高效液相色谱法中分离蚕豆中左旋多巴的流动相

摘要

本发明公开了一种高效液相色谱法中分离蚕豆中左旋多巴的流动相，其组成成分体积百分比为：0.1%甲酸69%-97%，乙腈2%-30%，0.1mol/L醋酸1%-10%。利用醋酸替换磷酸盐缓冲液，可以避免沉淀的产生，减少对泵系统造成损害。上述的流动相经长期使用，对高效液相色谱仪的泵系统未有任何损害。所述的甲酸在任意比例的乙腈-甲酸-水中能以任意比例完全互溶，不产生任何沉淀，不会对泵系统造成损害，常年使用情况良好，用于等度洗脱时，操作简单、省时、重现性好、容易重复。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物中左旋多巴成分含量的测定方法，尤其涉及一种高效液相色谱法中分离蚕豆中左旋多巴的流动相。

背景技术

左旋多巴(Levodopa，L-DOPA)，即3，4-二羟基苯丙氨酸，是生物体内儿茶酚胺类激素、神经递质(如去甲肾上腺素、多巴胺)和黑色素的代谢前体，主要用于治疗帕金森病(Parkinson s disease)，因此测定该药物制剂和生物样品中左旋多巴的含量具有重要意义。近年来左旋多巴的体内外分析方法都取得了很大进展，紫外分光光度法、高效液相色谱法在左旋多巴的体内外分析中应用最广，流动注射自动分析方法和毛细管电泳法等也有广泛应用，可见-紫外分光光度检测器、荧光检测器、电化学检测器、化学发光检测、蒸发光散射检测器等新型检测器都有报道。

L-DOPA的芳香环和羧基结构决定了该分子具有一定的紫外吸收，因此分光光度法和液相色谱法是可供选择的定量方法。它的儿茶酚结构可以发生氧化还原反应，为电化学检测、衍生化检测和比色法奠定了基础。

中国药典规定，L-DOPA原料采用非水滴定法，片剂采用紫外分光光度法测定含量，如Nagaraja等用紫外分光光度法测定制剂中儿茶酚胺衍生物多巴胺、左旋多巴、甲基多巴和肾上腺素的含量。该方法稳定，具有良好的灵敏度和准确性，简便快速，不需复杂的设备。对于单方制剂，在没有辅料干扰的情况下，这是可行的；但生物样品与药物制剂相比，药物浓度更低，样品成分更复杂，因此在测定生物样品中左旋多巴浓度时，需采用高灵敏度、高分辨率的方法。HPLC（高效液相色谱）法和毛细管电泳法成为较为理想的分析方法，其中以RPHPLC-ED（反相高效液相色谱）最为常用。

HPLC法灵敏度高，操作简便、快速、准确，易于定量分析,与紫外分光光度法、薄层扫描法测定的准确性和重现性均有所提高。HPLC法具有良好的分离性能，广泛应用于食品、保健品和药品的分析工作中，并以C8、C18反相柱居多，现已成为药物分析的经典方法。Tait、Wood、陆兴毅等均采用高效液相色谱(HPLC)法测定制剂中L-DOPA的含量，但在流动相的选择和检测器的选用上则各有不同。除了制剂分析以外，也常见采用HPLC法测定植物资源中左旋多巴含量的报道。如赵永成以甲醇0.01mol/L KH₂PO₄缓冲液(25:75，pH3.0)为流动相，并应用紫外检测器，在280 nm波长处测定了狗爪豆中左旋多巴的含量；黄海滨等以流动相为甲醇：0.1mol/L醋酸溶液(25:75，v/v)测定藜豆中左旋多巴的含量。结果均表明，这些方法准确度高，线性关系好，重现性好。巫世红等以流动相为0.1 mol/L 冰醋酸溶液:甲醇(95:5) 测定不同采收时期猫豆中左旋多巴的含量, 在此条件下，左旋多巴能达到理想的分离效果，保留时间为4.6min。

以上所述的三种流动相测定蚕豆中左旋多巴含量的结果表明，左旋多巴的出峰时间不稳定、分离度低。可能是由于蚕豆中组分复杂，干扰成分多。因此建立一种高效液相色谱法有效分离蚕豆中左旋多巴的流动相，解决现有流动相组成对蚕豆中左旋多巴分离效果不理想的问题十分必要。

随着紫外检查器的发展，在280nm处有强烈吸收的一些试剂也可以进行利用，本发明结合高效液相色谱（HPLC）发现多种酸可以代替磷酸/盐酸等添加剂应用到左旋多巴的检测，而且与仪器的兼容性非常好。高效液相色谱仪对流动相的吸收波长要求不高，但有腐蚀沉淀作用的流动相对高效液相色谱仪的部件会产生损害作用，如现有流动相中磷酸盐缓冲液易产生沉淀，造成柱赛杆和密封圈摩擦，损害泵系统。

发明内容

本发明提供一种从蚕豆中分离左旋多巴效果好的高效液相色谱法中分离蚕豆中左旋多巴的流动相。

本发明采用以下技术方案，高效液相色谱法中分离蚕豆中左旋多巴的流动相，其组成成分体积百分比为：0.1%甲酸69%-97%，乙腈2%-30%，0.1 mol/L醋酸1%-10%。

所述的流动相组成成分体积百分比为：0.1%甲酸90%-97%，乙腈2%-9%，0.1 mol/L醋酸1%-6%。

所述的流动相优选组成成分体积百分比为：0.1%甲酸95%，乙腈5%。

本发明采用以上技术方案，利用醋酸替换磷酸盐缓冲液，可以避免沉淀的产生，减少对泵系统造成损害，只需在流动相中加入一定比例的水以提高流动相的PH值。上述的流动相经长期使用，对高效液相色谱仪的泵系统未有任何损害。所述的甲酸在任意比例的乙腈-甲酸-水中能以任意比例完全互溶，不产生任何沉淀，不会对泵系统造成损害，常年使用情况良好，用于等度洗脱时，操作简单、省时、重现性好、容易重复。该流动相具有以下优点：

A.L-DOPA在甲酸中经紫外检测(280nm)有最大吸收且吸收值较稳定，不受甲酸浓度的影响。

B.从试剂应用角度讲，本发明流动相的应用基本不受任何限制。

C.使用本发明流动相检测得到的基线稳定，易于定量分析。

D.采用该流动相与梯度方法相比，使用单泵即可实现分离检测；而梯度方法需要多泵或者多元混合器才能实现。

E. 采用该流动相，除了可以对左旋多巴进行有效分离，还能分离出其他流动相无法分离的未知物质。

F.本发明流动相中存在一定比例的水，可提高流动相的PH值，减少有机酸对色谱柱造成的损害。

附图说明

现结合附图对本发明做进一步详述：

图1是采用本发明实施例1流动相对左旋多巴标准品进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图；

图2是采用本发明实施例1流动相对蚕豆花中萃取的左旋多巴进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图；

图3是采用本发明实施例2流动相对左旋多巴标准品进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图；

图4是采用本发明实施例2流动相对蚕豆花中萃取的左旋多巴进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图；

图5是采用本发明实施例3流动相对左旋多巴标准品进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图；

图6是采用本发明实施例3流动相对蚕豆花中萃取的左旋多巴进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图；

图7是采用本发明实施例4流动相对左旋多巴标准品进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图；

图8是采用本发明实施例4流动相对蚕豆花中萃取的左旋多巴进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图；

图9是采用本发明实施例5流动相对左旋多巴标准品进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图；

图10是采用本发明实施例5流动相对蚕豆花中萃取的左旋多巴进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图；

图11是采用本发明实施例6流动相对左旋多巴标准品进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图；

图12是采用本发明实施例6流动相对蚕豆花中萃取的左旋多巴进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图。

具体实施方式

本发明流动相可以采用组成成分体积百分比为：0.1%甲酸69%-97%，乙腈2%-30%，0.1 mol/L醋酸1%-10%。

所述的流动相也可以采用组成成分体积百分比为：0.1%甲酸90%-97%，乙腈2%-9%，0.1 mol/L醋酸1%-6%。

所述的流动相优选的组成成分体积百分比为：0.1%甲酸95%，乙腈5%。

实施例1，如图1或2所示，采用流动相组成成分体积百分比为：0.1%甲酸95%，乙腈5%，分别对左旋多巴标准品和蚕豆花中萃取的左旋多巴进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图。色谱柱为资生堂CAPCELL PAK CR色谱柱(150 mm×4.6 mm，5μm)；流动相流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL，色谱图中横坐标是左旋多巴标准品和蚕豆花中萃取的左旋多巴通过色谱柱的保留时间，时间以分钟为单位，纵坐标是左旋多巴标准品和蚕豆花中萃取的左旋多巴通过色谱柱响应值电压，该电压响应值以伏为单位（以下实施例采用色谱柱条件同本实施例）。图1所示色谱图，该流动相可将左旋多巴完全基线分离，其峰值4.915的峰面积与质量间呈良好的线性相关性，而且基线稳定。图2所示色谱图，该流动相可将左旋多巴完全基线分离和一些未知物完全基线分离，其峰值4.762的峰面积与质量间呈良好的线性相关性，而且基线稳定。

实施例2，如图3或4所示，采用流动相组成成分体积百分比为：0.1%甲酸90%，乙腈9%，0.1 mol/L醋酸1%，分别对左旋多巴标准品和蚕豆花中萃取的左旋多巴进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图，图1所示色谱图，该流动相可将左旋多巴完全基线分离，其峰值4.465的峰面积与质量间呈良好的线性相关性，但基线漂移比较明显。图2所示色谱图，该流动相可将左旋多巴完全基线分离和一些未知物完全基线分离，其峰值4.490的峰面积与质量间呈良好的线性相关性，但基线漂移比较明显。

实施例3，如图5或6所示，采用流动相组成成分体积百分比为：0.1%甲酸97%，乙腈2%，0.1 mol/L醋酸1%，分别对左旋多巴标准品和蚕豆花中萃取的左旋多巴进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图，该流动相对左旋多巴标准品和蚕豆花样品左旋多巴分离较好，保留时间达到6分钟多，但两者基线漂移明显。

实施例4，如图7或8所示，采用流动相组成成分体积百分比为：0.1%甲酸90%，乙腈4%，0.1 mol/L醋酸6%，分别对左旋多巴标准品和蚕豆花中萃取的左旋多巴进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图，该流动相对标准品和蚕豆花样品左旋多巴分离良好，基线较稳定。

实施例5，如图9或10所示，采用流动相组成成分体积百分比为：0.1%甲酸69%，乙腈30%，0.1 mol/L醋酸1%，分别对左旋多巴标准品和蚕豆花中萃取的左旋多巴进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图，该流动相对标准品和蚕豆花样品的左旋多巴分离较好，但两者基线漂移较大。

实施例6，如图11或12所示，采用流动相组成成分体积百分比为：0.1%甲酸70%，乙腈20%，0.1 mol/L醋酸10%，分别对左旋多巴标准品和蚕豆花中萃取的左旋多巴进行分离检测所得的HPLC-UV色谱图，该流动相对标准品和蚕豆花样品的左旋多巴均可以较好的分离，但蚕豆花样品的左旋多巴基线明显漂移。

综上所述，采用本发明以上流动相分别对左旋多巴标准品和蚕豆花中萃取的左旋多巴进行分离，可将左旋多巴完全基线分离，易于定量分析。