一种用于生产罗米地辛的方法及发酵培养基

摘要

本发明公开了一种用于生产罗米地辛的方法及发酵培养基。本发明公开了一种用于生产罗米地辛的发酵培养基，其包含碳源、有机氮源和无机磷酸盐；所述的碳源包括葡萄糖和甘露醇，所述的有机氮源包括玉米浆、干酪素和黄豆粉；所述的碳源占所述发酵培养基的含量为4%～10%；所述的有机氮源占所述发酵培养基的含量为2%～5%；所述的无机磷酸盐占所述发酵培养基的含量为0.1%～2.1%，以上含量均为重量含量。本发明还公开了一种用于生产罗米地辛的方法。本发明的发酵培养基用于生产罗米地辛时，产量提高到500～600mg/L，较现有技术中的发酵培养基提高了150%～200%以上。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于生产罗米地辛的方法及发酵培养基。

背景技术

罗米地辛（Romidepsin）是从紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum） 的发酵培养液中分离得到的一种天然多聚肽，其分子式为C₂₄H₃₆N₄O₆S₂，分 子量为540。

罗米地辛是一种新型的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，HDAC是 一类锌离子酰胺酶，在催化组蛋白脱乙酰基时，锌离子跟乙酰基上氧的水合 物螯合形成过渡态，HDAC的过度或异常调控使组蛋白过度去乙酰化，染色 体凝聚使转录受到抑制，引起相应基因表达下降，导致肿瘤病症发生。罗米 地辛抗肿瘤机理为罗米地辛进入细胞后，由还原性谷胱甘肽（GSH）将其二 硫键还原为巯基，巯基可竞争性结合HDAC上的Zn²⁺，使HDAC失效，从 而达到抗肿瘤的目的。

专利US7396665B2中公开一种使用紫色色杆菌（Chromobacterium  violaceum）WB968生产罗米地辛的方法，具体如下将一环罗米地辛的生产 菌紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）WB968接入种子液（2%肉汤、 1%葡萄糖），30℃摇床培养24h后接入发酵培养基（1%葡萄糖、2%肉汤培 养基、KH₂PO₄1.1%、Na₂HPO₄·2H₂O0.72%、MgSO₄7H₂O0.006%、(NH₄)₂SO₄0.1%），于26.5℃下培养48h，如果在培养基中补充200mmol/L的L-半胱氨 酸，产量最大达到224mg/L。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服了现有的用于生产罗米地辛的发 酵培养基生产罗米地辛时产量低的缺陷而提供了一种用于生产罗米地辛的 方法及发酵培养基。本发明的发酵培养基能够使罗米地辛的产量提高到 500～600mg/L，较现有技术中的发酵培养基提高了150%～200%以上。

本发明提供了一种用于生产罗米地辛的发酵培养基，其包含碳源、有机 氮源和无机磷酸盐；所述的碳源包括葡萄糖和甘露醇；所述的有机氮源包括 玉米浆、干酪素和黄豆粉；所述的碳源占所述发酵培养基的含量为4%～10%； 所述的有机氮源的含量为2%～5%；所述的无机磷酸盐的含量为0.1%～2.1%， 以上含量均为重量含量。

其中，所述的碳源占所述发酵培养基的含量较佳地为4%～8%；所述的有 机氮源占所述发酵培养基的含量较佳地为2%～4%；所述的无机磷酸盐占所述 发酵培养基的含量较佳地为0.4%～1.2%，以上含量均为重量含量。

其中，所述的葡萄糖占所述发酵培养基的含量较佳地为1%～2.5%，更佳 地为1.5%～2%。所述的甘露醇占所述发酵培养基的含量较佳地为2%～8%，更 佳地为2%～6%，更佳地为4～6%，以上含量均为重量含量。

其中，所述的干酪素占所述发酵培养基的含量较佳地为0.2%～1.2%，更 佳地为0.2%～0.8%，最佳地为0.6%～0.8%。所述的玉米浆占所述发酵培养基 的含量较佳地为1%～3%，更佳地为1%～2%。所述的黄豆粉占所述发酵培养 基的含量较佳地为0.2%～3%，更佳地为0.5%～2%，最佳地为0.5～0.2%，以上 含量均为重量含量。

其中，所述的碳源较佳地，还包括蔗糖、糊精、玉米淀粉、可溶性淀粉 和甘油中的一种或多种。

其中，所述的有机氮源较佳地，还包括棉籽粉、干酵母、聚蛋白胨和黄 豆饼粉中的一种或多种。

其中，所述的无机磷酸盐为本领域发酵培养基中常规的无机磷酸盐，较 佳地为磷酸二氢钾。

其中，所述的发酵培养基还可包括无机氮源，所述的无机氮源可为本领 域发酵培养基中常规所述的无机氮源，较佳地为铵盐。所述的铵盐较佳地为 碳酸铵。所述的铵盐占所述发酵培养基的含量较佳地为1%以下，更佳地为 0.5%以下，以上含量为重量含量。

其中，所述的发酵培养基还可包括天然油脂，所述的天然油脂较佳地为 玉米胚芽油、橄榄油、花生油、大豆油和稻米油中的一种或多种。所述天然 油脂占所述发酵培养基的含量较佳地为0.05%～1%，更佳地为0.1%～0.5%，以 上含量均为重量含量。

其中，所述的发酵培养基还可包括七水硫酸镁和/或氯化钠。所述的七水 硫酸镁占所述发酵培养基的含量较佳地为0.005%～0.2%。所述的氯化钠占所 述发酵培养基的含量较佳地为0.5%以下。所述的发酵培养基的pH值较佳地 为5～7.5，更佳地为6.5～7.2，以上含量均为重量含量。

本发明还提供了一种用于生产罗米地辛的方法，其包含下列步骤：将紫 色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的种子液接入到本发明的发酵培养 基中培养，即可。

其中，所述的种子液的接种量与发酵培养液的体积比较佳地为 1:200～1:25，更佳地为1:100～1:50。所述的培养的温度较佳地为25℃，所述 的培养的时间较佳地为96小时。

所述的种子液的制备方法和条件为本领域常规的方法和条件。本发明特 别优选下列方法和条件：将紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）活化 后接种于斜面培养基中，培养，得到生长期的菌体；然后将菌体接种于种子 培养基中，培养，得到种子液。

其中，所述的紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）市售可得，较 佳地，所述的紫色色杆菌购自Fermentation Research Institute Agency of  Industrial Science and Technology，日本，编号为FERM BP-1968的紫色色杆 菌（Chromobacterium violaceum）WB968，参见US7608280B2。

其中，所述的斜面培养基为本领域常规的斜面培养基，较佳地为LB培养 基，在使用前于121℃灭菌30min。所述的LB培养基的配方如下：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。

所述的菌体的培养方法和条件为本领域常规的方法和条件，本发明特别 优选为将斜面培养基置于28℃恒温培养箱中，培养1天，即可。

其中，所述的种子培养基为本领域常规的种子培养基，本发明特别优选 葡萄糖1%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%的种子培养基，所述的百 分比为每100mL的种子培养基含有的上述各组分的质量（g/100mL）。所述 的种子液的培养方法和条件可为本领域常规的方法和条件，本发明特别优选 的方法和条件为将菌体接种于装有30mL种子培养基的250mL摇瓶中，在30℃、 220rpm摇床上培养1天。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发 明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的发酵培养基能够使得罗米地辛的产量提高到500～600mg/L，较 现有技术的发酵培养基提高了150%～200%以上。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明中，所采用的紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum），购自 Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology，日 本，编号为FERM BP-1968的紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum） WB968，参见US7608280B2。

本发明中，相对效价计算公式为：相对效价=（HPLC测定的本发明培 养基产物峰面积÷标准发酵培养基的产物峰面积）×100%。

本发明中所述的标准发酵培养基为实施例2的发酵培养基。

本发明中，HPLC条件：色谱仪为Waters510型高效液相色谱仪，色谱 柱为C18柱，内径为4.6mm，柱长为250mm（4.6×250mm），填料的粒径 为5μm，检测波长为210nm，流动相为乙腈：0.3%磷酸二氢铵溶液（v/v=30： 70），流速为1mL/min，进样量为20μL，柱温为30℃。其中，0.3%磷酸二氢 铵溶液是指质量分数为0.3%的磷酸二氢铵溶液。

下述百分比除特别说明的以外，皆为重量百分比。

实施例1

将紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）WB968活化后接种于斜面 培养基（LB培养基：121℃灭菌20min），将斜面置于28℃恒温培养箱中， 培养1天，得到生长期的菌体，然后菌体接种于装有30mL种子培养基（葡 萄糖1%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%）的250mL摇瓶中，在 30℃、220rpm摇床上培养1天，得到成熟的种子液，得到的种子液以2%的 接种量接入装有30mL发酵培养基（葡萄糖2%，甘露醇2%，玉米浆1.0%， 干酪素0.2%，黄豆粉0.5%，氯化钠0.5%，磷酸二氢钾1.0%，七水硫酸镁 0.05%，稻米油0.05%，pH7.0）的250mL摇瓶中，置于25℃摇床继续培养 96小时，相对效价为300%，罗米地辛的产量为600mg/L。

实施例2～23中用于生产罗米地辛的方法与实施例1相同，不同之处在 于发酵培养基中各组分和/或含量不同，相对效价和产量不同，实施例2～23 中发酵培养基中各组分含量、相对效价和目标物产量如表1所示。其中，实 施例2中的相对效价为100%。对比实施例1～13中用于生产罗米地辛的方法 与实施例1相同，不同之处在于发酵培养基中组分和/或含量不同，相对效价 和产量不同，对比实施例1～9的发酵培养基中各组分含量、相对效价和目标 物产量如表2所示。对比实施例10～13的发酵培养基中各组分含量、相对效 价和目标物产量如表3所示。

下列表格1～3中，(1)：葡萄糖（%）；(2)：甘露醇（%）；(3)：玉米浆（%）； (4)：干酪素（%）；(5)：黄豆粉（%）；(6)：碳酸铵（%）；(7)：稻米油（%）； (8)：氯化钠（%）；(9)：磷酸二氢钾（%）；(10)：七水硫酸镁（%）；(11)： 可溶性淀粉（%）；(12)：玉米淀粉（%）；(13)：甘油（%）；(14)：糊精（%）； A：相对效价（%）；B：产量（mg/L）；S：实施例；DS：对比实施例。

表1

S (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) A B 2 2 2 1 0.2 1 0.1 0.05 0.5 1 0.05 100 201.0 3 2 8 1 0.2 1 0.1 0.05 0.5 1 0.05 129.5 260.3 4 2 6 1 0.8 0.2 0.1 0.05 0.5 1 0.05 147.7 296.9 5 2 6 1 0.2 1 0.1 0.05 0.5 1 0.05 153.5 308.5 6 2 6 1 0.8 2 0.2 0.2 0.5 1 0.05 162.5 326.6 7 2 6 1 0.8 2 0.4 0.05 0.5 1 0.05 170.6 342.9 8 2 6 3 0.8 1 0.2 0.2 0.05 0.1 0.005 190.5 350.6 9 2 6 1 0.8 1 0.1 0.05 0.5 1 0.05 188.5 378.9 10 2 6 1 0.8 1.5 0.1 0.05 0.5 1 0.05 201.4 404.8 11 2 6 1 0.8 3 0.1 0.05 0.5 1 0.05 203.5 409.0 12 2 6 2 0.8 2 0.2 1 0.5 2.1 0.2 230.6 410.3 13 2 6 1 0.8 2 0.05 0.05 0.5 1 0.05 211.5 425.1 14 2 6 1 0.8 2 0.2 0.5 0.5 1 0.05 212.7 427.5 15 1 6 1 0.8 2 0.2 0.2 0.5 1 0.05 213.6 429.3 16 2 6 1.5 0.8 0.5 0.5 0.5 0.5 0.4 0.1 250.9 440.5

17 2 6 1 0.8 2 0.1 0.05 0.5 1 0.05 220.4 443.0 18 2.5 6 1 0.8 2 0.2 0.2 0.5 1 0.05 226.9 456.1 19 2 4 2 0.6 1 0.2 0.5 0.5 1.2 0.05 260.9 456.1 20 2 6 1 0.8 2 0.2 0.05 0.5 1 0.05 265.8 534.3 21 1.5 6 1 0.8 2 0.2 0.2 0.5 1 0.05 268.9 540.5 22 2 6 1 0.8 2 0.2 0.1 0.5 1 0.05 291.7 586.3 23 2 6 1 0.8 2 0.2 0.2 0.5 1 0.05 301.2 605.4

对比实施例1～9：

表2

DS (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) A B 1 2 6 0 0 0 0.1 0.05 0.5 1 0.05 13.2 26.5 2 2 6 0 0 1 0.1 0.05 0.5 1 0.05 51.3 103.1 3 2 6 0 0.2 0 0.1 0.05 0.5 1 0.05 58.9 118.4 4 2 6 1 0 0 0.1 0.05 0.5 1 0.05 65.7 132.1 5 2 6 0 0.2 1 0.1 0.05 0.5 1 0.05 75.9 152.6 6 2 6 1 2 1 0.1 0.05 0.5 1 0.05 76.3 153.4 7 2 6 1 0 1 0.1 0.05 0.5 1 0.05 86.4 173.7 8 2 6 1 0.2 0 0.1 0.05 0.5 1 0.05 91.5 183.9 9 3 6 1 0.8 2 0.2 0.2 0.5 1 0.05 98.9 198.8

对比实施例10～13：

表3

DS 10 11 12 13 (1) 2 2 2 2 (2) 0 0 0 0 (3) 1 1 1 1 (4) 0.2 0.2 0.2 0.2

(5) 1 1 1 1 (6) 0.1 0.1 0.1 0.1 (7) 0.05 0.05 0.05 0.05 (8) 0.5 0.5 0.5 0.5 (9) 1 1 1 1 (10) 0.05 0.05 0.05 0.05 (11) 2 0 0 0 (12) 0 2 0 0 (13) 0 0 2 0 (14) 0 0 0 2 A 75.2 77.6 53.5 85.6 B 151.2 156.0 107.5 172.1

由表1～3可以看出，采用本法的发酵培养基用于生产罗米地辛，其产量 与现有技术相比得到明显提高，相对效价也较高，而当发酵培养基中的组分 和/或各组分的含量不在本发明的范围内，生产得到罗米地辛的相对效价和收 率均较低。