脏组织总RNA，并逆转录为第一链cDNA；

(2)设计包含突变位点的大片段引物：

F1：5’-AAGCGCAAGCCCGTCGCCCA-3’(SEQ ID NO.4)

R1：5’-TCAGAAGGCAATGATCCCAA-3’(SEQ ID NO.5)

(3)将上述引物的PCR扩增产物，克隆入pMD-19T载体(TaKaRa)，并进行 碱基序列测定，得到了猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体基因序列(PmTNF- α)。

本发明还公开了一种重组表达载体pET28-mTNF-α的构建方法，以猪第一链 cDNA为模版，F2、R2为引物进行PCR，F2、R2的序列如SEQ ID NO.6和SEQ  ID NO.6所示，得到目的基因，即带酶切位点家猪肿瘤坏死因子突变体基因 PmTNF-α，和pET28a载体用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切,T4 DNA Ligas连接酶切 后的载体和目的基因，得到pET28-PmTNF-α重组质粒。

一种家猪肿瘤坏死因子突变体蛋白的表达纯化方法，包括以下步骤：

(1)把含有pET28-PmTNF-α重组质粒的菌种复苏、扩大培养及诱导表达取-80℃ 冻存菌种50μl接种到加有5μlKan的5ml LB培养基中复苏12小时，把复 苏后的菌液加到500ml灭菌LB培养基中，并加500μlKan抗生素，37℃， 200rpm，摇2h；加1M IPTG 100μl，使终浓度达到0.2mM，16℃，150rpm， 诱导20h。收菌，-70℃，冻存过夜。

(2)超声破碎：30ml PBS重悬冻存菌体，超生破碎，4℃，12000rpm，离心 20min，收集上清。

(3)镍柱层析：配制洗脱缓冲液20mM、50mM、100mM、250mM咪唑各200ml， 先用20mM咪唑平衡柱子，上样结束后，开始洗脱。先用20mM咪唑洗 脱，之后分别用50mM、100mM咪唑洗脱，最后250mM，此时洗脱峰为 目的蛋白。

(4)透析并浓缩：将收集到的250mM咪唑洗脱蛋白，放到透析袋中，于4℃， 1L PBS中透析24小时，之后用PEG20000浓缩到合适浓度。

本发明进一步公开了所述家猪肿瘤坏死因子突变体基因PmTNF-α的重组应 用，是通过基因工程方法，生产重组His₆-PmTNF-α蛋白，作为猪免疫增强剂或 相关疾病的免疫佐剂，或者生物药物制剂。

通过现有基因工程方法将该基因的胞外功能区克隆连接到pET28a原核质 粒中并转到大肠杆菌BL21(DE3)中表达，本发明通过多次预表达实验摸索出了合 适的表达条件(调节IPTG的浓度、温度及转速使融合蛋白尽可能多的以可溶形 式表达)，超声破碎后离心收集上清过Ni⁺-NTA柱纯化，梯度洗脱之后我们得到 了家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体蛋白(His₆-PmTNF-α)。并进行Western-blot 鉴定。体外WST-8染料生物活性检测及LDH检测结果显示，该突变型蛋白和野 生型蛋白相比不仅提高了对肿瘤细胞L929的细胞毒活性，而且降低了对正常细 胞(L02)的细胞毒性。

附图说明

图1 重组质粒图(A、野生型TNF-α，B、突变型TNF-α)

图2 镍柱层析洗脱图(A、野生型重组蛋白，B、突变型重组蛋白)

图3 家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)成熟区片段表达及纯化、Western blot鉴定图 (M、蛋白Maker，1、未诱导，2、诱导，3、纯化后蛋白，4、Western blot 结果。A、野生型重组蛋白，B、突变型重组蛋白)

图4 CCK-8法分析不同浓度家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)对L929细胞的细胞 毒活性。(PwTNF-α为野生型重组蛋白，PmTNF-α为突变型重组蛋白)

图5 10×10倍倒置显微镜下拍摄L929细胞

图6 酶标仪法分析猪肿瘤坏死因子(TNF-α)对L02细胞的毒副作用。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员 通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本 发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发 明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方 法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的 内容相同。

实施例1

猪肿瘤坏死因子突变体(PmTNF-α)基因的构建，猪脾脏取自南京栖霞尧 化生猪屠宰场，为长白猪：

(1)提取总RNA：应用RNA抽提试剂盒(TIANGEN)按照其操作手册提取猪 脾脏组织总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度， 紫外分光光度计测定其浓度。SMART^TM RACE试剂盒(TaKaRa)逆转录为 第一链cDNA。

(2)设计包含突变位点的大片段引物，通过PCR方法构建肿瘤坏死因子突变体 基因。引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，利用逆转录所得cDNA模 板进行PCR：

①反应体系为50μl，10μmol/L F1、R1各2μl，2.5mmol/L dNTP 8μl， 2×GC bufferⅡ25μl，cDNA模板3μl，DreamTaq酶0.5μl，ddH₂O 9.5 μl。反应程序为：94℃5min，(94℃30s，56℃30s，72℃1min)， 35个循环，最后72℃延伸7min。

②反应完成后将产物于1％琼脂糖凝胶中电泳检测，用割胶回收试剂盒 回收得到PCR产物，克隆入pMD19-T载体(TaKaRa)，经含Amp抗 生素(50mg/ml)的琼脂糖平板筛选转化子，挑出阳性克隆送往上海 英骏测序公司进行碱基序列测定。多次实验结果测序之后，通过序列 对比确定所构建的猪肿瘤坏死因子突变体基因序列。如构想的一样， 由包含突变位点的引物(序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)引发 了特定突变，突变体基因序列如SEQ ID NO.2。

实施例2：

家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体重组表达载体的构建及其在大肠杆菌 中的诱导表达及纯化鉴定；

根据已经构建TNF-α突变体序列(基因序列如SEQ ID NO.2)，设计引物F2、 R2。其中F2的5’端具有BamHⅠ酶切位点，R2的5’端具有HindⅢ酶切位点，以 猪第一链cDNA为模版，F2、R2为引物(F25’– CGCGGATCCAAGCGCAAGCCCGTCGCCCACGTTGT-3’(SEQ ID NO.6)，R2 5’-CCCAAGCTTTCAGAAGGCAATGATCCCAAAATAGT-3’(SEQ ID NO.7)， PCR扩增该基因(10×pfu Buffer 5μl，dNTP(2.5mM)4μl，F2(10μmol/L)2μl， R2(10μmol/L)2μl，H₂O 33.5μl，cDNA 3μl，pfu Taq 0.5μl)反应条件如下：94 ℃5min，(94℃30s，59℃30s，72℃1min)，35个循环，最后72℃延伸7 min，之后将PCR产物割胶回收，回收产物和pET28a载体(Invitrogen,USA)， 用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切，T4 DNA Ligase(TaKaRa)连接，得到重组质粒(命名 为pET28a-PmTNF-α)(图1B)，连接产物转化E.coli DH5a中，获得含有重组 质粒pET28a-PmTNF-α的菌株。挑选阳性重组菌株测序，测序正确的菌株扩大培 养提取pET28a-PmTNF-α重组质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性菌 株诱导表达。

以同样方法构建家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)野生型蛋白原核表达载体， 命名为pET28a-PwTNF-α(图1A)。根据家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)基因序 列设计引物F3、R3，其中F3的5’端具有BamH Ⅰ酶切位点，R3的5’端具有HindⅢ 酶切位点。以猪第一链cDNA为模版，F3、R3为引物(F35’– CGCGGATCCCTCAGATCATCGTCTCAAACCTCAGATA-3’(SEQ ID NO.8)，R3 5’-CCCAAGCTTTCACAGGGCAATGATCCCAAAATAGA-3’(SEQ ID NO.9)构 建出家猪肿瘤坏死因子(TNF-α)野生型表达基因，序列如SEQ ID NO.1所示，

经过多次预表达实验，当IPTG浓度为0.2mM,诱导温度16℃，转速150rpm 诱导20h，有较多的目的蛋白以可溶形式表达。16℃，6000rpm离心收菌，-70 ℃冻存一夜后，30ml PBS重悬，冰上超声破碎(200W，工作4s，暂停8s，共 150次)表达菌体，4℃，12000rpm，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，上清 过Ni⁺-NTA柱。简要过程是：Binding Buffer(20mmol/L Imidazole，0.5mol/L  NaCl，20mmol/L Tris HCl，pH 8.0)平衡Ni⁺-NTA柱后，将含有可溶性重组蛋 白的上清缓慢上样，上样结束后先用Binding buffer(20mmol/L Imidazole，0.5 mol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)洗去杂蛋白，再用不同浓度的咪唑 Tis-HCl洗脱，目的蛋白主要在洗脱浓度为250mmol/L Imidazole，0.5mol/L NaCl， 20mmol/L Tris HCl，pH 8.0洗脱下来(洗脱曲线如图2所示)。分管收集洗脱 目的蛋白，PBS透析过夜除盐。SDS-PAGE检测各收集管蛋白纯度，紫外分光光 度计测定蛋白浓度。如图3(条带3)所示，表达得到的目的蛋白经Ni⁺-NTA柱 纯化得到纯度达97％的目的蛋白。

Western印记分析：

Western-blot中所用一抗为鼠抗His₆单抗，二抗为辣根过氧化酶(HRP)标记 的羊抗鼠IgG。其简要步骤是：将样品先进行SDS-PAGE，以浸入式法将蛋白电 转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然后依次 经5％脱脂奶粉室温封闭1h，与一抗孵育1h，与HRP标记的二抗IgG孵育1h， 每步完成后均严格洗膜，最后加TMB避光显色。结果如图3(条带4)所示在 目的蛋白位置出现了特异性条带。将获得的目的蛋白抽滤分装后保存于-70℃。

实施例3

CCK-8法分析His₆-PmTNF-α对L929细胞的细胞毒活性；

7ml 1640(10％FBS)培养基培养L929细胞，24小时。除去培养基后，1ml 胰酶消化30s，加1ml培养基终止消化，重悬细胞，吸取到15ml离心管中，1000 g，20℃，3min。出去上清之后再加2ml培养基(1640,10％FBS)，重悬细胞， 吸取1ml到50ml离心管中，加10％FBS 1640培养基稀释，计数板计数，使胞 数目为3×10⁵个/ml。吸取上述稀释的细胞悬液种入96孔板中，每孔100μl，37 ℃，5％CO₂，培养24h。除去培养液。用10％FBS 1640培养基配置不同浓度 TNF-α稀释液(分野生型和突变型两组)，之后每孔加100μl，使TNF-α终浓度 达到10⁵、10⁴、10³、10²、10、10⁰、10^-1、10^-2、10^-4ng/ml，每孔加Act.D(放线 菌素D)使终浓度达到0.4μl/ml，设置空白、PBS、Act.D对照组。37℃，5％CO₂， 培养24小时，于倒置显微镜下，通过微拍，直接对每孔细胞生长状况进行拍摄， 结果如图5所示，之后加CCK-8(10％比例)，培养箱里放置1h之后，于酶标仪 上测450nm吸光度值。进行细胞毒活性计算之后，结果如图4所示。

实施例4

酶标法分析His₆-PmTNF-α对L02细胞的毒副作用

7ml 1640(10％FBS)培养基培养L02细胞，24h。除去培养基后，1ml胰酶 消化30s，加1ml培养基终止消化，重悬细胞，吸取到15ml离心管中，1000g， 20℃，3min。出去上清之后再加2ml培养基(1640,10％FBS)，重悬细胞，吸取 1ml到50ml离心管中，加10％FBS 1640培养基稀释，计数板计数，使胞数目 为3×10⁵个/ml。吸取上述稀释的细胞悬液种入24孔板中，每孔500μl，37℃， 5％CO₂，培养24h。除去培养液，用10％FBS 1640培养基配置不同浓度TNF- α稀释液(分野生型和突变型两组)，之后每孔加500μl，使TNF-α终浓度达到 10⁵、10⁴、10³、10²、10、10⁰、10^-1、10^-2、10^-4ng/ml，设置空白、PBS对照组。 37℃，5％CO₂，培养24小时，之后按照南京建成生物工程研究所乳酸脱氢酶 (LDH)检测试剂盒步骤检测TNF-α对L02细胞的细胞毒副，作用结果如图6 所示。