第四代HIV抗体抗原检测试纸及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种第四代HIV抗体抗原检测试纸及其制备方法和应用，包括：吸水滤纸、硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫和反应支持物；在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸。因此，本发明所提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸具有使用方便、操作简单、便于推广、能够在一个检测试纸上同时区分P24抗原阳性结果和HIV抗体阳性结果的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种第四代HIV抗体抗原检测试纸及 其制备方法和应用。

背景技术

HIV(Human Immunodeficiency Virus，人体免疫缺损病毒)传播的广泛性 和危害性已成为全球关注的社会热点问题。因此，提高HIV诊断水平具有重要 现实意义。

从1985年第1代HIV抗体检测试剂问世到现在，HIV血清学检测试剂已 经发展到了第4代。第4代ELISA试剂的优点在于能同时检测抗原和抗体，由 于加入抗原的检测可将窗口期缩短7～9天，在对HIV早期诊断的效果上明显优 于第3代。

目前国内已有部分厂家研制得到了第四代检测试剂盒，主要采用的是化学 发光法和酶联免疫法，但该种检测方法需要借助实验仪器才能完成，从而不方 便用户使用；而且检测效果受操作人员熟练度的影响较大，从而限制了普通用 户的使用。

发明内容

针对现有技术存在的上述缺陷，本发明提供一种第四代HIV抗体抗原检测 试纸，具有使用方便、操作简单、便于推广的优点。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种第四代HIV抗体抗原检测试纸，包括：吸水滤纸、硝酸纤维 素膜、胶体金垫、样品垫和反应支持物；在所述反应支持物外表面上依次相互 搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸；

并且，所述硝酸纤维素膜上自靠近所述样品垫一侧依次设置有第一条带T1、 第二条带T2和质控条带C；所述第一条带T1包被P24抗原单克隆抗体，所述第二 条带T2包被GP36、GP41和GP120抗原，所述质控条带C包被羊抗鼠IgG多克隆抗 体；所述胶体金垫含有胶体金标记的P24抗原单克隆抗体和胶体金标记的GP36、 GP41、GP120抗原混合标记物。

本发明还提供一种制备上述的第四代HIV抗体抗原检测试纸的方法，包括以 下步骤：

(1)分别制备纯度和浓度均符合要求的P24抗原单克隆抗体、GP36抗原、 GP41抗原和GP120抗原；

(2)硝酸纤维素膜的制备：将步骤(1)制得的P24抗原单克隆抗体用0.02 mol/L pH＝7.2的PBS稀释成1.0mg/ml，用喷膜机以1.0μl/cm的速度喷于硝酸纤维 素膜上，形成第一条带T1；将步骤(1)制得的GP36抗原、GP41抗原和GP120 抗原分别用0.02mol/L pH＝7.2的PBS稀释成0.3mg/ml、0.6mg/ml和0.4mg/ml， 用喷膜机以1.0μl/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成第二条带T2；将羊抗鼠IgG 多克隆抗体用0.02mol/LpH＝7.2的PBS稀释成1.0mg/ml，用喷膜机以1.0μl/cm的 速度喷于硝酸纤维素膜上，形成质控条带C；

(3)胶体金垫的制备：采用最佳标记pH值为7.4至8.0、最佳标记浓度为15 至18μg/ml的标记条件制得胶体金标记的P24抗原单克隆抗体；分别采用最佳标 记pH值为7.4至8.0、最佳标记浓度为10至12μg/ml的标记条件制得胶体金标记的 GP36、GP41和GP120抗原；将本步骤上述得到的胶体金标记的P24抗原单克隆抗 体、胶体金标记的GP36、GP41和GP120抗原进行纯化后，喷涂到胶体金垫上， 干燥备用；

(4)第四代HIV抗体抗原检测试纸的制备：在所述反应支持物外表面上依次 相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸。

优选的，所述制备纯度和浓度均符合要求的P24抗原单克隆抗体的制备方法 为：

采用动物体内生产单抗的方法获得P24抗原单克隆抗体腹水，将获得的P24抗 原单克隆抗体腹水使用辛酸-饱和硫酸铵沉淀，得到蛋白浓度高于2.0mg/ml、纯 度大于90％的P24抗原单克隆抗体。

优选的，所述GP36抗原、GP41抗原或GP120抗原的制备方法为：

将含有GP36、GP41或GP120抗原的细菌培养液用辛酸-饱和硫酸铵沉淀后， 再用离子层析柱层析纯化，得到浓度高于2.0mg/ml，纯度大于90％的GP36、GP41 或GP120抗原。

本发明还提供了第四代HIV抗体抗原检测试纸在检测HIV中的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明提供一种第四代HIV抗体抗原检测试纸，不仅具有使用方便、操作 简单、便于推广的优点，而且能够在一个检测试纸上同时区分P24抗原阳性结 果和HIV抗体阳性结果，通过区分抗体和抗原检测，达到了区分感染阶段的目 的，为患者提供更多的信息。

附图说明

图1为本发明实施例提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的正面示意图；

图2为本发明实施例提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的侧面示意图；

图3为本发明提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的检测结果阳性示意图；

图4为本发明提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的检测结果阴性示意图；

图5为本发明提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的检测结果无效示意图。

其中：1-吸水滤纸；

2-硝酸纤维素膜；

3-胶体金垫；

4-样品垫；

5-反应支持物。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施方式进行详细说明。

实施例1：第四代HIV抗体抗原检测试纸(参见图1和图2)

(1)P24抗原单克隆抗体的制备

采用通用的动物体内生产单抗的方法获得P24抗原单克隆抗体腹水，然后 对该P24抗原单克隆抗体腹水进行纯化，具体的纯化方法为：将含有P24抗原 单克隆抗体的腹水使用辛酸-饱和硫酸铵沉淀后，使用紫外分光法测定蛋白浓度、 使用SDS-PAGE测定纯度，所得P24抗原单克隆抗体的蛋白浓度高于2.0mg/ml， 纯度大于90％为合格。

(2)GP36、GP41和GP120抗原的制备

将含有GP36、GP41或GP120抗原的细菌培养液用辛酸-饱和硫酸铵沉淀后， 再用离子层析柱层析纯化，并使用紫外分光光度法测定蛋白浓度、使用 SDS-PAGE测定纯度，所得抗原以浓度高于2.0mg/ml，纯度大于90％为合格。

(3)硝酸纤维素膜上第一条带T1包被P24抗原单克隆抗体的方法：

经实验确定，最佳包被条件为：包被缓冲液为0.02mol/L pH＝7.2的PBS， 包被浓度为1.0mg/ml，喷量选择为1.0μl/cm。即：将P24抗原单克隆抗体用0.02 mol/L pH＝7.2的PBS稀释成1.0mg/ml，用喷膜机以1.0μl/cm的速度喷于硝酸纤 维素膜上，形成第一条带T1。

(4)硝酸纤维素膜上质控条带C包被羊抗鼠IgG多克隆抗体的方法：

经实验确定，最佳包被条件为：包被缓冲液为0.02mol/L pH＝7.2的PBS， 包被浓度为1.0mg/ml，喷量选择为1.0μl/cm。

(5)硝酸纤维素膜上第二条带T2包被GP36、GP41和GP120抗原的方法：

经实验确定，最佳包被条件为：包被缓冲液为0.02mol/L pH＝7.2的PBS， 包被浓度为：GP36为0.3mg/ml、GP41为0.6mg/ml、GP120为0.4mg/ml，喷量 选择为1.0μl/cm。

(6)胶体金的制备与鉴定：

使用柠檬酸三钠还原法还原氯金酸制备胶体金颗粒，使用紫外分光光度计 扫描460～600nm区间的光吸收值，在520至530nm区间有最大吸收峰，且吸收 值大于2.0为合格，对应胶体金颗粒直径大约为30～40nm。

(7)胶体金标记P24抗原单克隆抗体的方法：

P24抗原单克隆抗体最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定：使用胶体金梯 度pH值平行标记该抗体，选择变色边缘的标记pH值，然后将该pH值加上0.5 作为P24抗原单克隆抗体进行标记的最佳pH值，大约为7.4至8.0；在该最佳 pH值条件下，设定蛋白梯度进行标记，在胶体金中加入P24抗原单克隆抗体后 混匀，放置20分钟以上，按每毫升胶体金加入100μl的比例加入10％的NaCl， 混匀，观察颜色，选定加入P24抗原单克隆抗体浓度最低且颜色不发生变化的 标记量再额外附加10％值作为最佳标记量，大约为15至18μg/ml。

(8)胶体金分别标记GP36、GP41和GP120抗原的方法：

GP36抗原最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定：使用胶体金梯度pH值 平行标记该抗原，选择变色边缘的标记pH值，然后将该pH值加上0.5作为该 GP36抗原进行标记的最佳pH值，大约为7.4至8.0；在该最佳pH值条件下， 设定蛋白梯度进行标记，在胶体金中加入GP36抗原后混匀，放置20分钟以上， 按每毫升胶体金加入100μl的比例加入10％的NaCl，混匀，观察颜色，选定加 入GP36抗原浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10％值作为最佳 的标记量，大约为10至12μg/ml。

GP41抗原最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定：使用胶体金梯度pH值 平行标记该抗原，选择变色边缘的标记pH值，然后将该pH值加上0.5作为该 GP41抗原进行标记的最佳pH值，大约为7.4至8.0；在该最佳pH值条件下， 设定蛋白梯度进行标记，在胶体金中加入GP41抗原后混匀，放置20分钟以上， 按每毫升胶体金加入100μl的比例加入10％的NaCl，混匀，观察颜色，选定加 入抗原浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10％值作为最佳的标记 量，大约为10至12μg/ml。

GP120抗原最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定：使用胶体金梯度pH值 平行标记该抗原，选择变色边缘的标记pH值，然后将该pH值加上0.5作为该 GP120抗原进行标记的最佳pH值，大约为7.4至8.0；在该最佳pH值条件下， 设定蛋白梯度进行标记，在胶体金中加入GP120抗原后混匀，放置20分钟以上， 按每毫升胶体金加入100μl的比例加入10％的NaCl，混匀，观察颜色，选定加 入GP120抗原浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10％值作为最佳 的标记量，大约为10至12μg/ml。

(9)对上述(7)(8)中所得到的四种胶体金标记溶液进行纯化的方法：

将标记好的胶体金溶液，加入BSA和PEG20000至终浓度均为0.2％，混匀， 放置15分钟以上，使用高速冷冻离心机12000rpm离心15分钟以上，弃去上清， 将沉淀使用胶体金保存液复溶，体积为原标记胶体金体积的1/10。复溶比例的 调试：使用胶体金工作液稀释标记胶体金浓缩液进行稀释，稀释比例为10至20 倍，喷涂到胶体金垫上进行干燥，最后根据与包被硝酸纤维素膜配对的检测结 果确定最佳的稀释比例，一般选择15倍左右。

(10)第四代HIV抗体抗原检测试纸的制备：在所述反应支持物外表面上依 次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤 纸。具体的，搭接粘帖可以为以下方式：包被好的硝酸纤维素膜2粘贴在反应 支持物5上，其条带T1、T2线方向硝酸纤维素膜的边缘距离反应支持物5边缘 28.0mm(具体数值会根据反应支持物5的尺寸发生变化)，条带C线方向硝酸纤 维素膜的边缘距离反应支持物5的边缘32.0mm(具体数值会根据反应支持物5 的尺寸发生变化)；条带C线方向的反应支持物5上粘贴有吸水滤纸1，压住硝 酸纤维素膜1mm到2mm；条带T线方向的反应支持物5上首先粘贴4mm到8mm(根 据实际生产活性的差异而变化)的胶体金垫3，压住硝酸纤维素膜条带T线的边 缘1mm到2mm；在此方向上继续粘贴样品垫4，压住胶体金垫2mm到4mm(依赖 于胶体金垫3的宽度)。

实施例2：检测方法(参见图3、4、5)

将待检标本(全血、血清或者血浆)60至100μl直接加入实施例1所得的 检测试纸中的样品垫4处(全血样本需要额外加入一些稀释液)，样品将沿着反 应支持物5的各个附着物向吸水滤纸方向移动，20分钟内读取实验结果。

结果：

参照图3，如果样本中含有P24抗原，则与检测试纸上的胶体金标记的P24 抗原的单克隆抗体特异性结合形成复合物，沿着膜区继续上行则与包被在硝酸 纤维素膜2上的另一个P24抗原单克隆抗体发生特异性结合，在条带T1处出现 红色或者粉红色；如果样本中含有HIV抗体，则与检测试纸上的胶体金标记的 GP36、GP41、GP120抗原的单克隆抗体特异性结合形成复合物，沿着膜区继续 上行则与包被在硝酸纤维素膜2上的另一个GP36、GP41、GP120抗原单克隆抗 体发生特异性结合，在条带T2处出现红色条带，如果同时含有以上两种待检物 则在两条线上同时显示红色条带。

参照图4，如果样本中没有P24抗原也没有HIV的抗体，就不能形成上述 复合物，条带T1和T2处也就不能出线红色或粉红色，为阴性。

参照图5，无论样本中是否含有P24抗原或者HIV抗体，胶体金标记的单 克隆抗体都会继续上行至包被膜的条带C，去此处包被的羊抗鼠IgG结合形成 红色或者粉红色条带，即为质控线，如果在检测中此条带不出现，则证明胶体 金失效或者操作有失误，结果无效，需要重新检测。

综上所述，通过使用本发明所提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸，不仅 具有使用方便、操作简单、便于推广的优点，而且能够在一个检测试纸上同时 区分P24抗原阳性结果和HIV抗体阳性结果，通过区分抗体和抗原检测，达到 了区分感染阶段的目的，为患者提供更多的信息。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例和 附图所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改， 都落入本发明保护的范围。