基于微通道萃取的生物膜反应器及其在丁醇发酵中的应用

摘要

本发明提供了一种基于微通道萃取的生物膜反应器，包括中空纤维膜 (A)、微通道萃取器（B）、补料罐（C）、分层罐（D）、萃取剂储罐（E）及发酵罐（F），所述补料罐与发酵罐相连，所述中空纤维膜的进料口和出料口与发酵罐相连，该中空纤维膜的另一出料口与微通道萃取器的进料口相连，所述微通道萃取器的另一进料口上连接有萃取剂储罐，该微通道萃取器的出料口处连接有分层罐，所述分层罐上部和下部分别与萃取剂储罐和发酵罐通过软管相连。本发明还涉及上述基于微通道萃取的生物膜反应器在丁醇发酵中的应用，以提高丁醇发酵的效率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于微通道萃取的生物膜反应器及其在丁醇发酵中的应用，具体包括一种基于微通道萃取的生物膜反应器的搭建及其在生物丁醇发酵中的应用，属于生物化工技术领域。

背景技术

生物法制备化学品具有低能耗、安全环保、可持续发展等优点，近年来，生物法制备化学品已成为许多国家提高能源安全、减少排温室气体、应对气候变化的重要措施。生物法制备化学品往往是在微生物细胞代谢网络中的酶的催化下，最终将底物转化为目的产物。生物发酵法的瓶颈技术在于大多生物细胞内的酶存在被产物抑制或者产物直接抑制细胞生长的现象，当产物达到一定浓度后将会抑制细胞的代谢和生长，大大降低生物反应的速率，使得产物的浓度不高，增加分离成本，这些缺点严重地阻碍了生物发酵产业的发展。常用的生物分离方法有萃取、吸附、离子交换等，其中萃取因分离成本低，能耗低等优点被广泛地应用。虽然传统的萃取分离技术在化学反应液的分离方面取得了非常好的分离效果，然而，存在着萃取剂的生物兼容性差、在发酵体系中传质效率差等缺点，因而无法将目的产物迅速地从发酵液中分离。目前报道的能与生物丁醇发酵过程耦合的分离方法并不多，有原位萃取分离，渗透气化膜分离，气提法分离，树脂吸附分离。白凤武等人利用气提法对Clostridium acetobutylicum JB200 发酵液中的溶剂进行分离浓缩，最终获得了172g/L的总溶剂，其中丁醇、丙酮、乙醇分别为113.3g/L、49.2g/L、9.2g/L，其中发酵液中的丁醇在7~15 g/L，总溶剂生产强度为0.53 g/(L·h)（Biotechnology and Bioengineering，2012,109（11）: 2746-2756）。吴昊等人利用PDMS渗透气化膜对丁醇发酵液中的溶剂进行选择性分离，将61%的溶剂移除，最终获得的ABE的总浓度为96.2 g/L, 总溶剂生产强度为0.30 g/(L·h)（Bioprocess and Biosystems Engineering，2012，35(7): 1057-1065）。Hong wei Ye等人利用生物柴油对发酵液中的丁醇进行萃取，通过补料发酵，最终丁醇的浓度达到了31.44 g/L，丁醇的分配系数在1~2之间，同时水相中的丁醇浓度也达到了12 g/L以上，迫使细胞进入衰亡期，发酵停止。渗透气化膜分离和气提法分离效果较好，获得的浓度较高，但过程能耗高，严重影响生物丁醇的经济性。原位萃取中生物兼容性的萃取剂存在分配系数不高、传质效率低等缺点，进而使得萃取分离的效率低下。

目前已有相关文献报道将生物兼容性较好的生物柴油、油醇等作为萃取剂，对丁醇发酵过程进行原位萃取，以解除丁醇抑制，提高生产强度，但由于生物柴油和油醇固有的高粘度特性，降低两相之间的传质，如进行剧烈搅拌，则发酵液中的细胞会与生物柴油或者油醇充分接触，将细胞黏附在两相界面之间，严重抑制细胞的生长和代谢以及两相间传质。江南大学的牛晓乐利用油醇原位萃取单批发酵中丁醇，总溶剂的生产强度较单批发酵提高了24.5%，安徽农业科学，2008 (26),11188-11189。Sandip B. Bankar等报道了一种将固定化细胞发酵与油醇原位萃取耦合的方法，利用该方法在连续发酵中总溶剂的生产强度达到了2.5 g/(L·h)（Bioresource Technology, 106(2012): 110-116）。因此，将避免细胞与萃取剂直接接触能够明显的提高生物丁醇的生产强度。

本发明提供了一种基于微通道萃取的生物膜反应器的构建方法，一方面利用生物膜反应器将微生物细胞截留在反应器内部，防止细胞与萃取剂直接接触，避免对细胞造成伤害，另一方面结合微通道萃取器来强化两相之间的传质，以达到迅速移除发酵液中抑制物，提高生物发酵过程的效率。发明人将上述基于微通道萃取的生物膜反应器应用于生物丁醇发酵，大幅提高了总溶剂的生产强度，为生物丁醇的高效生产提供了过程工程借鉴。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：生物发酵法存在产物抑制的现象，当产物达到一定浓度后将会抑制细胞的代谢和生长，大大降低生物反应的速率，使得产物的浓度不高，增加分离成本，这些缺点严重地阻碍了生物发酵产业的发展。本发明提供了一种基于微通道萃取的生物膜反应器的构建方法及其在生物丁醇发酵中的应用，以提高生物发酵的效率。

本发明的技术方案如下：

一种基于微通道萃取的生物膜反应器，包括中空纤维膜 A、微通道萃取器B、补料罐C、分层罐D、萃取剂储罐E及发酵罐F，所述补料罐与发酵罐相连，所述中空纤维膜的进料口和出料口与发酵罐相连，该中空纤维膜的另一出料口与微通道萃取器的进料口相连，所述微通道萃取器的另一进料口上连接有萃取剂储罐，该微通道萃取器的出料口处连接有分层罐，所述分层罐上部和下部分别与萃取剂储罐和发酵罐通过软管相连。

其中，所述中空纤维膜的膜孔小于0.22μm，可装液量为500 mL，目的在于将细胞截留在膜组件中，防止细胞与萃取剂接触，影响细胞的活性。

所述的微通道萃取器的几何结构是一种复杂的坡状结构，流体在流动过程中不断上升和下降，从而实现流体的多次分离及重新组合，实现充分混合，完成萃取过程。在这种混合器中流体的分割以及重组之间无需附加流体连接通道，因此，在给定压降条件下，这种微混合器可以获得很高的通量，而且这样的结构也有利于混合器的维护和清洗。

所述的补料罐、分层罐、发酵罐和萃取剂储罐均可高温灭菌，并且带密闭盖子。

所述微通道萃取器的两个出料口处均连接有高精度柱塞泵，所述的高精度柱塞泵为色谱用柱塞泵，双柱塞串联模式输液，流量精度：±1%，流量重复性：RSD≤0.5%，流量范围： 0-50 ml/min，最大压力：0-300 bar。

本发明所述的发酵罐带有PH电极和温度电极，可进行精准的PH，温度控制。

本发明所述的连接管路是通过高温蒸汽灭菌的耐磨硅胶管。

一种利用上述基于微通道萃取的生物膜反应器来实现生物丁醇高效制备的方法，具体包括：

1. 培养基的配置：

种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，其余为水，pH 6。

发酵培养基：乙酸铵 0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，七水合硫酸镁0.02%，一水合硫酸锰 0.001%，七水合硫酸亚铁0.001%，氯化钠0.001%，玉米浆0.1%，葡萄糖 6%，其余为水，pH 6.0。

发酵培养基应在121℃下灭菌15分钟，糖类和氮源类应分开灭菌，以免发生米拉德反应，损失培养基中的营养物质。

2. 菌株的培养

将产丁醇梭菌Clostridium beijerinckii 8052 按5%（v/v）的接种量接种于装有50 mL种子培养基的厌氧瓶中，通无菌氮气1~2分钟，37℃厌氧培养12小时后按5%（v/v）转接至装有200 mL种子培养液的厌氧瓶中进行二次活化，通氮气1~2分钟，37℃厌氧培养8小时后作为种子液。将2 L的发酵培养基加入到发酵罐F中，121℃，15分钟高温蒸汽灭菌，接入冷却水冷却到室温。将二次活化的种子液按10%（v/v）和葡萄糖接入发酵罐中。在关闭2号柱塞泵的前提下，运行1号泵，使得发酵液在中空纤维膜膜管和发酵罐之间循环。

3. 反应器的灭菌及连接

中空纤维膜组件、微通道萃取器、高精度柱塞泵以及附属管路均用75%的酒精灭菌1小时，然后移除酒精。其余管路和储罐均采用高温蒸汽灭菌的方式来达到无菌效果。灭完菌的各组件在无菌条件下完成连接。

4. 原位萃取分离

当发酵液中的发酵产物开始积累时，打开高精度柱塞泵2和3，将发酵液和萃取剂同时泵入微通道萃取器，在微通道萃取器中两股流体被分割成若干微米级的细流，并充分混合，迅速完成萃取后流出微通道萃取器，在分层罐D中完成分层。当形成一定的缓冲体系后，将4号蠕动泵的流量调至与2号柱塞泵一致，将分层罐中的水相泵入发酵罐充分利用其中的营养元素，包括氮源、碳源等。将5号蠕动泵的流量调至与3号柱塞泵一致，将分层罐中的有机相泵入萃取剂储罐中重复利用。当发酵罐中产物即将达到抑制浓度时，更换萃取剂储罐中的萃取剂。当发酵罐中的营养物质不足时，可更换发酵培养基。

本发明的有效增益效果在于：

将微通道萃取分离技术与生物发酵过程耦合并结合了生物膜反应器，利用生物膜反应器将微生物细胞截留在反应器内部，避免了微生物细胞与大量有机溶剂直接接触，避免对细胞造成伤害，通过微通道萃取器强化萃取过程的传质效率，将产物迅速的移出发酵液，从而解除产物抑制。该方法可有效解除产物抑制，可增强生物发酵过程的效率。

附图说明

图1 为微通道萃取耦合生物膜反应器结构示意图。

其中：A为中空纤维膜，B为微通道萃取器，C为补料罐，D为分层罐，E为萃取剂储罐，F为发酵罐，1、4、5、6为普通蠕动泵，2、3为高精度柱塞泵，7为PH电极，8为温度电极。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

   本实施例说明微通道萃取器生物膜反应器的组成和工作流程。

基于微通道萃取的生物膜反应器由中空纤维膜、微通道萃取器、补料罐、分层罐、萃取剂储罐和发酵罐组成。发酵罐和中空纤维膜之间用硅胶管连接，并使用蠕动泵将发酵罐中的料液泵入中空纤维膜，最后从上端出口流回发酵罐中。中空纤维膜的渗透液出料口（细胞被中空纤维膜截留）与微通道萃取器进料口连接，萃取剂储罐与微通道萃取器另一进料口连接，两进料口在高精度柱塞泵的控制下完成精准进料，并在为萃取器内部进行充分混合。微通道萃取器的出料口与分层罐相连。萃取剂储罐与分层罐之间用硅胶管连接，并用硅胶管连接，将分层后的有机溶剂泵回萃取剂储罐。分层罐与发酵罐之间用硅胶管连接，并用蠕动泵将分层后的发酵液泵回发酵罐中继续利用其中的营养物质。补料罐与发酵罐之间用硅胶管连接，并使用蠕动泵进行补料。

微通道萃取内部及其附属管路和中空纤维膜组件采用75%酒精浸泡1h的灭菌方式达到无菌效果。用于连接各组件的硅胶管、发酵罐、萃取剂储罐、分层罐、补料罐采用121℃，15分钟高温蒸汽灭菌。各组件在无菌条件下进行连接。萃取剂经过滤除菌后方可加入至萃取剂储罐中。

   当发酵进入产物抑制时期，打开精密柱塞泵将发酵液与萃取剂同时泵入微通道萃取剂，两股料液在微通道萃取剂内部被分割成微米级细流并充分混合，完成萃取后在微通道萃取器出口流入分层罐后分层。当达到一定缓冲体积后，打开蠕动泵，分别将上层有机相萃取剂与下层水相发酵液泵回萃取剂储罐和发酵罐。该过程需将蠕动泵流速调控至与精密柱塞泵流速一致。由于分配系数的纯在，水相中的抑制物达到抑制浓度时，将萃取剂储罐中的萃取剂移出，加入新萃取剂。

实施例2

本实施例说明微通道连续萃取生物反应器在生物丁醇发酵中的应用。

具体操作步骤如下：

本实例中使用的菌株为Clostridium beijerinckii 8052，萃取剂为生物柴油，微通道萃取器两相进料流速比为1:1，萃取剂用量为2L。

菌种培养：

将产丁醇梭菌Clostridium beijerinckii 8052 按5%（v/v）的接种量接种于装有50 mL种子培养基的厌氧瓶中，通无菌氮气1~2分钟，37℃厌氧培养12小时后转接至装有200 mL种子培养液的厌氧瓶中进行二次活化，通氮气1~2分钟，37℃厌氧培养8小时（菌株进入对数期）。将活化好的二级种子按10%（v/v）的接种量接入装有1.6发酵培养基的发酵罐F中，补加200 mL 600 g/L的葡萄糖作为碳源，打开1号蠕动泵于发酵罐中37℃，200 rpm开始发酵。

当发酵进行到8小时，丁醇开始积累时，此时打开高精度柱塞泵2和3，将发酵液和生物柴油分别以10 mL/min 和10 mL/min的流速同时泵入微通道萃取器，在微通道萃取器中两股流体被分割成若干微米级的细流，并充分混合，迅速完成萃取后流出微通道萃取器，在分层罐D中完成分层。同时向发酵罐中通入无菌氮气，保证装置中的压力恒定及厌氧环境。当萃取分离开始60分钟后分层罐中开始形成明显的两相溶液，此时将4号蠕动泵的流量调至与2号柱塞泵一致（10 mL/min），将分层罐中的水相发酵液泵入发酵罐充分利用其中的营养元素。同时将5号蠕动泵的流量调至与3号柱塞泵一致（10 mL/min），将分层罐中的有机相泵入萃取剂储罐中重复利用。

该发酵原位分离与发酵耦合装置运行30小时后，葡萄糖被耗尽，发酵停止。平均耗糖速率达到2.0 g/(L·h)，最终水相和有机相中的溶剂如表1所示。本发明通过运用微通道萃取技术迅速将发酵液中的丁醇移出发酵液，解除丁醇抑制作用，同时通过生物膜反应器将发酵与萃取分开，避免了萃取剂与微生物大面积接触，造成细胞损害。在本实验室中利用Clostridium beijerinckii 8052进行未分离耦合的单批发酵，40小时内消耗31 g/L葡萄糖，总溶剂只能达到10.5 g/L，总溶剂的生产强度只有0.26 g/(L·h)，总溶剂得率为0.34 g/g。与未耦合单批发酵相比，在微通道萃取分离耦合单批发酵中，总溶剂产量达到23.71g/L，总溶剂的生产强度提高到了0.79 g/(L·h)，分别是未耦合单批发酵的2.3倍和3倍，总溶剂得率也有一定的提高。

表1 微通道萃取分离耦合丁醇发酵实验结果

实施例3

本实施例说明微通道连续萃取生物反应器在发酵法制备丁醇中的应用。

具体操作步骤如下：

本实例中使用的菌株为Clostridium beijerinckii 8052，萃取剂为生物柴油。微通道萃取器进料流速比为1:2，萃取剂用量为2L。

菌种培养：将产丁醇梭菌Clostridium beijerinckii 8052 按5%（v/v）的接种量接种于装有50mL种子培养基的厌氧瓶中，通无菌氮气1~2分钟，37℃厌氧培养12小时后转接至装有200mL种子培养液的厌氧瓶中进行二次活化，通氮气1~2分钟，37℃厌氧培养8小时（菌株进入对数期）。将活化好的二级种子按10%（v/v）的接种量接入装有1.6发酵培养基的发酵罐F中, 补加200 mL 600 g/L的葡萄糖作为碳源，打开1号蠕动泵于发酵罐中37℃，200 rpm开始发酵。

当发酵进行到8小时，丁醇开始积累时，此时打开高精度柱塞泵2和3，将发酵液和生物柴油以10 mL/min 和20 mL/min的流速同时泵入微通道萃取器，在微通道萃取器中两股流体被分割成若干微米级的细流，并充分混合，迅速完成萃取后流出微通道萃取器，在分层罐D中完成分层。同时向发酵罐中通入无菌氮气，保证装置中的压力恒定及厌氧环境。当萃取分离开始30分钟后分层罐中开始形成明显的两相溶液，此时将4号蠕动泵的流量调至与2号柱塞泵一致（10 mL/min），将分层罐中的水相发酵液泵入发酵罐充分利用其中的营养元素。同时将5号蠕动泵的流量调至与3号柱塞泵一致（20 mL/min），将分层罐中的有机相泵入萃取剂储罐中重复利用。

该发酵原位分离与发酵耦合装置运行24小时后，葡萄糖被耗尽，发酵停止。平均耗糖速率达到2.5 g/(L·h)，最终水相和有机相中的溶剂如表2所示。本发明通过运用微通道萃取技术迅速将发酵液中的丁醇移出发酵液，解除丁醇抑制作用，同时通过生物膜反应器将发酵与萃取分开，避免了萃取剂与微生物大面积接触，造成细胞损害。在本实验室中利用Clostridium beijerinckii 8052进行未分离耦合的单批发酵，40小时内消耗31 g/L葡萄糖，总溶剂只能达到10.5 g/L，总溶剂的生产强度只有0.26 g/(L·h)，总溶剂得率为0.34 g/g。与未耦合单批发酵相比，在微通道萃取分离耦合单批发酵中，总溶剂产量达到23.89 g/L，总溶剂的生产强度提高到了0.99 g/(L·h)，分别是未耦合单批发酵的2.4倍和3.8倍，总溶剂得率也从0.34 g/g提高至0.39 g/g。

表2 微通道萃取分离耦合丁醇发酵实验结果

实施例4

本实施例说明微通道连续萃取生物反应器在生物丁醇发酵中的应用。

具体操作步骤如下：

本实例中使用的菌株为Clostridium beijerinckii 8052，萃取剂为生物柴油。

微通道萃取器进料流速比为1:3，萃取剂用量为2L。

菌种培养：

将产丁醇梭菌Clostridium beijerinckii 8052 按5%（v/v）的接种量接种于装有50mL种子培养基的厌氧瓶中，通无菌氮气2分钟，37℃厌氧培养12小时后转接至装有200mL种子培养液的厌氧瓶中进行二次活化，通氮气2分钟，37℃厌氧培养8小时（菌株进入对数期）。将活化好的二级种子按10%（v/v）的接种量接入装有1.6发酵培养基的发酵罐F中, 补加200 mL 600 g/L的葡萄糖作为碳源，打开1号蠕动泵于发酵罐中37℃，200 rpm开始发酵。

当发酵进行到8小时，丁醇开始积累时，此时打开高精度柱塞泵2和3，将发酵液和生物柴油以10 mL/min 和30 mL/min的流速同时泵入微通道萃取器，在微通道萃取器中两股流体被分割成若干微米级的细流，并充分混合，迅速完成萃取后流出微通道萃取器，在分层罐D中完成分层。同时向发酵罐中通入无菌氮气，保证装置中的压力恒定及厌氧环境。当萃取分离开始10分钟后分层罐中开始形成明显的两相溶液，此时将4号蠕动泵的流量调至与2号柱塞泵一致（10 mL/min），将分层罐中的水相发酵液泵入发酵罐充分利用其中的营养元素。同时将5号蠕动泵的流量调至与3号柱塞泵一致（30 mL/min），将分层罐中的有机相泵入萃取剂储罐中重复利用。

该发酵原位分离与发酵耦合装置运行16小时后，葡萄糖被耗尽，发酵停止。平均耗糖速率达到3.75 g/(L·h)，最终水相和有机相中的溶剂如表3所示。本发明通过运用微通道萃取技术迅速将发酵液中的丁醇移出发酵液，解除丁醇抑制作用，同时通过生物膜反应器将发酵与萃取分开，避免了萃取剂与微生物大面积接触，造成细胞损害。在本实验室中利用Clostridium beijerinckii 8052进行未分离耦合的单批发酵，40小时内消耗31 g/L葡萄糖，总溶剂只能达到10.5 g/L，总溶剂的生产强度只有0.26 g/(L·h)，总溶剂得率为0.34 g/g。与未耦合单批发酵相比，在微通道萃取分离耦合单批发酵中，总溶剂产量达到23.93 g/L，总溶剂的生产强度提高到了1.50 g/(L·h)，分别是未耦合单批发酵的2.4倍和5.8倍，总溶剂得率稳定在0.39 g/g。

表3 微通道萃取分离耦合丁醇发酵实验结果

因本发明中的所提供微通道萃取的生物膜反应器在生物发酵过程中具有一定的通用性，本领域的相关研究人员可以很容易的将此技术应用于其他发酵体系中，因而同样因属于本发明的范围。

综上所述，本发明中提供的微通道萃取的生物膜反应器能够很好的与生物丁醇发酵体系相耦合，通过调节不同比例的两相流速，可实现生物丁醇的高效制备。