利用RNA干扰技术诱导凡纳滨对虾血淋巴细胞发生UPR的方法

摘要

本发明提供了一种利用RNA干扰技术诱导凡纳滨对虾血淋巴细胞产生UPR的方法，其包括如下步骤：(1)根据凡纳滨对虾Bip基因的cDNA序列，合成序列特异性的dsLvBip；(2)稀释dsLvBip，控制注射体积为50μL，按1μg/g对虾的剂量向凡纳滨对虾注射dsLvBip。本发明的方法能够简便、快捷、高效、特异性地诱发凡纳滨对虾血淋巴细胞发生非折叠蛋白反应。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学RNA干扰技术与运用领域，具体涉及利用RNA干扰技术对凡纳滨对虾Bip基因敲降诱发血淋巴细胞发生UPR的方法。

背景技术

海洋无脊椎动物对虾属中的对虾(Litopenaeus vannamei)是我国水产养殖的重要种类。2013年，全球养殖对虾产量达330万吨，其中，我国养殖对虾产量为130万吨，为世界对虾养殖第一大国。我国主要养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeusmonodon)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)和日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)4种对虾，其中凡纳滨对虾是主要养殖种类，在全国沿海11个省市均有养殖，约占养殖对虾总产量90％。

随着养殖规模的不断扩大及养殖环境的恶化，对虾病害严重，给对虾养殖业造成严重损失。其中以对虾白斑综合症(white spot syndrome,WSS)和肝胰腺坏死病(hepatopancreaticnecrosis syndrome,HPNS)等所引起的损失尤为严重。如1993～1995年间，我国90％对虾养殖池塘发生了WSS，导致我国养殖对虾由1992年的22万吨下降到1994年的5.3万吨，年直接经济损失超过30亿元。。肝胰腺坏死病则是最近几年来新出现的危害全球对虾养殖业的病害，2013年这两种虾病的暴发使整个东南亚的养殖对虾产量下降40％左右。

凡纳滨对虾病害发生的直接原因为病原体感染，如WSSV或副溶血弧菌的感染，然而种种迹象表明环境胁迫在这些疾病的暴发过程中扮演重要的角色。WSS在春夏、夏秋之交这些气候环境变化较大的时期容易暴发。天气闷热、寒潮、连续阴天、暴雨、池中浮游藻类死亡和水质变化等均可诱发WSS的暴发。天气剧烈变化、水质富营养化情况下对虾免疫力下降和虾塘水体中条件性致病细菌的迅速增殖则被认为是导致对虾偷死病暴发的原因之一。

水体各种理化因子(包括病原生物的种类和数量)的急剧变化对对虾而言是种胁迫，称为环境胁迫。环境胁迫影响到对虾的免疫系统功能，而其分子机制仍不得而知。已知环境胁迫会干扰真核生物细胞内的蛋白质折叠过程，造成未折叠的蛋白或错误折叠的蛋白大量滞留于内质网腔内，形成内质网应激[(endoplasmic reticulum stress,ER)-stress]，影响真核细胞的正常的生理过程。为缓解ER-stress，真核细胞会活化UPR、内质网介导的蛋白质降解(ER-associated degradation,ERAD)通路和钙离子通路。UPR在这一系列反应中处于核心地位。UPR包含IRE1-XBP1通路、PERK-eIF2α通路及ATF6通路这3条支路。目前对虾中UPR三条支路的多个关键基因与环境胁迫间的关系已得到研究，结果表明UPR在对虾环境胁迫响应方面有重要功能，故其应当在凡纳滨对虾中环境胁迫响应调控免疫系统功能方面扮演重要角色。进行凡纳滨对虾UPR与免疫系统关系、UPR与病毒感染的关系、UPR与细胞周期调控的关系及UPR与物质代谢的关系等方面的研究需要有效、快捷的凡纳滨对虾细胞UPR诱导方法，然而，至今仍未发现能在凡纳滨对虾中特异性激活UPR的方法。

发明内容

本发明的目的提供一种利用RNA干扰技术，高效、特异性地诱发凡纳滨对虾血淋巴细胞发生UPR(非折叠蛋白反应)的方法。

为实现以上目的，本发明提供了如下技术方案：

一种利用RNA干扰技术诱导凡纳滨对虾血淋巴细胞发生UPR(非折叠蛋白反应)的方法，其包括如下步骤：

(1)根据凡纳滨对虾Bip基因的cDNA序列，合成序列特异性的dsLvBip；

(2)稀释dsLvBip，控制注射体积为50μL，按1μg/g对虾的剂量向凡纳滨对虾注射dsLvBip。

注射入凡纳滨对虾体内的dsLvBip诱发RNAi效应，从而特异性地降低凡纳滨对虾Bip的表达量，解除UPR的抑制状态，而诱发血淋巴细胞产生UPR，即XBP1前体mRNA发生切割，eIF2α磷酸化程度增强。

优选地，所述步骤(1)包括：设计合成针对dsLvBip的正向ssRNA和反向ssRNA模板的引物；通过PCR反应合成dsLvBip的正向ssRNA和反向ssRNA，然后经变性、退火形成dsLvBip。

dsLvBip的合成过程如下：设计两对分别在正向引物或反向引物中加入T7启动子序列(5’GGATCCTAATACGACTCACTATAGG3’)的特异性引物，以凡纳滨对虾cDNA为模板扩增两份分别在5’端或是3’端带有T7启动子的的长度为507bp的DNA序列作为RNA合成模板。将这两个模板分别体外反转录成正向ssRNA和反向ssRNA(T7 RiboMAX Express RNAiSystem,Promega,USA；Cat.P1700)，合成的ssRNA和反向ssRNA加入到同一管子中，经高温变性、退火形成dsLvBip。

其中，所述步骤(1)中，设计合成ssRNA和反向ssRNA的模板的两对引物为：

DsRNA-LvBip-482-T7-F1：

GATCCTAATACGACTCACTATAGGTGTCGGTGGTTCCACTCGTA

DsRNA-LvBip-482-R1：CCTTGTTTCCTGTGCCCTTG

DsRNA-LvBip-482-F2：TGTCGGTGGTTCCACTCGTA

DsRNA-LvBip-482-T7-R2：

GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCCTTGTTTCCTGTGCCCTTG

其中，所述步骤(1)中，PCR反应体系加样参数为：正反引物各1μL，浓度为10pM，10Mm dNTP1μL，10×PCR缓冲液5μL，LA Taq酶1μL，凡纳滨对虾cDNA模板100ng，以超纯水补足至50μL。

其中，所述步骤(1)中，PCR的运行程序参数为：94℃预变性3分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒；重复循环35次。由此，ssRNA(D sRNA-LvBip-482-T7-F1/DsRNA-LvBip-482-R1)和反向ssRNA(DsRNA-LvBip-482-F2/DsRNA-LvBip-482-T7-R2)的模板分别合成。

其中，所述步骤(1)中，正向ssRNA和反向ssRNA(T7 RiboMAX Express RNAi System)合成反应体系(20μL)为：Express T72×buffer10μL，Express T7 Enzyme Mix2μL，DNA模板1μg，RNase free水补足总体积至20μL，37℃反应4小时。

其中，所述步骤(1)中，将正向ssRNA和反向ssRNA混合，70℃水浴10分钟，退火形成dsLvBip。将dsLvBip产物用RNAase A solution及RNase free DNase37℃水浴30分钟，除去反应后多余的DNA和ssRNA。将上述dsRNA产物纯化，即加入4.4μL3M醋酸钠(pH5.2)，110μL无水乙醇，冰上静置5分钟后，16000g室温离心10分钟，所得沉淀即为dsLvBip，最终用100μL DEPC水溶解，电泳检测并测OD值后，放置-20℃保存。

优选地，所述步骤(2)中，测量凡纳滨对虾的平均体重，稀释合成的dsLvBip，控制注射体积为50μL，最终以1μg/g对虾的剂量于凡纳滨对虾第二腹节处刺入向血窦方向注射。

注射dsLvBip后对RNA干扰效果进行检测：在dsRNA注射48～72小时后，分别提取注射PBS、dsGFP和dsLvBip的凡纳滨对虾的血淋巴细胞的总RNA，逆转录为cDNA。在模板量一致的前提下，通过RT-PCR的方法扩增LvBip，并在1％的琼脂糖凝胶上检测对比3组样品之间测Bip条带的亮度，进而确定注射dsLvBip对凡纳滨对虾血淋巴细胞中的Bip的RNAi效果。

通过两种方法确定敲降Bip之后凡纳滨对虾UPR状态：(1)通过RT-PCR技术，检测XBP1前体mRNA的检测情况，若XBP1前体mRNA发生剪切，则说明样品发生UPR。(2)通过western-blot技术检测eIF2α的磷酸化状态，如果其发生磷酸化修饰则说明样品发生UPR。

经检测，本发明的方法能够有效地诱导凡纳滨对虾血淋巴细胞发生非折叠蛋白反应。

本发明具有以下优点：

(1)本发明可简便、快捷、高效、特异性地诱发凡纳滨对虾血淋巴细胞产生UPR，所获得的效果对后续的其他相关研究，如凡纳滨对虾UPR对免疫系统的调控研究提供了基础。

(2)本发明的核心是利用RNA干扰(RNAi)技术，特异性地降低凡纳滨对虾Bip基因的表达量，继而解除其细胞中的UPR的抑制，而使得UPR被激活。可在注射dsLvBip后的48小时至72小时的时间范围内，于凡纳滨对虾血淋巴细胞中持续诱发UPR。

(3)本发明的方法可有效应用于凡纳滨对虾的环境胁迫响应研究，为其研究提供合适的动物模型，也用于辅助UPR与免疫系统关系、UPR与病毒感染的关系、UPR与细胞周期调控的关系及UPR与物质代谢的关系等方面的研究。

附图说明

图1：注射LvBip48小时和72小时之后凡纳滨对虾血淋巴细胞中Bip基因的敲降效果。PBS组，dsGFP组为对照，每个样品3个平行，EF1-α为内参。

图2：注射LvBip后凡纳滨对虾血淋巴细胞中XBP1基因前体mRNA的剪切效果。dsGFP组为对照，EF1α为内参；以为注射dsLvBip的样品利用LvXBP1引物进行扩增，出现两条条带即说明凡纳滨对虾XBP1的前体mRNA发生了剪切。从图中可以看到，在注射dsLvBip后的24小时XBP1的前体mRNA即开始发生剪切，持续到注射后96小时，说明此期间UPR被激活。

图3：注射LvBip后凡纳滨对虾血淋巴细胞中eIF2α的磷酸化水平变化。从图中可以看到注射dsLvBip后的48小时或72小时eIF2α的磷酸化水平增强，说明UPR被激活。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式和技术方案作进一步的详述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

首先设计合成针对dsLvBip的正向ssRNA和反向ssRNA模板的引物，通过PCR反应合成dsLvBip的ssRNA和反向ssRNA，然后经变性、退火形成dsLvBip。以1μg/g体重的剂量于凡纳滨对虾第二腹节处注射dsLvBip。注射后的48～72小时取凡纳滨对虾血淋巴细胞样品提取总RNA,逆转录为cDNA，再检测凡纳冰对虾血淋巴细胞总Bip基因(GenBank underaccession No.JQ265942)干扰效果和UPR激活效果。

设计合成ssRNA和反向ssRNA的模板的两对引物：

DsRNA-LvBip-482-T7-F1:

GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTGTCGGTGGTTCCACTCGTA

DsRNA-LvBip-482-R1:CCTTGTTTCCTGTGCCCTTG

DsRNA-LvBip-482-F2:TGTCGGTGGTTCCACTCGTA

DsRNA-LvBip-482-T7-R2:

GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCCTTGTTTCCTGTGCCCTTG

50μL PCR反应体系加样参数:正反引物各1μL(10pM)，10Mm dNTP1μL，10×PCR buffer5μL，LA Taq酶1μL，凡纳滨对虾cDNA模板100ng，以超纯水补足至50μL。PCR运行程序参数：94℃预变性3分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒；重复循环35次。ssRNA(DsRNA-LvBip-482-T7-F1/DsRNA-LvBip-482-R1)和反向ssRNA(DsRNA-LvBip-482-F2/DsRNA-LvBip-482-T7-R2)的模板分别合成。

SsRNA和反向ssRNA合成反应体系(20μL)为：Express T7 2×buffer 10μL，Express T7Enzyme Mix2μL，DNA模板1μg，RNase free水补足总体积至20μL，37℃反应4小时。

将正向ssRNA和反向ssRNA产物各20μL混合，70℃水浴10分钟，退火形成dsLvBip。于dsLvBip产物加入1μL RNAase A solution(1:200稀释)及RNase free DNase37℃水浴30分钟。将上述dsRNA产物纯化，即加入4.4μL3M醋酸钠(pH5.2)，110μL无水乙醇，冰上静置5分钟后，16000g室温离心10分钟，所得沉淀即为dsLvBip，最终用100μL DEPC水溶解，电泳检测并测OD值后，放置-20℃保存。

DsGFP以同样的方法合成，模板为水母绿色荧光蛋白基因，合成正向ssRNA和反向ssRNA的模板的引物为：

DsRNA-eGFP504-F：

GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCGACGTAAACGGCCACAAGTT

DsRNA-eGFP504-R1：ATGGGGGTGTTCTGCTGGTAG

DsRNA-eGFP504-F2：CGACGTAAACGGCCACAAGTT

DsRNA-eGFP504-R：

GGATCCTAATACGACTCACTATAGGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAG

随机取15条凡纳滨对虾测量实验的凡纳滨对虾的平均体重；然后以1μg/g对虾的注射剂量为标准，根据虾的体重适当的稀释合成的dsLvBip，使注射体积为50μL。于凡纳滨对虾第二腹节处刺入向血窦方向注射。

在dsRNA注射的不同时段分别提取注射PBS、dsGFP和dsLvBip的凡纳滨对虾的血淋巴细胞的总RNA，以等量的总RNA逆转录为cDNA。总RNA提取采用Rneasy Plus Mini Kit(QIAGEN,Germany；Cat.No.74136)，RNA逆转录采用PrimeScript II 1st Strand cDNA SynthesisKit(大连宝生物，Cat.No.D6210A),操作过程按照产品说明书进行。

各取100ng的cDNA为模板，通过RT-PCR的方法扩增LvBip,反应体系和PCR程序如下：50μL PCR反应体系加样参数:正反引物(SQ-LvBip-661-F:AGCCACCAGGTCAGGATTGA；SQ-LvBip-661-R：CCTTGTTTCCTGTGCCCTTG)各1μL(10pM)，10Mm dNTP 1μL，10×PCR buffer5μL，LA Taq酶1μL，凡纳滨对虾cDNA模板100ng，以超纯水补足至50μL。PCR运行程序参数：94℃预变性3分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒；重复循环32次。PCR产物于1％的琼脂糖凝胶上电泳，对比3组样品之间测Bip条带的亮度，检测凡纳滨对虾血淋巴细胞中的Bip的RNAi效果(如图1所示)。

通过两种方法确定敲降Bip之后凡纳滨对虾UPR状态，

(1)凡纳滨对虾XBP1前体mRNA剪切情况检测。检测引物、PCR参数及程序如下：

检测引物：

LvXBPu/s-F：GCCATGAATATCGGCTGTAAC

LvXBPu/s-R：TGTTGAGAGAACCATGATCCG

50μL PCR反应体系加样参数:正反引物各1μL(10pM)，10Mm dNTP 1μL，10×PCR buffer5μL，LA Taq酶1μL，凡纳滨对虾cDNA模板100ng，以超纯水补足至50μL。PCR运行程序参数：94℃预变性3分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸20秒；重复循环36次。PCR产物于5％的琼脂糖凝胶上电泳，可检测到凡纳滨对虾血淋巴细胞中的XBP1前体mRNA在dsLvBip注射24小时后开始出现两条条带(如图2所示)。

(2)通过western-blot技术利用eIF2α磷酸化抗体(Phospho-eIF2a Antibody，CST，货号：9821)检测eIF2α的磷酸化状态，如果其磷酸化修饰增强则说明样品发生UPR。

凡纳滨对虾eIF2α的磷酸化状态检测。1mL的一次性注射器吸取300μL预冷的抗凝剂(10mmol/LEDTA,450mmol/LNaCl,10mmol/LKCl,10mmol/LHEPES,pH7.3)，然后插入对虾血窦吸取血淋巴；5条凡纳滨对虾的血淋巴集于1管中，4℃1000rpm离心5分钟收集血淋巴细胞，去除上清；以预冷PBS重悬细胞，再离心收集细胞，重复3次。之后加入200μL含磷酸酶抑制剂的预冷NP-40裂解液冰上裂解细胞10分钟。之后，离心取上清，加入50μL5×的蛋白质电泳上样缓冲液，沸水浴5分钟，然后-20℃保存备用。对照样品同样处理。

实验样品和对照样品各取20μL的样品进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度12％；湿法转膜(纤维素膜)条件为180mA，3小时。

将转好的纤维素膜置于含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液(每升TBST含Tris base 2.422g,Nacl8.775g，Tween200.5mL)封闭2小时；然后加入以含0.1％Tween2、3％BSA的TBST以1:1000稀释的eIF2α磷酸化抗体，于4℃轻柔摇动孵育过夜；之后用TBST洗涤膜3次，每次5分钟；加入含3％BSA TBST的以1:10000稀释的HRP偶联二抗，室温轻柔摇动孵育2小时；之后用TBST洗涤膜3次，每次15分钟；然后化学发光法显色观察结果(如图3所示)。如图所示，在dsLvBip组中，磷酸化修饰增强，说明样品发生UPR。