杀鲑气单胞菌活疫苗制剂和冻干疫苗制品的制备方法及应用

摘要

杀鲑气单胞菌活疫苗制剂和冻干疫苗制品的制备方法及应用，属于渔用细菌性基因缺失减毒活疫苗技术领域。其包括一株杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变菌株HTAsf-5307，以及通过该菌株制备的杀鲑气单胞菌活疫苗、制备方法和应用。本发明提供的杀鲑气单胞菌减毒活疫苗株因缺失了杀鲑气单胞菌毒株的芳香族氨基酸合成相关基因的部分片段，和部分三型分泌相关编码基因的部分片段，相对于其野生毒株具有明显的低毒性和产品安全性，同时，可有效地保护免疫鱼免受杀鲑气单胞菌致病毒株的侵害。该活疫苗免疫效果显著，在实际应用中能很好地防治杀鲑气单胞菌引发的病害。

说明书

技术领域

本发明涉及一种杀鲑气单胞菌活疫苗制剂和冻干疫苗制品的制备方法及应用，具体涉及基于一种杀鲑气单胞菌无标记基因缺失减毒突变株的制剂及应用，该疫苗株主要用于由杀鲑气单胞菌引发的鱼类疥疮病的免疫防治，属于水产养殖动物病害免疫防控领域，具体属于渔用细菌性基因缺失减毒活疫苗技术领域。

背景技术

杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）属于气单胞菌科（Aeromonadaceae）气单胞菌属（Aeromonas），是一种革兰氏阴性短杆菌，最适生长温度为18~22℃。由杀鲑气单胞菌引起的疖疮病（Furuneulosis）是鲑科鱼类养殖业的重大病害（Janda J.M. et al., 2010, Clin Microbiol Rev, 23:35-73.），严重影响了世界范围内以大西洋鲑（Salmo salar）为代表的鲑鱼类养殖业的健康发展，是海水鱼类养殖业中最为重大的风险之一，世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health，OIE）将其列为重点疫病目录。除此该菌还能感染绝大部分其他鲑鳟鱼类，如，太平洋鲑（Pacific salmon）、枫叶鲑、虹鳟（Rainbow trout）、银鲑（Coho salmon）等，和非鲑鳟鱼类，如金鱼（Goldfish）、鲤（Common carp）、鲶（Catfish）和大菱鲆（Turbot）等，给水产养殖业造成了严重的经济损失（Bergh ?., 2008, Fish Diseases. Science Publishers, pp.239-277.）。

鉴于杀鲑气单胞菌对水产养殖业造成的重大危害，人们在过去近40年的以鲑鱼养殖业为代表的水产养殖业可持续发展中，不断探索针对杀鲑气单胞菌病害的高效防治策略。以抗生素为核心的化学疗法曾伴随着世界范围内以海水鱼类养殖为代表的水产养殖业发展历程，为病害防治和减少病害损失发挥过积极贡献。但这种病害防控策略所导致抗药病原快速蔓延，水产品安全问题（药物残留）和环境污染的负面影响日趋严重。抗生素的大量使用和滥用所带来的负面影响已经给世界范围水产养殖业的健康和可持续发展产生了严重制约。

而基于鱼类免疫系统的预防性疫病防控措施则是一种非常有效的符合环境友好的病害防控策略。疫苗作为一种预防性手段，因其可以使宿主长久地抵抗病原体的感染而被引入水产养殖业。从鱼疫苗的研发历程和当前发展趋势看，鱼类疫苗大致可以分为四种类型：1）以病原体全细胞为基础的灭活疫苗；2）以全细胞为基础的减毒活疫苗；3）以具有抗原活性的亚细胞成分为基础的亚单位疫苗；4）以抗原活性成分的编码基因为基础的DNA疫苗。目前，国际上已商品化的鱼类细菌疫苗基本为灭活疫苗（Bj?rn E. B., et al., 2013, Fish Shellfish Immunol, 35:1759-1768）。

与灭活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗相比，由于病原体减毒活菌具有完整的免疫原组分，较灭活病原菌具有更强的细胞免疫潜能，可诱导产生更有效的免疫应答反应；同时，其仍然保持的侵染性可使减毒活菌可通过口服和浸泡途径免疫，以此开发的减毒活疫苗在经济上更具竞争性。由于减毒活疫苗兼具高效、给药方便、经济低廉等综合优势，这对于需要免疫成千上万数量的水产养殖业来说具有现实的商业应用潜力。

根据减毒原理的不同，减毒活疫苗可以分为多种不同类型。其中利用同属不同种的微生物作为减毒株、传代减毒株、病原自然弱毒株、改变体外培养传代的环境减毒株或是转座子等基因重组技术开发的减毒株，大都具有两个先天致命的缺陷：1）携带抗性标记和外源基因片段对环境有潜在危害；2）易回复突变，恢复毒力。毒力易回复和不可控的环境传播风险是这些疫苗应用所必须重视和解决的。鉴于此，该类减毒疫苗被包括中国在内的各国生物制品安全检查管理机构审批法规认定为具有较高环境安全风险的生物制品，因而难以进入商业化开发进程。

为了消除基因重组疫苗产品的环境安全潜在危害，无标记基因缺失突变技术发展为近年来国际上构建基因缺失减毒活疫苗的先进开发技术(GolovliovI.,et al., 2003, FEMS MicrobiolLett, 222:273-280)。该技术构建的减毒活疫苗与以往传统技术路线构建的减毒活疫苗相比具有如下优点：1）开发出的减毒活疫苗不携带抗性标记和外源基因片断；2）采用基因定向框内大片断缺失，突变和毒力不可回复；3）突变构建的遗传背景清楚，减毒机理明确。这些都为无标记减毒活疫苗的环境安全控制提供了更加有力的保障。由于具有公认的产品和环境安全性，基因无标记缺失减毒疫苗已成为目前国际上流行的活疫苗构建技术，是疫苗开发的国际前沿领域与主要发展方向之一。

基因缺失减毒活疫苗构建开发策略中的基因缺失是其技术关键所在，目前主要采用两种途径选择缺失靶基因：1）选择缺失病原菌已知的毒力因子相关编码基因；2）选择涉及病原菌在宿主体内定值和存活相关的已知代谢途径关键功能基因。

营养缺陷型（Auxotrophy）细菌是一种需要补充一种或几种生长因子才能存活和增殖的营养突变体，而某些营养因子在脊椎动物组织中是有限可用的。同时，现代分子生物学技术的发展和对鱼类病原致病机制的不断深入了解使人们认识到许多在宿主内存活和增殖所必需的功能基因。这些都为减毒疫苗的构建提供了潜在的目的缺失靶基因。以芳香代谢产物生物合成缺陷为靶点（如aroA，aroC和aroD 突变株）的减毒突变株构建成为鱼类开发中的可行技术路线（Wanget al., 2013; Lienet al., 2014）。Aro类基因突变技术路线的一个基本假设就是基于两种芳香化合物对氨基苯甲酸和2,3-二羟基苯甲酸在宿主体内是有限可用的，这种营养缺陷型已被用于人类和陆地动物减毒疫苗的开发中，如霍乱、破伤风、利什曼病和伤寒（Stocker B.A., 1988,Vaccine,6:141-145; Ward S.J., et al.,1999, InfectImmun, 67:2145-152, Malcova M.,et al., 2009, FEMS Microbiol Lett, 291(1):44-49）。国外有报道通过转座子插入失活技术或无标记基因缺失技术缺失杀鲑气单胞菌aroA基因，成功构建杀鲑气单胞菌（杀鲑亚种））减毒活疫苗（Vanghun et al., 1993; Marsden et al., 1996）。尚未有缺失杀鲑气单胞菌aroC(编码分枝酸合成酶)的报道。

分支酸合成酶（Chorismate synthase）是细菌中莽草酸合成代谢途径（Shikimate pathway）的合成酶，催化5-烯醇式莽草酸-3-磷酸合成分支酸，主要涉及芳香氨基酸的生物合成（Pitchandi P., et al., 2013, BMC Pharmacol Toxicol，14:29），其功能编码基因aroC的功能失调将导致生物体表现为对芳香氨基酸Phenylalanine、Tyrosine和Tryptophan的营养缺陷型。aroC基因及营养缺陷型已在大肠杆菌（Escherichia coli）、分枝杆菌（Mycobacteria）、水稻白枯叶病菌（Xanthomonas oryzae）、沙门氏菌（Salmonella）以及高等植物中进行了深入研究（Betancor L.,et al., 2005, Vet Microbiol, 107(1-2):81-9; Song H., et al., 2009, Methods Mol Biol, 465:279-95; Song E.S., et al., 2012, Microbiol Res, 167(6):326-31; Maeda H., et al., 2012, Annu Rev Plant Biol, 63:73-105）。

有研究表明，病原菌染色体上aroC基因的缺失突变将导致受体菌株表现为芳香氨基酸营养缺陷表型，不能有效合成DNA及蛋白合成所需的叶酸及重要毒力因子铁载体的前体物质2,3-二羟基苯甲酸等，从而丧失毒力并极大削弱其在环境中的生存竞争力，无法在宿主体内增殖存活（Chen Q., et al., 1994,JBacteriol,176:4226-4234）。

III型分泌系统为革兰氏阴性病原菌中一类重要的毒力因子（Corneliset al., 1998; Galan& Collmer, 1999; Nhieu& Sansonetti,1999）。Burr等人鉴定出杀鲑气单胞菌的III型分泌系统（Burr et al., 2002, 2003）。在杀鲑气单胞菌中，III型分泌系统的编码基因主要以毒力岛的形式存在于内源性质粒（pAsa5）中。pAsa5丢失或III型分泌系统内膜结构蛋白编码基因ascV的缺失均导致杀鲑气单胞菌毒力的降低（Burr et al., 2002;Stuber et al., 2003）。AopN为杀鲑气单胞菌III型分泌系统的调控蛋白，与分子伴侣Acr1（TyeA）、SycN及YscB形成多蛋白复合体，对该分泌过程进行负调控（Schubot et al., 2004）。AscN作为ATPase，为III型分泌系统提供能量(Blaylock et al., 2004)。aopN、acr1及ascN的缺失将导致III型分泌系统紊乱。但以此些Ⅲ型分泌系统编码基因作为缺失靶基因构建杀鲑气单胞菌减毒活疫苗未见任何文献报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒活疫苗株及其制剂及应用，该减毒疫苗株消除了传统活疫苗普遍存在的潜在产品和环境安全风险，是针对杀鲑气单胞菌引起的养殖鱼类疾病的一种安全、有效、经济的新型疫苗。

按照本发明提供的技术方案，一株杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变菌株HTAsf-5307，分类命名为Aeromonas salmonicida，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年10月29日，保藏编号为：CCTCC M 2014527。其特点是，缺失了所述杀鲑气单胞菌毒株的芳香族氨基酸合成相关基因aroC片段，该菌株表现出芳香族氨基酸营养缺陷特征。

所述杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变菌株，其缺失了杀鲑气单胞菌野生毒株的芳香族氨基酸合成基因aroC的部分片段，如SEQ ID NO.1所示；和Ⅲ型分泌系统编码基因aopN、acr1及ascN的部分片段，如SEQ ID NO.2所示。

所述菌株制备的杀鲑气单胞菌活疫苗，包括疫苗发酵培养液，和疫苗发酵培养液经冻干后得到的冻干疫苗。所述冻干疫苗冻干前，即疫苗发酵培养液中的活菌含量不低于45-80亿/毫升，还含有NaCl 9g/L，其pH为6.5-8.0。

将所述冻干疫苗和在药理上可接受的配体复配后得到杀鲑气单胞菌活疫苗制剂，其菌体细胞浓度为10⁴~10⁸CFU/mL。所述药理上可接受的配体为无菌生理盐水；无菌生理盐水配方为：NaCl 9g/L，pH为6.5-8.0。

所述杀鲑气单胞菌活疫苗的制备方法，其特征是步骤为：

疫苗发酵培养液的制备：用接种环挑取保存于TSA培养基上减毒突变株，接种于装有液体LB或TSB种子培养基的摇瓶中振荡培养；所述LB或TSB培养基中加入生长因子，所述生长因子为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，添加量均为5-40mg/L；然后再取生长旺盛的菌液接种于新鲜发酵培养基中继续培养；用无菌磷酸盐缓冲液洗涤，离心，最后用无菌磷酸盐缓冲液重悬，即得到疫苗发酵培养液；发酵培养培养温度均为20~22?C；

冻干疫苗的制备：取疫苗发酵培养液所得制剂在冻干机内进行冻干；在冻干制备过程中，添加有生长因子；所述生长因子包括海藻糖、脱脂奶粉和甜菜碱；它们的添加量是每100mL活疫苗中添加1-5g的海藻糖、1-10g的脱脂奶粉和0.1-2mM甜菜碱，充分混匀后，放入已灭菌处理的冻干机内进行冻干，水分降至4%以下即得冻干疫苗。

所述杀鲑气单胞菌活疫苗的应用，将其应用于预防鱼类所患由杀鲑气单胞菌导致的大西洋鲑疖疮病；其中冻干疫苗与配体复配后得到杀鲑气单胞菌活疫苗制剂；杀鲑气单胞菌活疫苗制剂或疫苗发酵培养液通过腹腔注射和浸泡方式给药；

注射方式给药：菌体浓度为1*10⁶~1*10⁸CFU/mL，注射剂量0.1mL/尾，腹腔注射；浸泡方式给药：菌体细胞浓度为1*10⁴~1*10⁷CFU/mL，浸泡时间为15~30min，浸泡温度15~18?C。

所述鱼类包括大西洋鲑、太平洋鲑、虹鳟等鲑鳟鱼类和非鲑鳟鱼类：斑马鱼、大菱鲆等。

本发明的有益效果：

（1）本发明提供的杀鲑气单胞菌减毒活疫苗株因缺失了杀鲑气单胞菌毒株的芳香族氨基酸合成相关基因的部分片段，和部分三型分泌相关编码基因的部分片段，相对于其野生毒株具有明显的低毒性和产品安全性，同时，可有效地保护免疫鱼免受杀鲑气单胞菌致病毒株的侵害。后文实验表明，该活疫苗免疫效果显著，在实际应用中能很好地防治杀鲑气单胞菌引发的病害。

（2）本发明提供的杀鲑气单胞菌活疫苗所使用的无标记基因缺失减毒突变株不携带任何抗生素标记和其他外源标记和基因片段，因此不存在传播抗生素抗性的潜在危险；采用基因缺失突变（特别是多基因缺失）手段，毒力相关基因大片段缺失，在理论上认为不可回复，极大地消除了向环境传播大量毒性病原体的可能性，具有技术上的安全性和产品上的安全性。

（3）本发明提供的杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒疫苗株的遗传背景清楚，减毒机理明确，易于区分疫苗株与野生株，便于对环境进行监控，提高疫苗的环境安全性和可控性。

（4）本发明的杀鲑气单胞菌活疫苗可制备成冻干疫苗制品，有实际的商业开发应用价值。

生物材料样品保藏：一株杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变菌株HTAsf-5307，分类命名为Aeromonas salmonicida，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2014年10月29日，保藏编号为：CCTCC M 2014527。

附图说明

图1 为杀鲑气单胞菌野生毒株与减毒突变株芳香族氨基酸缺失部分的PCR检测结果。

图2 为杀鲑气单胞菌野生毒株与减毒突变株三型分泌系统相关编码基因片段缺失部分的PCR检测结果。

图3 为注射免疫斑马鱼后的免疫保护效果曲线图。

图4为注射免疫大西洋鲑后的免疫保护效果曲线图。

图5 为浸泡免疫斑马鱼后的免疫保护效果曲线图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

实验例1：疫苗株的验证与制备

本发明选择杀鲑气单胞菌野生强毒株（我国山东烟台地区罹患疥疮病的养殖大西洋鲑病灶处分离到的一株强致病性毒株Aeromonas salmonicida SDy0701为疫苗构建出发株，以其管家基因aroC基因和T3SS分泌系统中的编码基因acr1、aopN、ascN为缺失靶基因，其中aroC基因的缺失阻断芳香族氨基酸及其叶酸合成，acr1、aopN为分泌系统的调控元件，ascN为ATP磷酸酶参与Ⅲ型分泌系统的组装，它们的缺失将导致T3SS分泌系统功能及效应物的破坏。涉及杀鲑气单胞菌定植能力和重要毒力因子的关键编码基因的大片段双缺失，大大降低了应用时由于毒力回复突变带来的环境传播危险，具有可靠和稳定的安全性。同时，缺失减毒疫苗株不带任何外源的抗生素筛选标记和外源基因片段，易于区分疫苗株和野生型菌株，便于对疫苗株进行监控，提高疫苗的安全性和可控性。目前，除本发明外，国内外未见利用无标记基因突变技术缺失基因aroC和三型分泌系统相关基因制备杀鲑气单胞菌减毒疫苗的文献和专利报道。

（一）疫苗株的验证

通过基因工程手段，在杀鲑气单胞菌野生株Aeromonas salmonicida SDy0701的基础上获得杀鲑气单胞菌减毒突变株，命名为Aeromonas salmonicida HTAsf-5307，其缺失了杀鲑气单胞野生株的芳香族氨基酸合成相关基因的部分片段，和部分三型分泌系统相关编码基因的部分片段，通过PCR验证可以将疫苗株与野生株区分开。

以杀鲑气单胞菌SDy0701和HTAsf-5307的基因组为模版，利用以下用引物做PCR：

P1（5’ ACTCGAGATAAGCGAAGCG3’），

P2（5’ GGTGATCATCTCTATGGCTTC3’），

P3（5’CCAACCATAGGGTCAGTTG3’），

P4（5’ GCCCCGTTCACCGATCAGC 3’），

其中P1/P2验证芳香族氨基酸合成相关基因片段，P3/P4验证三型分泌系统相关编码基因片段。PCR反应体系中含10mmol/L Tris-HCl（pH 8.3），50mmol/L MgCl₂，上下游引物各100pmol，200μmol/L dNTPs，50ng模板DNA，2.5U DNA聚合酶。PCR反应程序为：94℃变性5min；95℃ 30s，55℃ 15s，72℃3min，30个循环；72℃延伸5min。PCR结果如电泳图所示，具体如下。

图1中：M泳道为DL2000 DNA Marker；A泳道为杀鲑气单胞菌野生株芳香族氨基酸合成基因片段，大小为876bp；B泳道为减毒突变株芳香族氨基酸合成基因片段，大小为507bp。

图2中：M泳道为λ /HindIII DNA Marker；A泳道为杀鲑气单胞菌野生株三型分泌系统相关编码基因片段，大小为2080bp；B泳道为减毒突变株三型分泌系统相关编码基因片段，大小为509bp。

（二）减毒活疫苗制备

培养基与生理盐水组成：

（1）TSA培养基：胰蛋白胨17g/L，大豆胨3g/L，葡萄糖2.5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，琼脂15g/L，pH 7.1～7.5；

（2）LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.1～7.5；

（3）种子培养基：胰蛋白胨17g/L，大豆胨3g/L，葡萄糖2.5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸均为5mg/L-40mg/L，pH 7.1～7.5；

（4）发酵培养基：胰蛋白胨17g/L，大豆胨3g/L，葡萄糖2.5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨本均为5mg/L-40mg/L，pH 7.1～7.5；

（5）磷酸盐缓冲液：氯化钠8g/L，氯化钾0.2g/L，磷酸二氢钠1.44g/L，磷酸二氢钾0.24g/L，pH7.1～7.5；

（6）生理盐水：氯化钠9g/L，pH 6.5-8.0，121℃灭菌20分钟。

a、疫苗制备：用接种环挑取保存于TSA培养基上减毒突变株，接种于装有100mL液体LB或TSB种子培养基的500mL摇瓶中，在22℃下振荡培养（转速200转/分钟），24小时后，取3mL生长旺盛的菌液接种（OD=4.0左右）接种于100mL新鲜发酵培养基，22℃恒温振荡培养24小时，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次，离心收获菌体(2000×g，15分钟，15℃)，用无菌磷酸盐缓冲液重悬到一定浓度。

b、疫苗冻干制备：冻干疫苗制剂制备前活菌含量不低于50亿/毫升，按照每100毫升活菌疫苗无菌生理盐水重悬液中添加1-5g的海藻糖、1-10g的脱脂奶粉和额0.1-2mM甜菜碱的比例向活菌疫苗中添加海藻糖、脱脂奶粉和甜菜碱作为冻干保护剂（灭菌），充分混匀后，放入已灭菌处理的冻干机内，按照如下冻干参数进行冻干制备：预冷至4℃，维持0.5h，降温至-45℃后冻结3h，然后升温至-15℃，抽真空并维持8~9h后继续升温至28℃，维持6~8h（剩余水分降至4%以下，可判结为冻干终点）。真空压盖铝封后于-15℃保存备用。

冻干疫苗制品在给药时是按如下的方法进行的：首先将冻干疫苗制品取出后置于室温下（15℃~20℃），用无菌生理盐水按照冻干粉原液体积进行复水，再用无菌生理盐水稀释成所需菌密度（此时即可采用注射或浸泡方式给药）。

实验例2：以斑马鱼为实验用鱼的半致死量(LD₅₀)的测定。

实验用鱼的饲养：从上海嘉定购置的试验用鱼(斑马鱼)，试验用鱼先置于SPF（Special Pathogen Free）实验室适应养殖1周，以挑除不正常个体。在感染试验前，再将SPF试验用鱼放养于感染实验室中10L感染实验水槽，继续喂养1周，每槽放养10尾（平均体长2-3cm）。试验水槽每天使用无菌水替换2/3体积养殖水，水温28.5℃，上下波动2℃。

毒力的评价：将试验用鱼随机分组，每组3个水槽平行试验。

在感染试验中，每组试验用鱼用一定梯度剂量的毒株：杀鲑气单胞菌野生毒株Aeromonas salmonicida SDy0701（5×10²~5×10⁵CFU/尾），测试条件和结果如表1所示。减毒株：杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变菌株HTAsf-5307（5×10⁵~5×10⁸CFU/尾）通过腹腔注射进行人工感染，测试条件和结果如表2所示。

表1 杀鲑气单胞菌毒株对斑马鱼半数致死量的测定结果

分组剂量(CFU/尾)实验数（尾）死亡数2周后存活数死亡率（%）15×10⁵30300100%25×10⁴30191163.3%35×10³30151550%45×10²3082226.7%对照生理盐水300300%

表2杀鲑气单胞菌减毒突变株对斑马鱼半数致死量的测定结果

分组剂量(CFU/尾)实验数（尾）死亡数2周后存活数死亡率（%）15×10⁸3072323.3%25×10⁷3032710%35×10⁶300300%45×10⁵300300%对照生理盐水300300%

记录2周内，每组每个感染剂量下每天的死亡尾数，并计算累计死亡率，测定LD₅₀值（具体结果如表3所示）。

表3  杀鲑气单胞菌毒株和减毒株HTAsf-5307对斑马鱼的LD₅₀。

感染菌株LD₅₀备注SDy07016.29×10³>14天内达到半数致死HTAsf-5307>5×10⁸>--

上述结果表明，在斑马鱼模型上，杀鲑气单胞菌减毒株相对于野生毒株具有明显的减毒效应。

实验例3：以斑马鱼为试验动物的注射给药免疫保护试验。

免疫效力的评价：试验斑马鱼随机分组，每组3个平行水槽，10尾/槽。将制备的减毒活疫苗采用腹腔注射方式免疫。免疫组注射剂量为2×10⁵ CFU/尾。对照组注射相同体积的无菌生理盐水。免疫4周后将各组免疫斑马鱼用杀鲑气单胞菌野生毒株活菌（腹腔注射1×10⁴ CFU/尾）进行人工感染攻毒。在15天内观察统计对照组和免疫组死亡数，统计结果如图3所示。

利用以下公式计算相对免疫保护率：

相对免疫保护率(RPS)%＝(对照组死亡率-试验组死亡率)/对照组死亡率×100%。

经计算，所制备的杀鲑气单胞菌减毒活疫苗对斑马鱼的免疫保护率达到92%，由此可见，在斑马鱼模型上，该疫苗对杀鲑气单胞菌有很好的防治效果，能有效地保护斑马鱼抵御杀鲑气单胞菌的侵染。

实验例4：以大西洋鲑为试验动物的注射攻毒半致死量(LD₅₀)测定。

实验用鱼的饲养：从山东购置的实验用鱼(大西洋鲑)，暂养于200L水族箱，配以流动循环水处理和净化系统，养殖水温维持16±2℃，暂养1周后，剔除不健康个体。选择体长为12-15cm(体重50g左右)的健康大西洋鲑随机分组至20L试验水槽，每个水槽10尾。

毒力的评价：将试验用鱼随机分组，每组3个水槽平行试验。

在感染试验中，每组试验用鱼用一定梯度剂量（10⁴~10⁸CFU/mL）的杀鲑气单胞菌野生毒株Aeromonas salmonicida SDy0701，测试条件和结果如表4所示。杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变菌株HTAsf-5307通过腹腔注射进行人工感染，测试条件和结果如表5所示。

表4杀鲑气单胞菌毒株对大西洋鲑半数致死量的测定结果。

分组剂量(CFU/尾)实验数（尾）死亡数2周后存活数死亡率（%）11×10⁸30300100%21×10⁷30300100%31×10⁶3027390%41×10⁵3021970%51×10⁴30121840%对照生理盐水300300%

表5杀鲑气单胞菌减毒突变株对大西洋鲑半数致死量的测定结果。

分组剂量(CFU/尾)实验数（尾）死亡数2周后存活数死亡率（%）11×10⁹3032710%21×10⁸300300%31×10⁷300300%41×10⁶300300%51×10⁵300300%对照生理盐水300300%

记录2周内，每组每个感染剂量下每天的死亡尾数，并计算累计死亡率，测定LD₅₀值（见表6）。

表6杀鲑气单胞菌毒株HTAsf-5307和减毒株对大西洋鲑的LD₅₀。

感染菌株LD₅₀备注SDy07013.16×10⁴>14天内达到半数致死HTAsf-5307>1×10⁹>--

上述结果表明，在注射攻毒下，减毒株相对于杀鲑气单胞菌野生毒株具有明显的减毒效应。

实验例5：以大西洋鲑为试验动物的注射给药免疫保护试验。

试验大西洋鲑随机分组，每组3个平行水槽，10尾/槽。将制备的减毒活疫苗采用腹腔注射方式免疫。注射免疫剂量为1×10⁷ CFU/尾，腹腔注射大西洋鲑。对照组注射相同体积的无菌生理盐水。免疫6周后将各组免疫大西洋鲑用杀鲑气单胞菌野生毒株活菌（腹腔注射1×10⁵CFU/尾）进行人工感染攻毒。在15天内观察统计对照组和免疫组死亡数，统计结果如图4所示。

利用以下公式计算相对免疫保护率：

相对免疫保护率(RPS)%＝(对照组死亡率-试验组死亡率)/对照组死亡率×100%。

经计算，所制备的杀鲑气单胞菌减毒活疫苗对大西洋鲑的免疫保护率达到90%，由此可见，该疫苗对杀鲑气单胞菌有很好的防治效果，能有效地保护大西洋鲑抵御杀鲑气单胞菌的侵染。

实验例6：以斑马鱼为试验动物的浸泡给药免疫保护试验。

试验斑马鱼随机分组，每组3个平行水槽，10尾/槽。将制备的减毒活疫苗采用浸泡方式免疫。浸泡免疫是将制备好的疫苗原液用无菌生理盐水稀释成2×10⁷CFU/ml，放入浸泡用无菌空水槽至10L，水温为28.5±2℃，然后将各组实验斑马鱼依次浸泡处理，浸泡时间为15分钟。对照组不做任何处理。免疫4周后将各组免疫斑马鱼用杀鲑气单胞菌野生毒株活菌（肌肉注射1×10⁴CFU/尾）进行人工感染攻毒。在15天内观察统计对照组和免疫组死亡数，统计结果如图5所示。

利用以下公式计算相对免疫保护率：

相对免疫保护率(RPS)%＝(对照组死亡率-试验组死亡率)/对照组死亡率×100%

经计算，所制备的减毒活疫苗具有良好的杀鲑气单胞菌野生株感染防治效果，浸泡免疫4周后的免疫保护率达到77.8%。和注射给药效果相比，浸泡免疫同样表现出良好的免疫效果，说明本发明可以方便地通过浸泡给药方式获得高效力的免疫保护性。

本发明的杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株缺失杀鲑气单胞菌毒株的芳香族氨基酸合成酶相关基因片段，和三型分泌系统相关编码基因的部分片段，缺失上述基因可阻碍杀鲑气单胞菌野生毒株的芳香族氨基酸合成、叶酸合成和三型分泌系统的组装，从而导致杀鲑气单胞野生毒株毒力大大降低。

综上所述，本发明的杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株或相关制剂消除了传统减毒活疫苗普遍存在的环境和产品安全风险，是针对由杀鲑气单胞菌引起的养殖鱼类病害的一种安全、有效、经济的疫苗。

<160> SEQ ID NO.1 

 

<210> 1

<211> 343

<212> DNA

<213> 缺失了杀鲑气单胞菌野生毒株的芳香族氨基酸合成基因aroC的部分片段

 

<400>  1

GAGAATACCG ATCAGCGTTC CAAGGATTAC TCCGACATCA AGGACGTGTT TCGTCCGGGC  60

CATGCGGATT ACACCTACCA CCAGAAATAT GGTCAGCGGG ATTATAGGGG GGGCGGTCGC  120

TCCTCCGCCC GTGAAACTGC CATGCGGGTG GCGGCGGGTG CCATTGCCAA GAAGTACCTC  180

AAGCAGATGC ATGGCATCGA GATCACCGGC TTTCTCTCCC AGCTCGGCCC CATCAAGGCG  240

GAAGGCTTTG ACGCGGCGCA AATTGAGCAG AACCCCTTCT TCTTCCCCGA TGCGGGCAAG  300

CTGGAAGAGC TCGATCAGTA CATGCGCGAT CTGAAAAAAG AGG                        343

 

<160> SEQ ID NO.2 

 

<210> 1

<211> 1565

<212> DNA

<213> 缺失了杀鲑气单胞菌野生毒株的Ⅲ型分泌系统编码基因aopN、acr1及ascN的部分片段

 

<400>  1

 

TTGATAGAGC AGCACCTGCT GGCGACAATC TGACAGCTCA AGAGCCACAC CGACCTGCTC     60

CACATCCCGC ACGCTGGCCC AGCGTTTCTC CACCAGGGCG ATCAGATCGC CCATCAGATC    120

AGAAGGCCCG TATACCATGG GCCGAACCCT CCTTCACCCG TTGCCACAGC TCGTCCACTT    180

GCGCCGAGAG AGTGTTGAGC AGCCGCAGCT TGTGCATGTC GCTCATCACC CGTTCCAGCT    240

TGACCGGGTC GAGCCAGCGC TGCTGGCTGT CGAGATCGGC GCTCAGGGCC TTCATCATGA    300

AACCGGTCAC CTTCTCCAGC GCTCCGTTGC CAAAGCGGCT GTGAATATCG CGCCAGGCGG    360

CAGAGAGGGC GCGGTAGTCC TGCACCGCAT CGCGATAGAG ATCCCGCAGA TCCTGCTCGG    420

CCCCCACGCC CGCTTTGGCC GCTTCAGCCG CGGGGCCGGT AATGCGCGCC CCCAGCACGA    480

TGGCACTGCC CTGCTCGTCC GCCAGCTTGG CCAGCGCCTG CTCGACCAGC GCCAGGGTGC    540

CCTGCATATC CGGTCGTCCG GATAGCGCCT TGCGCGCCTG ACAGAGCGCT TCGAACTGCT    600

CGCTCACCTC CCCCGAATAG CTCTCGAGGT AGGCTAGCAG CTGGGAGAGG TTGGCCAGCC    660

GACCGCTGCC GAGGTGGCTC ACCATCTCCT TGATCTTCTG CTGGCGCTCA AGCTCCGGCA    720

CCTTGTCGAG GTAGTCCCCC ACCAGCGCCT CGATCTCGCT GATGCGGGCA TGGCTGTCAC    780

TCAGCTTGCG CTTGGCGAGC GAAAGCTCAG CGCGCTCGGA AAAGACAAAG GTGAGCTCTT    840

CGGCGGCATC GGCCAGCGAC TGGGAGGCAC TGGCCAGCAC GACTCGCTCC CCCTGAAACT    900

GTCCTCCCTG CAGGGGAGTC TGACGGGATG CGACCTCTGC TCCGCGCAGC TCGGGCTGGG    960

CGGCAGAGGC ATAGGGGTTG CTCTGGATAA TGGCCATGGA AACTCCCGTG ACGAATGGAT   1020

TGACGAGGAT GGCATTATAA AAATCACCCT CGCCTCCCTA TGCCAAAATC GGCCGTGAAT   1080

TTTTAGCCCG CCCCCAACGG TTTTCTAAAA AGTCCCGACT CGCGCTGAAA TCCCCGTAGC   1140

CCCCCATCCC CTATAGTGGC CGCCAGTTTC AATGGCGCAG ATTGTTATGA CCCTCTCCCT   1200

CGACCACATC CCCGACCAGC TTCGTCACGC CATCGACGAG TGCCGCCTGA TCCAGATCCG   1260

TGGCCGGGTC ACCCAGGTGA CCGGCACCCT GCTCAAGGCG GTCGTCCCCG GGGTGCGGAT   1320

CGGCGAGCTC TGCCATCTGC GCAACCCGGA CAACACCCTC TCCCTGCAGG CAGAGGTGAT   1380

CGGCTTTGCC CAGCATCAAG CGCTGCTCAC CCCCCTTGGC GAAATGTTCG GCATCTCCTC   1440

CAACACCGAG GTGAGCCCGA CCGGTGCCAT GCATCAGGTC GGGGTCGGCG AACATCTGCT   1500

CGGCCAGGTG CTCGATGGCC TCGGCAACCC CTTTGGCGGC GGCCATCTGC CGGAGCCCGA   1560

GGCTT                                                                           1565