用于校正共聚焦扫描显微镜中的图像失真的方法

摘要

为了确定用于操作共聚焦扫描显微镜(20)的扫描单元(28)的扫描坐标值(φn，θn)，借助于笛卡尔图像坐标值(Xn，Yn)到球面坐标系统的坐标转换，根据样本(32)的要创建的图像(60)的像点的笛卡尔图像坐标(Xn，Yn)确定球面扫描坐标值(φn，θn)。根据该球面扫描坐标值(φn，θn)来操作该扫描单元(28)。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于确定(identify)用于操作共聚焦扫描显微镜扫描 单元的扫描坐标值或者校正扫描坐标值的方法。本发明还涉及一种借助于 共聚焦显微镜来创建样本图像的方法。

背景技术

共聚焦扫描显微镜能够用来例如激发样本特别是组织样本中的荧光 物质，并检测由此产生的荧光。其原理在于，照射光束经由扫描单元引导 到样本上，扫描单元根据包含扫描坐标值的驱动信号来操作。该扫描坐标 值表示扫描单元的定位元件的位置。从样本中发出的荧光经由扫描单元以 及从照射光中分离该荧光的分束器引导到检测针孔，该检测针孔允许小部 分检测光(detected light)通过而到达检测器。借助于检测器所测出的检 测光根据扫描坐标值而被检测。换句话说，除了扫描单元所检测的信号， 还记录在对检测光的检测中扫描单元的定位元件所处的位置，该位置是由 扫描坐标值表示的。

检测光能够根据用以驱动扫描单元的扫描坐标值而被检测；如果扫描 单元(特别是它的位置)是以闭环方式控制的，那么也能够将该预定义扫 描坐标值称为“目标”扫描坐标值。或者，扫描单元的真实位置能够借助 于传感器测出，然后就能够将这些测出的扫描坐标值与在该测出位置所检 测到的检测光关联起来；再者，如果扫描单元的位置是以闭环方式控制的， 那么也能够将这些测出的扫描坐标值称为“实际”扫描坐标值。

在样本的光学扫描期间或者之后，样本的图像能够基于许多的采集像 点组合而成，每个像点的位置是由一对图像坐标值确定的，并且相应的扫 描坐标值是关联到图像坐标值的。通过近似法确定图像坐标值与扫描坐标 值的这一关联是已知的。然而，这能够产生失真和/或变形，特别是在样本 图像的边缘处。

图像失真的产生不仅仅因为近似计算得到的扫描坐标值，而且因为共 聚焦扫描显微镜的光学元件的光学效应，该光学效应在已知的扫描显微镜 或者用于操作扫描显微镜的方法中未加考虑。

失真是成问题的，特别是要从多个并置的单个图像组成成样本的整个 图像的时候，因为此时图像在它们的边缘处彼此并不匹配。此外，在将以 共聚焦方式获取的样本的图像叠置于宽视场图像上时，这可能更成问题， 因为在图像边缘处的这种失真对于宽视场成像不会产生，而样本的两幅图 像在一起不会适配，尤其是在图像的边缘处。

发明内容

本发明的目的是建立一种用于确定用于操作共聚焦扫描显微镜的扫 描单元的扫描坐标值或者校正扫描坐标值的方法，或者一种借助于扫描显 微镜来创建样本图像的方法，其能够利用简单的手段创建样本的精确图 像，特别是在图像边缘处。

该目的通过独立权利要求的特征来实现。有利的实施例出现在从属权 利要求中。

根据第一方面，本发明特征在于：通过笛卡尔图像坐标值到球面坐标 系统的坐标转换，根据样本的要创建的图像的像点的笛卡尔图像坐标，确 定球面扫描坐标值。根据该球面扫描坐标值来操作该扫描单元。

笛卡尔图像坐标值到球面坐标系统的转换有助于样本的图像的像点 (其通过对检测光的检测来确定)与共聚焦扫描显微镜的扫描单元的位置 之间的精确关联，扫描单元的该位置由球面扫描坐标值来预定义。这得到 了这样的结果：样本的图像精确地对应于样本，特别是在图像的边缘处。

球面扫描坐标值以一定格式存在，或者被格式化，以使扫描单元可根 据球面扫描坐标值来操作。就这一点来说，其意即，将球面扫描坐标值保 存在关联明细例如表格中，之后将该关联明细存储在扫描显微镜的控制单 元的存储单元中，并且在共聚焦扫描显微镜的工作期间由控制单元读出。 调制驱动信号，以使扫描单元的定位元件居于与球面扫描坐标值对应的位 置。或者，能够将球面扫描坐标值正好以如下方式格式化，即，它们已经 作为驱动信号、例如调制过的而存在(无需转换)；并且将这些例如以数 字化方式存储在控制单元的存储单元中。在每种情形下，扫描单元的位置 指的都是，借助于扫描单元而偏转的照明光束与在扫描单元参考位置时借 助于扫描单元而偏转的参考光束形成的夹角。

在有利的实施例中，当确定该球面扫描坐标值时对扫描显微镜的不同 的变焦步进(zoom step)加以考虑。“变焦”指的是区域或者坐标区域的 极限。变焦步进对应于放大率步进，并且也能够这样称呼它。就此而言， 如果该不同的变焦步进是通过将像点彼此之间的间隔预定义为与变焦步 进相关来加以考虑的，那么这是特别有利的。对变焦步进加以考虑使得总 是可以保证以后操作扫描显微镜时图像创建有相同的精度，而不管变焦步 进如何。

根据一个改进，借助于坐标转换来仅仅确定第一球面扫描坐标值，而 通过对该第一扫描坐标值进行插值来确定第二球面扫描坐标值。当仅仅具 有有限的计算能力或者当球面扫描坐标值的确定必须要特别快地实施的 时候，例如在扫描显微镜的操作期间，这是特别有利的。

一个改进提供了将预定义扫描坐标值基于该球面扫描坐标值来校正。 这使得能够驱动已有的扫描显微镜，特别是它的扫描单元，从而获得图像 的精准确定。预定义扫描坐标值可以例如用球面扫描坐标值来替代，或者 可以仅仅对预定义扫描坐标值和球面什么坐标值之间的不同进行确定，并 且仅仅基于该不同来校正预定义扫描坐标值，就此而言，也可以将该不同 称为“校正项”。

根据第二方面，本发明的显著之处在于，将照明光束经由扫描显微镜 的扫描单元引导到参考样本上。根据预定义扫描坐标值驱动扫描单元，以 使照明光束对参考样本进行光学扫描。根据预定义扫描坐标值测出来自参 考样本的检测光。将预定义扫描坐标值与该参考样本的要确定的图像的像 点的图像坐标值关联起来。基于在对应的预定义扫描坐标值处测出的检测 光对在图像坐标值处的像点进行确定。基于确定的像点创建参考样本的图 像。将参考样本的该图像与该参考样本进行比较，并且，根据该比较校正 预定义扫描坐标值。

参考样本的图像的创建、以及基于所创建的图像实施的预定义扫描坐 标值的校正，能够有助于例如在较不精确的预定义扫描坐标值的情形下确 定校正项的能力，采用该校正项，较不精确的扫描坐标值能够用相对其较 为精确的扫描坐标值来代替。没有了借助于参考样本所实施的校正，就很 可能产生由于扫描显微镜的光学效应而导致的样本的图像失真现象，即使 存在精确的预定义扫描坐标(例如上面述及的球面扫描坐标值)。这些失 真能够借助于参考样本而考虑进来并将其消除。

任何具有明确结构的样本，例如包括紧密点阵的样本，适合作为参考 样本。例如通过微芯片制造中已知的方式蚀刻半导体衬底能够产生具有非 常精确的参考图案的参考样本。例如通过对参考样本的图像和参考样本的 精确产生的参考图像进行比较，能够产生参考样本的图像和参考样本之间 的比较。特别地，该比较能够借助于计算机上的图像处理系统来自动实施。 预定义扫描坐标值的校正可以例如通过用校正扫描坐标值来代替预定义 扫描坐标值而产生；或者可以仅仅对预定义扫描坐标值和校正扫描坐标值 之间的不同值进行确定，并且能够将经如此确定得到的不同用预定义扫描 坐标值来校正构成校正项。

在一个改进中，参考样本的图像以该扫描显微镜的不同的变焦步进来 获取，并且根据对应的变焦步进校正预定义扫描坐标值。换句话说，用于 确定校正扫描坐标值的该方法是以扫描显微镜的不同的放大率来实施的， 并且经确定校正扫描坐标值，或者对应的校正项以与对应的变焦步进或者 放大步进相关联的方式保存，该扫描坐标值以后在扫描显微镜的操作期间 按照当前设置的变焦步进来预定义。用于确定校正扫描坐标值的该方法能 够在按照期望地使用共聚焦扫描显微镜之前，或者也可以在将扫描显微镜 完成之后，例如以常规校准的方式来实施。

根据第三方面，本发明的显著之处在于，将照明光束经由扫描显微镜 的扫描单元引导到样本上，根据预定义扫描坐标值驱动扫描单元，使得照 明光束对样本进行光学扫描，确定用以表示该扫描单元的真实位置的扫描 单元的扫描坐标值，校正经确定的扫描坐标值。根据校正扫描坐标值测出 来自样本的检测光。将校正扫描坐标值与要确定的样本的图像的像点的图 像坐标值关联起来。基于在对应的校正扫描坐标值处测出的检测光来确定 在图像坐标值处的像点。基于确定的像点来创建样本的图像。

根据第四方面，本发明的显著之处是一种与根据第三方面所述的方法 非常对应的方法。与之相反，首先根据确定的扫描坐标值测出来自样本的 检测光，然后校正确定的扫描坐标值，其结果是，检测光与扫描坐标值的 关联性被修改。

根据第一或者第二方面，原则上，能够将预定义和/或球面和/或校正 扫描坐标值用来驱动扫描单元。与此相反，根据第三方面和第四方面所述 的经确定的扫描坐标值的校正指的是，在扫描显微镜的操作期间测出的扫 描坐标值。如果扫描单元，特别是扫描单元的定位元件，是以闭环控制系 统来操作的，那么就也能够将预定义扫描坐标值称为“目标”扫描坐标值， 并且也能够将经确定的扫描坐标值称为“实际”扫描坐标值。换句话说， 例如，按照第一和第二方面，能够产生目标扫描坐标值的校正，而按照第 三或者第四方面，能够产生实际扫描坐标值的校正。就此而言，例如，预 定义扫描坐标值能够是前述的球面扫描坐标值或者校正扫描坐标值，和/ 或经确定的扫描坐标值能够是未校正扫描坐标值。

附图说明

下面参照示意性附图来进一步解释本发明的示例性实施例，其中：

图1示出共聚焦扫描显微镜，

图2绘出坐标转换，

图3示出用于实施坐标转换的公式，

图4使出参考样本和该参考样本的图像，

图5示出关联明细，

图6示出用于识别校正扫描坐标值的方法，

图7是用于操作共聚焦扫描显微镜的第一种方法的流程图，

图8是用于操作共聚焦扫描显微镜的第二种方法的流程图，

在整个附图中，同一设计或者功能的元件用相同的附图标记标示。

具体实施方式

图1示出共聚焦扫描显微镜20。扫描显微镜20包括产生照明光束24 的激光源22。照明光束24能够包含单波长的光或者多波长的光，例如宽 波段激光，特别是白光。作为选择或者额外地，扫描显微镜20能够包含 例如产生不同波长的光或者波长区段的另外的激光源。将照明光束24引 导到主分束器26上，主分束器26由例如二向色镜构成，其将照明光束24 偏转到扫描单元28。扫描单元28优选包含与两个或者多个定位元件耦合 的一个或者多个镜子。定位元件借助于扫描显微镜20的控制单元(未绘 出)驱动，并且以这样的方式耦合到镜子：在驱动定位元件时，镜子以不 同的方向偏转照明光束24。扫描单元28将照明光束24引导到物镜30， 物镜30将照明光束24聚焦到样本上，该样本可以是例如参考样本32。

样本例如是组织样本，其包括被导入到样本中的发荧光的物质、和/ 或包括借助于照明光束24可激活并在激活状态下能够被激发而发出荧光 的物质。

任何具有明确结构的样本，例如包括紧密点阵的样本，适合作为参考 样本32。这种参考样本32能够例如在微芯片制造中从半导体衬底蚀刻出。 这能够有助于极精确地制造参考样本的结构，甚至是在次纳米范围内。

来自样本的检测光相应地包含例如荧光或者反射光，其以检测光束34 的形式通过物镜30到达扫描单元28，物镜30将检测光束34引导到主分 束器26上，主分束器26允许检测光通过到达检测针孔36，从而到达检测 器38，该检测针孔例如是一个开口。

扫描单元28按照控制单元的存储介质中存储的扫描坐标值操作，并且 测出的检测光根据扫描坐标值而测出。换句话说，借助于控制单元，将测 出的检测光与当前设置的扫描单元28的位置关联起来，该位置是用扫描 坐标值表示的。这些扫描坐标值能够是用以驱动扫描单元28的扫描坐标 值，或者，作为选择，能够提供测出扫描单元28的定位元件的真实位置 的传感器；然后就能够将以该方式测出的扫描坐标值与相应的测出的检测 光关联起来。如果扫描单元28的定位元件是借助于闭环控制系统来操作 的，那么能够将用以驱动扫描单元28的扫描坐标值称为“目标”扫描坐 标值，并且能够将测出的扫描坐标值称为“实际”扫描坐标值。

图2示出坐标转换，通过该转换，将要创建的图像的像点的笛卡尔图 像坐标值X_n、Y_n与用以代表扫描单元28的定位元件的位置的球面扫描坐 标值Φn和θn关联起来。该坐标转换能够通过例如图3所示的公式F1到 F6来实施。笛卡尔坐标到球面坐标的转换特别地在图2中示出，并且按照 图3的公式来实施。笛卡尔坐标系统包括X轴40、Y轴42和Z轴44，每 一个都与其它相垂直。作为选择，如果仅仅显示一个例如由X轴40和Y 轴42定义的二维笛卡尔面，那么可能也够了。在笛卡尔坐标系统中能够 绘出中间像平面52和样本平面54上的点，特别是图像坐标值Xn、Yn。 该笛卡尔坐标系统被布置成Z轴44表示与参考方向和位置对应的方向和 位置。把在参考方向上偏转和位于Z轴44上的光束称为参考光束。位于 参考位置的扫描单元28沿着参考方向偏转参考光束。如果照明光束24对 应于参考光束，那么它将到达样本平面上的点x₀、y₀，该点在中间像平面 52中对应于像坐标值为X₀、Y₀的像点。

转换箭头50表示相对于参考光束偏转的照明光束24。转换箭头50相 对于Z轴40的角度为Φ₁，并且相对于由X轴40和Z轴44构成的平面的 角度为θ₁。以这种方式偏转的照明光束24到达中间像平面52上的点x₁、 y₁，在样本平面54内与样本上坐标值为X₁、Y₁的点对应。也可以将角度 Φn和θn称为“扫描坐标值”。

公式F1表示笛卡尔图像坐标到球面坐标系统转换的原理。公式F2表 示借助于转换箭头50实施的转换。转换箭头在公式F2中指的是“r(θ；φ)”， 其中r₀是光束绕其偏转的点与中间像平面52之间的距离(参考图2)。这 得到公式F3中示出的用于笛卡尔X坐标的校正，以及公式F4中示出的用 于笛卡尔Y坐标的校正。重新配置这些公式得到公式F5所示的用于第一 球面坐标值Φ_i的关系以及公式F6所示的用于第二球面扫描坐标值θ_i的关 系。

图4示出参考样本32的表面、以及参考样本32的图像60。为了获取 参考样本32的图像60，能够将如上所确定的球面扫描坐标值Φ_n、θ_n用 作扫描单元28的驱动值。然而，即使利用这种精确的球面扫描坐标值Φ_n、 θ_n，在参考样本的图像60的边缘处，仍然能够产生失真，为便于理解， 在图4中夸大地绘出该情形。这些失真可能源于例如扫描显微镜20的光 学元件的光学效应。作为选择，也能够使用相对不太精确的扫描坐标值， 例如借助于数学近似所确定的扫描坐标值来操作扫描显微镜20。那么该失 真一方面源自上述光学效应，另一方面源自在确定扫描坐标值时的近似。

图5示出以表格形式绘出的关联明细。该关联明细能够存储在例如扫 描单元28的存储介质中和/或能够借助于上面解释的坐标转换和/或参考样 本32的图像60的获取而产生。为了按照所期望的操作扫描显微镜20，原 则上仅仅将所绘表格的列中的两列存储在控制单元中就够了。例如，能够 存储第一和第二列、第一和第三列、或者第一和第四列。这样就分别产生 了笛卡尔图像坐标值X_n、Y_n与球面扫描坐标值φ_n、θ_n或者校正扫描坐标 值φ_nk、θ_nk、或者借助于校正项φ_nL、θ_nL所校正的球面扫描坐标值φn、 θn之间的关联。

球面坐标值φn、θn最好借助于图2和图3所解释的坐标转换来获得。 作为选择或者额外地，校正扫描坐标值φ_nk、θ_nk能够仅仅借助于参考样 本32的图像60的所获取的图像，或者借助于坐标转换和参考样本32的 图像60的所获取的图像来确定。这同样用于对于该表格的第四列，在该 列中，球面扫描坐标值φ_n、θ_n借助于校正项φ_nL、θ_nL校正，校正项是 通过将球面扫描坐标值φn、θn和校正扫描坐标值φ_nk、θ_nk比较而获得 的。

图6示出借助于参考样本32确定校正扫描坐标值φ_nk、θ_nk的程序的 流程图。

在步骤S2中，根据预定义扫描坐标值而将参考样本32光学扫描。预 定义扫描坐标值能够是球面扫描坐标值φ_n、θ_n或者相对于其不精确的扫 描坐标值。

在步骤S4中，根据预定义扫描坐标值检测从参考样本32反射的检测 光。换句话说，除了其他之外，所测出的是，扫描单元28在检测光的特 定元件被测出的那个时刻怎样被激活。

在步骤S6中，根据检测光创建参考样本32的图像60。特别地，参考 样本32的图像从单独的像点汇总，并且像点是基于检测光确定的。这里， 借助于图5所示的关联规则，能够产生对应的预定义扫描坐标值、特别是 球面扫描坐标值φn、θn或者借助于球面扫描坐标值φn、θn校正的校 正扫描坐标值φnk、θnk，与像点的笛卡尔图像坐标值Xn、Yn之间的关 联。参考样本32的区域(检测光从该区域发出)因此而被获知，从而能 够确定特定的像点。

在步骤S8中，将参考样本32的图像60与参考样本32进行比较。例 如，能够创建参考样本32的参考图像，并且例如借助于计算机中存储的 图像处理程序，能够将参考样本32的图像60与该参考图像进行比较。该 比较包含了对参考样本32的图像60和参考图像之间的偏离、特别是失真 的检测。例如，能够将图像60的交叉点与参考图像的交叉点进行比较， 并且能够确定它们的间隔和偏移方向，并用于校正。

在步骤S10中，根据该比较来校正预定义扫描坐标值。在这个校正中， 特别地，这样考虑参考点的偏移这一因素，即，当随后驱动扫描单元28 时，图像60的交叉点对应于参考样本32中的参考点。除了球面扫描坐标 值φn、θn或者预定义扫描坐标值，还能够将校正扫描坐标值φnk、θnk 存储在该关联明细中。另一选择，能够将预定义扫描坐标值用校正值φnk、 θnk来替代。另一选择，仅仅确定预定义扫描坐标值和校正扫描坐标值φ nk、θnk之间的不同的项，并且与预定义扫描坐标值关联存储。

当对另外的样本例如组织样本进行检查时，于是如参照图1所述，就 能够基于校正扫描坐标值φ_nk、θ_nk或者带有校正值φ_nL、θ_nL的预定义扫 描坐标值来驱动扫描单元28。如果扫描单元28的定位元件的位置是以闭 环的方式来控制的，那么校正扫描坐标值φ_nk、θ_nk或者带有校正值φ_nL、 θ_nL的预定义扫描坐标值就是定义扫描单元28的定位元件的目标位置的 目标扫描坐标值。

图7示出用于操作共聚焦扫描显微镜20的方法的流程图。该方法适于 获取组织样本的图像。在步骤S12中，将样本作为预定义扫描坐标值的函 数进行光学扫描。预定义扫描坐标值能够是通过近似而确定的扫描坐标 值，球面扫描坐标值φ_n、θ_n，或者通过近似而确定的、借助于球面扫描 坐标值φ_n、θ_n校正的扫描坐标值，也即，校正扫描坐标值φ_nk、θ_nk。

在步骤S14中，测出对应于扫描单元28的定位元件的真实位置的扫 描坐标值。优选的是，为此目的而提供测出定位元件的位置的传感器。如 果扫描单元28是借助于闭环控制系统而操作的，那么也能够将测出的扫 描坐标值称为“实际”扫描坐标值。

在步骤S16中，对测出的扫描坐标值进行校正。最好，测出的扫描坐 标值(如果它们是通过近似所确定的扫描坐标值)借助于球面扫描坐标值 φn、θn和/或借助于图6中方法所示的校正来进行校正。

在步骤S18中，根据校正扫描坐标值测出检测光。

在步骤S20中，基于测出的检测光将样本的图像汇总，对应于图6所 示方法的步骤S6中的创建参考样本32的图像。

图8示出用于操作共聚焦扫描显微镜20的方法，作为图7所示的用于 操作扫描显微镜20的方法的一种替代。用于操作扫描显微镜20的第二程 序的步骤S22到S30对应于用于操作扫描显微镜的第一方法的步骤S12到 S20，步骤S26和S28与步骤S16和S18相比在次序上是相反的。特别地， 首先执行步骤S26，在该步骤中，根据测出的扫描坐标值，特别是根据还 未校正的测出的扫描坐标值、或者还未校正的实际扫描坐标值，来测出检 测光。然后，在步骤S28中，随之对测出的扫描坐标值或者实际扫描坐标 值进行校正。

换句话说，在图7所示的方法中，实际值的校正是在图像的获取期间 或者检测光的检测期间产生；与此相反，图8中的方法还能够在以后实施， 在检测光的检测已经结束之后。对于例如现有的和已知的产生较不精确的 样本图像的扫描显微镜，借助于图8中所示的方法，其仍然可以在后面的 时间创建没有失真的精确的图像。

图1中所示的共聚焦扫描显微镜20仅仅是示意性地绘出。特别地，这 种显微镜——其在相关的技术资料中广为人知——包括非常多的镜子、孔 径和光学元件诸如聚焦透镜和准直透镜。此外，不是荧光显微的显微方法 也能够利用共聚焦扫描显微镜来实施。本发明的方法可以应用于所有的扫 描方法。

部件列表

20扫描显微镜

22激光源

24照明光束

26主分束器

28扫描单元

30物镜

32参考样本

34检测光束

36检测针孔

38检测器

40X轴

42Y轴

44Z轴

50转换箭头

52中间像平面

54样本平面

60参考样本的图像

x_n，y_n  样本坐标值

X_n，Y_n    笛卡尔图像坐标值

φ_n、θ_n  扫描坐标值

φ_nK、θ_nK  校正扫描坐标值

φnL、θnL  校正项

F1-F6公式一到六

S2-S20步骤二到二十