西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-1的连锁分子标记及其应用

摘要

本发明涉及西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-1的连锁分子标记及其应用，分子标记ZY-138和ZY-157与抗病基因的遗传距离分别为0.4cM和2.6cM；利用引物对分子标记ZY-138和ZY-157进行PCR扩增，通过扩增产物可快速准确地检测抗性性状转育后代植株是否具有ZYMV-1抗病基因。本发明的有益效果为：可以显著提高抗病育种效率，缩短育种周期，为ZYMV抗病品种的选育提供了保障；本发明获得的分子标记ZY-138和ZY-157具有可靠稳定、操作简单、重复性好等优点，在鉴别抗、感品种和抗性单株时具有非常高的利用价值。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-1的连锁分子标记及其应用。

背景技术

西葫芦是全球范围内普遍栽植的重要蔬菜之一，在我国的栽培面积逐年增加，特别是近年来保护地设施栽培发展迅速，已成为保护地中继黄瓜之后的第二大栽培作物。对农民增收、农业结构调整以及丰富人民的菜篮子有着重要意义。

小西葫芦黄化花叶病毒病(zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)是目前危害西葫芦等葫芦科作物生产的主要病害之一。ZYMV在世界范围内传播蔓延迅速，近年来在我国西葫芦生产中的危害日趋严重和广泛(刘卫荣等，2008)。植株感染ZYMV后会产生花叶、植株矮化畸形，果实表面瘤状凸凹不平、果肉僵硬且味苦涩等症状，使果实失去商品价值，导致产量损失达60％以上，严重者甚至绝产(Zechmann et a1.，2003；刘卫荣等，2008)。

目前还没有防治该病毒病的有效试剂，培育和推广抗病品种是防治ZYMV最经济、安全、有效的措施。但目前，抗病基因主要来源于野生南瓜材料，存在抗性性状转育困难，不利性状连锁累赘，传统抗病接种鉴定方法受环境和人为操作因素影响大，鉴定结果准确性和稳定性不高，导致抗病育种效率低、周期长、抗病品种少，远远不能满足生产需要。紧密连锁的分子标记可以加速抗病育种进程及提高选择的准确性，是分子标记辅助选择育种的必要条件。但目前还没有与西葫芦ZYMV抗病基因紧密连锁分子标记的研究报道。因此，开发与西葫芦ZYMV抗病基因紧密连锁的分子标记，对于提高西葫芦抗病育种效率，拓展抗病基因应用范围，保障西葫芦的健康生产具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-1的连锁分子标记及其应用，可快速准确地检测抗性性状转育后代植株是否具有ZYMV-1抗病基因，为ZYMV抗病品种的选育提供了保障，弥补了现有技术中的不足之处。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-1的连锁分子标记，所述分子标记为ZY-138和ZY-157；

所述的分子标记ZY-138：

左端引物序列为SEQ ID NO.1，

右端引物序列为SEQ ID NO.2，

扩增产物为150bp，此分子标记来自西葫芦自交系BS12染色体，为共显性分子标记，利用Mapmaker/EXP3.0测得与抗病基因ZYMV-1的遗传距离为0.4cM；

所述的分子标记ZY-157：

左端引物序列为SEQ ID NO.3，

右端引物序列为SEQ ID NO.4，

扩增产物为97bp，此分子标记来自西葫芦自交系BS12染色体，为共显性分子标记，利用Mapmaker/EXP3.0测得与抗病基因ZYMV-1的遗传距离为2.6cM。

获得西葫芦抗ZYMV病毒病基因ZYMV-1的分子标记的方法，包括：以西葫芦自交系BS3和BS12分别作为感病和抗病亲本配制F2代分离群体，用584对SSR引物筛选与西葫芦ZYMV显性抗病基因ZYMV-1连锁的分子标记，得到2个分布在抗病基因两侧的共显性分子标记ZY-138和ZY-157。

西葫芦ZYMV抗病基因ZYMV-1的分子标记方法，用以下的任意一对分子标记引物PCR扩增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产物：

1)权利要求1所述的分子标记ZY-138：

左端引物序列为SEQ ID NO.1，

右端引物序列为SEQ ID NO.2，

2)权利要求1所述的分子标记ZY-157：

左端引物序列为SEQ ID NO.3，

右端引物序列为SEQ ID NO.4，

如果用引物SEQ ID NO1和SEQ ID NO.2，ZY-138能够扩增出150bp的扩增片段，或者用引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，ZY-157能够扩增出97bp的扩增片段，则标志着待检西葫芦存在抗ZYMV的基因ZYMV-1。

所述的分子标记可以应用在西葫芦种质资源中ZYMV抗病基因的鉴定和转育中。

本发明的有益效果为：

1、在西葫芦自交系BS12中鉴定了一个ZYMV抗病基因ZYMV-1。

2、获得与西葫芦ZYMV抗病基因ZYMV-1紧密连锁的共显性分子标记ZY-138和ZY-157，分布在抗病基因两侧，与抗病基因的遗传距离分别为0.4cM和2.6cM。利用获得的分子标记能够通过辅助选择鉴定将抗病基因成功导入其它西葫芦感病优良自交系，使之获得抗病性状。

3、鉴定方便，分子标记具有扩增稳定、检测方便、快速准确等优点，用标记ZY-138和ZY-157检测西葫芦抗病基因ZYMV-1，可以确定抗病基因是否存在以及存在状态，并预测植株对ZYMV病毒病的抗性，加快该抗病基因的利用。

4、本发明提出了利用西葫芦ZYMV病毒病抗病种质资源BS12中抗病基因的方法：利用分子标记筛选，通过杂交与回交转育将抗病基因导入西葫芦优良感病自交系中，利用该方法成功将抗病基因ZYMV-1导入西葫芦优良自交系BS3，使其获得了ZYMV抗病性。

附图说明

图1为分子标记ZY-138和ZY-157与西葫芦抗病基因ZYMV-1的遗传连锁图，左边为标记间的图距。

图2为分子标记ZY-138的扩增带型，其中P1为感病亲本BS3，P2为抗病亲本BS12，F1为杂交一代；1-19为以BS3为轮回亲本的回交单株；M：Trans DNAmarkerlI，箭头所指为150bp特异扩增条带；

图3为分子标记ZY-157的扩增带型，其中P1为感病亲本BS3，P2为抗病亲本BS12，F1为杂交一代；1-18为以BS3为轮回亲本的回交单株；M：Trans DNAmarkerlI，箭头所指为97bp特异扩增条带。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

(一)西葫芦自交系BS3与BS12F2代的创建与表型鉴定：

(1)西葫芦自交系BS3(母本)与BS12(父本)进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2代群体；

(2)F2代群体单株种植于温室营养钵内，外罩防虫网，子叶完全展开后接种病毒病，接种15天后进行抗病性状调查，鉴定结果见表1，

表1接种ZYMV病毒病后BS3×BS12F2代群体遗传分析

R、S分别代表抗病单株、感病单株。x20.05，1=3.84；

(3)F2代单株进行性状调查后将感病植株移栽于温室种植，自交所得种子为F3家系，每个F3家系中选择10粒种子种植，进行子代抗病性测验，验证F2代感病单株是否携带纯合感病基因；

(4)通过对F2代单株进行遗传分析，发现西葫芦自交系BS12携带有一个显性抗病基因。

(二)多态性分子标记筛选

(1)将10株抗病F2单株的叶片等量混成抗池，10株感病F2单株的叶片等量混成感池。用CTAB法(Sue Porebski L.，1997)提取抗病亲本BS12、感病亲本BS3、抗池和感池的DNA，应用简单重复序列标记SSR与BSA(Bulk segregantanalysis)结合的方法进行多态性分子标记的筛选；

(2)首先利用584对SSR引物(Amine Zraidi，Gertraud Stiff，Martin Pachner,Abdolali Shoj aeiyan，Li Gong，Tamas Lelley(2007)A consensus map for Cucurbitapepo.Mol.Breeding20(4)：375-388；Gong L，Stiff G， Kofler R，Pachner M，Lelley T(2008)Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map0f Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L.Theor ApplGenet117：37-48；Blanca J，J，Roig C，Ziarsolo P，Nuez F，Picó B.(2011)Transcriptome characterization and high throughput S SRs and SNPs discovery inCucurbita pepo(Cucurbitaceae).BMC Genomics12：104)对BS12、BS3、抗池和感池进行多态性标记筛选。

PCR反应体积为15微升，其中10×buffer1.5微升，2.5mM dNTPs0.3微升，Tag酶(5单位/微升)0.2微升，10μM引物(F/R)各0.3微升，模版DNA30ng，加ddH2O至15微升；

SSR反应体系为DNA95℃预变性3min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min；

其中9个SSR标记在抗、感亲本与抗、感池之间检测到了一致的多态。

(三)紧密连锁分子标记的获得

根据连锁交换规律，利用9对候选分子标记在纯合感病家系各单株间的基因型资料与单株的抗性资料，构建分子标记与ZYMV-1基因的连锁图谱，所用软件为Mapmaker/EXP3.0，获得了与抗病基因ZYMV-1紧密连锁的分子标记ZY-138和ZY-157，两个标记分布在抗病基因两侧，遗传连锁距离分别为0.4cM和2.6cM(图1)；

(四)抗病基因ZYMV-1向感病西葫芦自交系的转移

利用获得的与抗病基因ZYMV-1紧密连锁的分子标记ZY-138或ZY-157，通过杂交与回交转育将抗病基因导入西葫芦优良感病自交系中(图2和图3)。利用上述策略，成功获得了改良西葫芦优良自交系BS3，使其携带ZYMV-1抗病基因具备了ZYMV抗病性。

西葫芦种质资源中蕴含丰富的基因资源，高效充分的利用这些基因资源对于西葫芦育种具有重要作用。本发明通过将抗病种质BS12与感病自交系BS3杂交，经遗传分析确定抗病材料中携带有一个显性的抗病基因，通过构建抗病性状分离群体，经多态性分子标记筛选，构建了抗病基因ZYMV-1与分子标记ZY-138和ZY-157的遗传连锁图谱。利用分子标记辅助选择，经杂交及回交转育，成功将抗病基因ZYMV-1转育到西葫芦优良感病自交系BS3中，使其获得了ZYMV抗病性状。在传统育种方法中，由于缺乏与抗病基因连锁的分子标记，每代的抗病基因转移均需要抗性鉴定，费时费力。因此，分子标记ZY-138和ZY-157的开发可以简便准确的筛选含有抗病基因ZYMV-1的单株，大大节省抗病材料的筛选时间和育种劳动量，提高选择的准确性。