一株肿瘤抑制基因p63单克隆抗体及其应用

摘要

本发明涉及一种肿瘤抑制基因p63的单克隆抗体及应用，目的是提供一种将该抗体用于多种肿瘤免疫学诊断的应用方法。p63是与细胞周期相关的蛋白，参与细胞增殖的调节，诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡，发挥肿瘤抑制作用。p63基因的某些异构体被认为是肿瘤抑制基因，另一些异构体则被认为是致癌基因。制备该抗体的抗原为一段优选的、由大肠杆菌表达、具有免疫原性活性的重组蛋白，最终获得的抗体属于IgG1亚型，编码其可变区的序列经基因克隆的方式获得，对尿路上皮癌、肌上皮癌、腺样囊性癌、鳞状细胞癌、肺腺癌、胰腺癌、前列腺癌等多种肿瘤组织的免疫组织化学检测发现，该抗体可以很好的鉴别肿瘤的发生，可以用于这些肿瘤的病理诊断。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肿瘤抑制基因p63单克隆抗体及其应用。具体而言，本发明提供了一种抗肿瘤细胞表面抗原p63分子的单克隆抗体，对该抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测细胞中p63的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法中，属于生物检测领域。

背景技术

p63分子在结构上与p53有高度同源性，具有三个相似的功能域：N端转录激活区、核心DNA结合区、C端寡聚体化区，其中寡聚体化区含特有的SAM结构是p53所不具有的。P63曾经被称为p51、KET、p40、p73L、CUSP等。基因定位于3号染色体3q27~3q29，全长包含有15个外显子和两个不同的启动子，而p53只有一个启动子。p63的两启动子中由上游1号内含子的启动子所引发mRNA的不同剪切，会产生3种p63异构体，称为TAp63，包括TAp63A、TAp63B和TAp63C，其功能类似p53，能够反式激活p53靶基因的转录并诱导细胞凋亡。而位于下游3号内含子的启动子所引发p63 mRNA，则是一类缺乏酸性N端反式激活区的截短异构体p63，称为△Np63，包括△Np63A、△Np63B和△Np63C，其丧失反式激活p53靶基因以及诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡的功能，即以显性失活的方式抑制TAp63和p53。研究证明，DNA损伤诱导的p53的凋亡途径需要p63和p73的参与。研究分析，p63在胚胎时期，多种上皮和器官发育需要p63蛋白，p63在肌上皮细胞中表达，且作用优于SMA，在肌纤维母细胞中不表达。

p63蛋白分子量为63kDa左右，选择不同的抗原进行免疫可能制备出不同结合特性的抗体，最终导致不同抗体对表达抗原细胞的识别能力和模式不同。鉴于p63分子在肿瘤病理研究中的重要性，已有不同的抗体制备用于不同免疫学方法。公开号为CN103196731A的发明专利“用于鉴别乳腺肌上皮病变的多重染色试剂及检测方法”即描述了一种将CK8/18、即用型钙调蛋白、即用型p63、肌动蛋白HHF-35等多种单克隆抗体组合使用，以免疫组化方式鉴别乳腺肌上皮病变。公开号为CN102924594的发明专利“抗肿瘤蛋白p63单克隆抗体及其用途” 中应用p63单克隆抗体为一抗，通过与九种细胞系的蛋白裂解液进行杂交、对前列腺癌组织进行免疫组化检测、OriGene蛋白芯片检测p63的特异性、Western blot验证蛋白芯片杂交等试验，结果显示该p63抗体能与p63蛋白特异性结合，且与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了p63蛋白免疫检测的特异性和可靠性。其所使用的p63单克隆抗体编号为2B10，根据p63基因的ORF全序列设计引物进行PCR扩增，在表达载体Pcmv6-Entry重组进行表达，以重组蛋白作为免疫原制备而来。目前在肿瘤诊断中使用最多的p63抗体为克隆号4A4抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性好，亲和力高的p63单克隆抗体及其应用，该抗体能特异结合p63重组抗原和天然抗原。提供一种将本抗体用于肿瘤组织切片免疫组织化学检测的应用。

解决技术问题所采用的技术手段

本发明对在普通和急性淋巴细胞白血病中淋巴细胞核表达的p63分子，按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达，为促进重组蛋白的可溶表达，改善其表达行为，且便于纯化，在重组蛋白的N端和C端分别融合有大肠杆菌果胶酶的PelB信号肽及组氨酸标签，经基因合成后克隆进表达质粒载体pET-30a-scfv中进行重组表达，分离纯化表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合、重组p63筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。

利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG1型单克隆抗体，亲和常数为1.92×10⁹。免疫印记（Western blotting）实验显示该抗体能特异识别重组的p63蛋白以及表达p63分子的肿瘤细胞。

具体地，本发明涉及以下几个方面：

1．  一种单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞系分泌。

2．  所述的单克隆抗体，其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列编码经由大肠杆菌重组表达而获得的重组p63抗原蛋白。

3．  获得杂交瘤细胞株所分泌抗体的重链和轻链可变区由SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的DNA序列所编码，更进一步，重链和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，该抗体为一种鼠源IgG1亚型单克隆抗体。

4．  所述的单克隆抗体，可识别重组蛋白和肿瘤细胞表面的p63分子。

5．  所述的单克隆抗体，用于免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法检测肿瘤及正常组织细胞中的p63表达情况。

6．所述的单克隆抗体，可独立或与其他抗体组合应用于肿瘤细胞制备物、肿瘤组织切片的免疫组织化学、免疫印迹或酶联免疫检测方法。

7．所述的单克隆抗体，在免疫组化病理诊断剂上的应用，可用于尿路上皮癌、肌上皮癌、腺样囊性癌、鳞状细胞癌、肺腺癌、胰腺癌、前列腺癌等多种肿瘤的病理诊断。

p63阳性细胞来源肿瘤主要为基底细胞癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌。

本发明的优点及有益效果

（1）    本发明获得的杂交瘤（60738-10D8）分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋白p63分子和表达p63的淋巴细胞，能够检测高表达p63蛋白的基底细胞癌、鳞状细胞癌、移行细胞癌等多种肿瘤组织。

（2）    本发明获得的杂交瘤（60738-10D8）为一种IgG1类抗体，与p63蛋白的结合有极强特异性和敏感性。

（3）    本发明获得的杂交瘤（60738-10D8）产生的单克隆抗体可应用于免疫组织化学（IHC）、免疫印记（Western blotting）、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛查，特异性和灵敏度高。在以目前普遍使用的商品化4A4细胞株的对比实验中，本发明细胞株制备的抗体在前列腺癌、乳腺癌的诊断中特异性同对照抗体相当，敏感性也同对照抗体相当，甚至在乳腺癌中稍高于对照抗体。因此，本发明的p63单克隆抗体具有更广的应用范围，可显著提高诊断的准确度。

附图说明

图1：重组p63抗原蛋白的表达与纯化

p63重组蛋白的电泳条件为：胶浓度12%，1为上清； 2为流穿；3为5mM咪唑洗脱1；4为5 mM咪唑洗脱2；5为15mM咪唑洗脱；6为60mM咪唑洗脱；7为500mM咪唑洗脱。上样量20μl。

图2：60738-10D8抗体的识别特性和实际应用效果

 应用纯化的60738-10D8单克隆抗体可以在免疫印迹杂交中特异地检出p63重组蛋白，p63重组蛋白上样10微升， His-Tag一抗1:2000稀释，二抗1:5000稀释，目标蛋白为27kDa。

图3：p63单克隆抗体的免疫组织化学检测结果

应用纯化的p63抗体同商品化抗体4A4在组织芯片上进行免疫组织化学检测，左为对照抗体4A4，右为纯化抗体p63。

具体实施方式

        下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。

实施例1 重组p63蛋白片段的制备

一、 基因克隆

p63单克隆按照Uniprot数据库中登录号为Q9H3D4的蛋白质序列及对应Genbank中NM_003722.4的核酸序列，合成633bp大小的基因。在基因5’和3’端分别加入HindIII和XhoI酶切位点。对合成的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体pET30a-scfv用HindIII和XhoI进行酶切，电泳回收，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21，挑取平板上的克隆接种，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。PCR显示融合蛋白基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆即采用。

二、  蛋白表达和纯化

按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100ml LB培养基，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6~0.8。加入0.1 mol/L的IPTG，25℃震荡培养8h，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化。用不同浓度的咪唑溶液进行洗脱后，将各组分和流穿分别上样进行SDS-PAGE分离检测，图1为融合有pelB信号肽和组氨酸标签的重组p63蛋白的表达和纯化结果。重组p63蛋白的纯度在90%以上，浓度约为1-1.5 mg/mL，可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。

实施例2 杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂（Sigma公司）乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂（Sigma公司）乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA（波长450nm）检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

       无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0（ATCC）以5:1比例混合，离心1500 rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500（Roche公司），并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM（Sigma公司），混匀，离心1000 rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清（PAA公司）小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT（Sigma公司）的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1%硝基纤维素（Sigma公司）的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃ 5%CO₂培养箱中培养。

三、挑克隆

       融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃ 5% CO₂培养箱中培养。

四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

       3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μl上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μl含饲养细胞和1%HT（Sigma公司）的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基（含饲养细胞和HT）的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

实施例3  腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数～5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000 rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

       用HiTrap rProtein A FF（GE公司）亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4 单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用100mM PBS（pH7.4）稀释包被羊抗鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）至0.5 μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05% Tween的PBS（PBS-T）洗3次，每孔加入200μl封闭液（含2%BSA和3%蔗糖的PBS），37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠（κ,λ）抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠（IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA）抗体（Southern Biotech公司）0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl 含0.15% ABTS（Southern Biotech公司）和0.03% H₂O₂的柠檬酸缓冲液（PH4.0）进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被重组p63蛋白，包被浓度为2μg/ml, 100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1% TMB（Sigma公司）和0.03% H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl 0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为2.47×10⁹。

亲和常数                                                

三、单抗反应特异性和应用效果

选择重组的p63蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，免疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样约5-10ng，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上（Millipore 公司）。将膜置于含5%脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体60541 S-4（1：1000稀释）4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液（北京普利莱基因技术有限公司），以ChemiDoc MP多色荧光成像系统（Bio-Rad）进行化学发光图像数据的采集。可见图片上出现单一条带，条带大小均一，说明本发明的单克隆抗体具有良好的特异性。

实施例4 抗体的可变区序列测定

     培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，要证实用于克隆的细胞株的确能分泌需要的抗体，证实完成后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。 Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，取9 μL总RNA, 加入2.5 μL oligo(dT)12–18 primer (10 mM), 及5 μL dNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5 μL RT buffer (5X), 2.5 μL DTT (0.1 M) 及 1 μL逆转录酶，42℃反应1小时。 70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA 保存在-20℃。. 将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50 μL反应体系中加入引物各25 pmol，引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》（科学出版社，2005年出版）一书中鼠单抗引物序列设计和合成。其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板加入1μL和1U热启动Taq DNA聚合酶。设置PCR扩增程序，通常为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25个循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μL PCR产物进行电泳分析，在1.5% 琼脂糖凝胶上分离，轻链（κ 轻链）的长度在320-340bp之间，重链的长度在340-370bp之间，有该区域特异产物时切胶回收，克隆至T载体或表达载体测序。

实施例5. 组织芯片染色和鉴定

一.  芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作空白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡（熔点在56～58 ℃）倒入模具，冷却至室温后将模具放入- 20 ℃冰箱6 min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1mm直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3～4 mm，用另一直径1mm的打孔针在蜡块的标记部位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0.1mm左右。将采集到的组织芯直接插入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入60 ℃烤箱内1 h , 使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30 min，再放入-20 ℃ 冰箱冷冻6 min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4 ℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂在凉水中, 让其自然展开，再将分开的切片转移到45 ℃的温水中展片30秒，用经2 % APES 丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60 ℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入- 4℃ 冰箱保存。

二．            IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3%H₂O₂孵育10分钟 ，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加封闭液（动物非免疫血清）室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗（首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例）室温（25℃）孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育20-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。 苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85%（3分钟）-95%（3分钟）-100%（3分钟）-100%（3分钟）的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

三．数据统计

根据各抗体在样本点的着色情况，统计各指标的着色率（着色样本数/样本总数），见表1。

表1  p63同p63（4A4）在前列腺癌和乳腺癌上的表达差异比较

            SEQUENCE LISTING

 

<110>  福州迈新生物技术开发有限公司

 

<120>  一株肿瘤抑制基因p63单克隆抗体及其应用

 

<130>  5

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  614

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atgaattttg aaacttcacg gtgtgccacc ctacagtact gccctgaccc ttacatccag     60

 

cgtttcgtag aaaccccagc tcatttctct tggaaagaaa gttattaccg atccaccatg    120

 

tcccagagca cacagacaaa tgaattcctc agtccagagg ttttccagca tatctgggat    180

 

tttctggaac agcctatatg ttcagttcag cccattgact tgaactttgt ggatgaacca    240

 

tcagaagatg gtgcgacaaa caagattgag attagcatgg actgtatccg catgcaggac    300

 

tcggacctga gtgaccccat gtggccacag tacacgaacc tggggctcct gaacagcatg    360

 

gaccagcaga ttcagaacgg ctcctcgtcc accagtccct ataacacaga ccacgcgcag    420

 

aacagcgtca cggcgccctc gccctacgca cagcccagct ccaccttcga tgctctctct    480

 

ccatcacccg ccatcccctc caacaccgac tacccaggcc cgcacagttt cgacgtgtcc    540

 

ttccagcagt cgagcaccgc caagtcggcc acctggacgt attccactga actgaagaaa    600

 

ctctactgcc aaat                                                      614

 

 

<210>  2

<211>  336

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

caggtccaac tgcaggagtc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg     60

 

tcctgcaagg cttctggctt caccttcagc agctcccata tttactgggt gaagcagagg    120

 

cctggacaag gccttgagtg gattgggggg attaatcata gcaatgctgg tattaacttc    180

 

actgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgtagaca agtcctccag cacagcctac    240

 

atgcaagtca gcagcctgac atctgaagac tctgcggtct attactgcaa acaagtatct    300

 

tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgca                              336

 

 

<210>  3

<211>  342

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gatatcgtga taacccagga tgaactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcacgcctcc     60

 

atctcttgca gatctagtca gagccttgta ttcagtgatg gaaacacata tttacattgg    120

 

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acatagtttt caaccgattt    180

 

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac acacaagatc    240

 

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgtt ctcagagtac acatgttact    300

 

gcgtacacat tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gg                       342

 

 

<210>  4

<211>  112

<212>  PRT

<213>  氨基酸序列

 

<400>  4

 

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser

            20                  25                  30         

 

 

His Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45             

 

 

Gly Gly Ile Asn His Ser Asn Ala Gly Ile Asn Phe Thr Glu Lys Phe

    50                  55                  60                 

 

 

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80 

 

 

Met Gln Val Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95     

 

 

Lys Gln Val Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

            100                 105                 110        

 

 

<210>  5

<211>  114

<212>  PRT

<213>  氨基酸序列

 

<400>  5

 

Asp Ile Val Ile Thr Gln Asp Glu Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Asp His Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Phe Ser

            20                  25                  30          

 

 

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

        35                  40                  45             

 

 

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ile Val Phe Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60                  

 

 

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr His Lys Ile

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

                85                  90                  95     

 

 

Thr His Val Thr Ala Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

            100                 105                 110        

 

 

Lys Arg